전국 각지에서 수집된 발표식품으로부터 젖산균을 분리하고 유해균인 B. cereus, L. monocytogenes, S. Typhimurium, S. aureus 및 S. epidermidis 균주에 대하여 생육 억제효능이 강한 L2167 균주를 선발하고, 16S rDNA 분석법을 이용하여 L. plantarum로 동정하였다. L2167 균주의 단백질 분획물을 제작하여 S. aureus 등 5종의 유해균 배양액에 첨가한 후, 전자현미경으로 관찰하였다. L. plantarum L2167 균주의 균체 단백질 분획물은 유해균의 생육을 억제하였으며, 생육 억제활성은 균체 내부에 함유된 단백질이 유해균의 세포막을 파괴하는 것에서 기인하는 것으로 추정되었다. L. plantarum L2167은 pH 5.5로 조절한 MRS 배지에서 35℃로 배양하였을 때, 가장 우수한 비성장속도를 나타냈으며, 대조구로 사용된 L. plantarum KCTC21004보다 NaCl에 대하여 민감한 특징을 나타내었다. 본 연구를 통하여 선발한 L. plantarum L2167 균주는 추가연구를 통하여 유해균의 생육을 효율적으로 억제할 수 있는 스타터 균주로서 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
전국 각지에서 수집된 발표식품으로부터 젖산균을 분리하고 유해균인 B. cereus, L. monocytogenes, S. Typhimurium, S. aureus 및 S. epidermidis 균주에 대하여 생육 억제효능이 강한 L2167 균주를 선발하고, 16S rDNA 분석법을 이용하여 L. plantarum로 동정하였다. L2167 균주의 단백질 분획물을 제작하여 S. aureus 등 5종의 유해균 배양액에 첨가한 후, 전자현미경으로 관찰하였다. L. plantarum L2167 균주의 균체 단백질 분획물은 유해균의 생육을 억제하였으며, 생육 억제활성은 균체 내부에 함유된 단백질이 유해균의 세포막을 파괴하는 것에서 기인하는 것으로 추정되었다. L. plantarum L2167은 pH 5.5로 조절한 MRS 배지에서 35℃로 배양하였을 때, 가장 우수한 비성장속도를 나타냈으며, 대조구로 사용된 L. plantarum KCTC21004보다 NaCl에 대하여 민감한 특징을 나타내었다. 본 연구를 통하여 선발한 L. plantarum L2167 균주는 추가연구를 통하여 유해균의 생육을 효율적으로 억제할 수 있는 스타터 균주로서 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
Strains of lactic acid bacteria were isolated from a variety of fermented foods collected in Korea. The strain L2167 showed a strong antipathogenic activity against Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, and Staphylococcus epidermidis. L2167 was ident...
Strains of lactic acid bacteria were isolated from a variety of fermented foods collected in Korea. The strain L2167 showed a strong antipathogenic activity against Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, and Staphylococcus epidermidis. L2167 was identified as Lactobacillus plantarum by sequence analysis of its 16S rRNA gene. Scanning electron microscopy revealed rough and wrinkled morphology of B. cereus, L. monocytogenes, S. Typhimurium, S. aureus, and S. epidermidis cell membranes after treatment with a crude cell extract of L. plantarum L2167, indicating that Lactobacillus plantarum L2167 might destroy the cell membrane of pathogenic bacteria. The optimal temperature and initial medium pH for Lactobacillus plantarum L2167 growth were 35℃ and 5.5, respectively. Lactobacillus plantarum L2167 was more sensitive to NaCl than Lactobacillus plantarum KCTC21004, used as a control strain. Lactobacillus plantarum L2167 is expected to be developed as a prominent starter strain for efficient inhibition of growth of pathogens.
Strains of lactic acid bacteria were isolated from a variety of fermented foods collected in Korea. The strain L2167 showed a strong antipathogenic activity against Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, and Staphylococcus epidermidis. L2167 was identified as Lactobacillus plantarum by sequence analysis of its 16S rRNA gene. Scanning electron microscopy revealed rough and wrinkled morphology of B. cereus, L. monocytogenes, S. Typhimurium, S. aureus, and S. epidermidis cell membranes after treatment with a crude cell extract of L. plantarum L2167, indicating that Lactobacillus plantarum L2167 might destroy the cell membrane of pathogenic bacteria. The optimal temperature and initial medium pH for Lactobacillus plantarum L2167 growth were 35℃ and 5.5, respectively. Lactobacillus plantarum L2167 was more sensitive to NaCl than Lactobacillus plantarum KCTC21004, used as a control strain. Lactobacillus plantarum L2167 is expected to be developed as a prominent starter strain for efficient inhibition of growth of pathogens.
본 연구에서는 전통발효식품에 존재하는 젖산균을 분리하고 유해 균주에 대한 생육 억제활성이 우수한 균주를 선발하여 향후 전통 발효식품의 생산에 적용할 수 있는 스타터 균주로서의 기초자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
가장 넓은 생육억제환(136 ± 10 mm)을 나타낸 뽕잎 장아찌로부터 분리된 관리번호180번 균주를 선발하여 식중독을 유발시키는 균주인 S. Typhimurium을 포함한 유해 균주 4종에 대한 생육 억제활성을 평가하였다.
유해균은 TSB 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각각의 유해균 배양액에 L. plantarum L2167 균주로부터 확보한 단백질 분획물의 동결건조물을 50 mg/ml의 최종 농도로 첨가하고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양한 후 주사전자현미경(Hitachi S-4800, Hitachi High-Technologies Corp., Japan)를 이용하여 유해균의 세포 형태를 관찰하였다.
L. plantarum L2167 균주의 배양액, 균체 및 균체가 제거된 상등액으로부터 단백질 분획물을 확보하고 각각의 유해균에 처리한 후 유해균의 세포 형태를 관찰하였다(Fig. 3).
L. plantarum L2167 균주의 생육 특성을 조사하기 위하여 배양 온도, 배지의 초기 pH 및 NaCl 첨가 농도에 따른 비성장속도를 측정하였다(Fig. 4).
5, 7, 9로 조정하고 L. plantarum 균주의 비성장속도를 측정하였다. L.
분리한 젖산균은 MRS 배지를 사용하여 30℃에서 24시간 배양한 후 GenExTM genomic Sx (Geneall, Korea)를 사용하여 염색체 DNA를 추출하였다. 균주 동정을 위하여 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT3') 프라이머[33]를 사용하여 16S rDNA 유전자의 단편을 증폭하였다. 염색체 DNA (10 ng)을 주형으로 사용하여 Pfu Plus PCR PreMix (EBT-1405, Elpis, Korea)와 멸균 증류수를 혼합한 반응액의 최종 부피를 50 µl로 제조하여 94℃에서 5분간 반응시키고 94℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 30번 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다.
배양 온도에 따른 젖산균의 비성장속도를 측정하기 위하여 전배양한 젖산균을 MRS배지에 초기 세포 흡광도가 0.1이 되도록 접종한 후 25, 30, 35, 40℃에서 배양하면서 비성장속도를 측정하였다. HCl (2 N) 또는 NaOH (2 N)를 사용하여 MRS 배지의 초기 pH를 각각 4, 5.
대상 데이터
epidermidis KCCM35494 및 L. plantarum KCTC21004 균주는 한국미생물자원센터(Korean Culture Type Collection, KCTC, Korea)와 한국미생물보존센터(Korean Culture Center for Microorganisms, KCCM, Korea) 및 미국미생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC, USA)로부터 각각 분양 받아 사용하였다. 유해균주는 Tryptic Soy Agar (TSA, BD) 또는 Tryptic Soy Broth (TSB, BD) 배지를 사용하여 30℃에서 배양하였다.
본 연구에 사용된 발효식품은 강원도를 포함한 전국 각 지역에서 제조 또는 판매되고 있는 34점(막걸리 8점, 장류 6점, 김치 8점, 장아찌 9점, 식초 3점)을 수집하여 사용하였다. 수집한 발효식품으로부터 젖산균을 분리하기 위하여 시료 1 g을 펩톤수(Buffered Peptone Water, Biomérieux, France) 5 ml에 현탁한 후 3분간 교반하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복 수행하였으며 측정값은 SPSS(v 20.0, SPSS, IL, USA)를 사용하여 통계처리 하였고 유의성 검증은 일원배치 분산 분석법[35]을 이용하였다.
이론/모형
젖산균에 의한 유해균의 세포막 변형 또는 파쇄를 확인하기 위하여 MRS 배지를 대조구로 Wong 등[34]의 방법을 사용하여 단백질 분획물을 확보하였다. L.
젖산균의 유해균에 대한 증식 억제활성은 종이 디스크법[20]을 이용하여 측정하였다. 각각의 유해균을 5 ml의 TSB 배지에 접종하여 24시간 배양한 후 원심분리(8,000 × g, 5분)하여 회수한 균체를 멸균증류수로 2회 세척한 후 5 ml의 TSB 배지에 초기 세포흡광도(OD600)가 0.
5%, w/v) gel을 사용하는 전기영동장치를 이용하여 증폭산물을 확인한 후 염기서열을 해독하였다. 해독한 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 BLAST 프로그램을 이용하여 기존에 보고된 균주의 16S rDNA 유전자 단편과의 상동성을 근거로 동정하였다[7].
성능/효과
plantarum L2167 균주와 대조구 균주의 비성장속도를 비교하였다. NaCl 첨가량이 증가할수록 대조구와 실험구 균주의 비성장속도는 느려졌으며(Fig. 4C), 대조구와 실험구 균주는 1M의 NaCl을 첨가하였을 때, NaCl을 함유하지 않은 배지에서의 비성장속도와 비교하여 각각 70%, 74% 감소하였다.
aureus 균주의 생육을 억제하지 않았으며, B. cereus 균주에 대한 생육 억제 활성을 나타냈으나, L2167 균주와 비교하여 억제효과가 미미한 수준이었다(Fig. 2E).
aureus 및 S. epidermidis 등의 유해균에 대한 생육 억제 활성을 동시에 나타냈으며, 균체 내부에 존재하는 단백질이 유해균의 세포막을 손상시키는 것으로 나타났다. 본 연구를 통하여 선발된 균주는 향후 추가연구를 통하여 유해균의 생육을 효율적으로 억제하는 유망한 스타터 균주로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
결론적으로 L. plantarum L2167 균주는 pH 5.5로 조절된 배지에서 35℃ 조건으로 배양하였을 때 가장 빠른 비성장속도를 나타냈다.
L. plantarum L2167 균주는 대조구 균주보다 NaCl에 대하여 상대적으로 민감한 것으로 나타나, 현재로서는 염도가 높은 식품의 스타터 균주로 적용하기는 어려울 것으로 판단되었다.
L. plantarum L2167 균주는 초기 pH 5.5에서 가장 빠른 비성장속도를 나타냈다(Fig. 4B).
그러나 35℃에서 L. plantarum L2167 균주의 비성장속도가 (0.87 ± 0.07 1/h)로 대조구 균주의 비성장속도(0.76 ± 0.05 1/h)보다 상대적으로 빠르게 나타났다(Fig. 4A).
plantarum L2167 균주는 식중독 유발균 4점과 각막염 유발균 1점 등 총 5점의 유해균에 대하여 동시에 생육 억제활성을 나타내어 기존에 보고된 L. plantarum 균주보다는 유해균 억제 범위가 보다 광범위하였다. 또한, 유해균에 대한 생육 억제를 유발하는 물질은 L.
plantarum L2167 균주는 기존에 보고된 L. plantarum 균주와 동일한 균주로 동정 되었지만 유해균에 대한 생육 억제활성 및 배양조건에 따른 생육 특성을 조사한 결과 서로 상이한 특성을 보유하고 있는 것으로 판단되었다. L.
KU720560)의 염기서열과 매우 높은 상동성(100%)을 나타내어 L. plantarum으로 최종 동정하였다. L.
plantarum L2167 균주가 대조구 균주보다 빠른 비성장속도를 나타냈다. 결론적으로 L. plantarum L2167 균주는 pH 5.
3). 음성 대조구로 사용한 MRS 배지는 5가지 유해균의 세포 형태에 영향을 미치지 않았으며, L2167 균주의 균체 내부 단백질 분획물(intracellular fraction)을 처리하였을 때, 유해균의 세포 표면이 변형되거나 파쇄된 모습을 확인할 수 있었다. 균체 배양액의 단백질 분획물(total fraction)을 처리한 경우, L.
또한, L2167 균주의 배양액으로부터 균체를 제거한 상등액의 단백질 분획물 (extracellular fraction)은 유해균주의 세포 형태에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 이상의 결과를 바탕으로 L2167 균주의 균체 내부에 존재하는 단백질이 유해균의 세포막을 손상시키는 것으로 추정할 수 있었다. Wong 등[34]은 L.
후속연구
따라서, 본 연구를 통해 확보한 L. plantarum L2167 균주가 생산하는 항균물질에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
또한, 유해균에 대한 생육 억제를 유발하는 물질은 L. plantarum L2167 균체 내부에 존재할 것으로 추정되며 이와 관련하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
plantarum 균주의 개량에 대하여 보고하였다. 따라서 실험실적 진화 기법을 이용하여 L2167 균주의 염에 내한 내성을 증진시킨다면 스타터 균주로서 활용 가능성이 있을 것으로 기대된다.
epidermidis 등의 유해균에 대한 생육 억제 활성을 동시에 나타냈으며, 균체 내부에 존재하는 단백질이 유해균의 세포막을 손상시키는 것으로 나타났다. 본 연구를 통하여 선발된 균주는 향후 추가연구를 통하여 유해균의 생육을 효율적으로 억제하는 유망한 스타터 균주로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
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