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문제 정의
- 본 실험에서는 잘피의 피부에서의 약리 활성 가능성을 다양하게 연구하고자 전체(Zostera marina Whole), 뿌리(Zostera marina Root), 잎줄기(Zostera marina Leaf·stem)로 부위를 나누어 실험을 진행하였다. WST-1 assay를 통해 잘피 부위별 추출물이 세포에 미치는 영향을 평가하였으며, UVB 로 손상을 유도한 human keratinocyte (HaCaT cells) 에서잘피의 세포보호효과를 확인하였다.
- 본 연구는 잘피 추출물의 UVB 조사에 의한 손상 및 LPS 에 의한 염증반응으로부터 세포보호 효능연구와 추출물의 항염효능에 대해 연구하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 잘피 추출물의 항염증 효과를 확인하고자 염증 매개 인자인 COX-2의 단백질 발현양을 Western blot을 통하여 측정하였다. 그 결과 UVB를 처리하지 않은 군에서는 COX-2가 낮게 발현되었고 이와 대조적으로 UVB를 단독으로 처리한 군에서는 COX-2 단백질 발현양이 뚜렷하게 증가하였다.
제안 방법
- assay 방법을 이용하였다. HaCaT celle 96-well plate에 4 × 103 cell/well 농도로 분주하여 24 시간 배양 후 잘피 시료를 각각 1.00, 0.50, 0.25 µg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 후 WST-1 solution을 well 당 10µM씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였고, Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 그리고 1차 antibody와 2차 antibody를 차례로 처리하여 상온에서 반응시켰다. PBS로 세척하고 enhanced chemiluminoesence (ECL) 처리 후 X-ray film에 감광 시켜 단백질 함량을 분석하였다.
- UVB 조사로 인한 세포독성 및 산화적 세포사멸에 대한 잘피 추출물의 보호 효과를 확인하기 위해 HaCaT 세포에 손상을 유도와 동시에 검액 및 새로운 배지를 넣고, 24시간 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 처리하여 1시간 반응시킨 후, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- UVB로 유도된 각질형성세포인 HaCaT 세포의 손상 및 독성에 대한 잘피 추출물의 보호 효과를 확인하기 위해 세포에 UVB로 손상을 유도함과 동시에 잘피 부위별 추출물을 농도별로 처리하였고 24시간 배양 후 세포생존율을 측정하였다. 또한 UVB를 조사한 군과 조사하지 않은 군을 대조군으로 하여 실험을 진행하였다.
- 나누어 실험을 진행하였다. WST-1 assay를 통해 잘피 부위별 추출물이 세포에 미치는 영향을 평가하였으며, UVB 로 손상을 유도한 human keratinocyte (HaCaT cells) 에서잘피의 세포보호효과를 확인하였다. 항염증 효과를 확인하기 위해 UVB로 손상을 유도한 HaCaT cells에서 잘피추출물의 COX-2 발현 억제 효과를 평가하였고, LPS로 손상을 유도한 RAW 264.
- 이후 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 5% skim milk로 blocking을 실시하고 PBS로 세척하였다. 그리고 1차 antibody와 2차 antibody를 차례로 처리하여 상온에서 반응시켰다. PBS로 세척하고 enhanced chemiluminoesence (ECL) 처리 후 X-ray film에 감광 시켜 단백질 함량을 분석하였다.
- 측정하였다. 또한 UVB를 조사한 군과 조사하지 않은 군을 대조군으로 하여 실험을 진행하였다. 그 결과 잘피 부위별 추출물을 때처리했을 때 세포 생존율은 잘피 뿌리 추출물 0.
- 본 실험에 사용된 잘피는 건조하여 전체, 뿌리, 잎·줄기 부분으로 나누어 분쇄한 다음 이를 70% 에탄올에 24시간 동안 상온에서 침지 추출하였고 추출물을 감압 여과한 다음 저온 회전 농축기로 농축하였다.
- 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 처리하여 1시간 반응시킨 후, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포배양기에서 배양하였다. 실험을 위해 HaCaT 세포에 UVB를 300~315nm의 파장에서 400mJ/cm2로 6시간 동안 노출시켰으며 RAW 264.7 세포에는 LPS(1 ㎍/ml)를 함유한 배지를 처리하여 세포에 염증반응을 유도하였다.
- 잘피 부위별 추출물을 처리했을 때 HaCaT 세포에서의 생존율을 알아보기 위해 HaCaT 세포에 잘피 추출물을 처리하였고 24시간 동안 배양한 후 WST-1 assay로 측정하였다. 세포 생존율은 잘피 전체 추출물 0.
- WST-1 assay를 통해 잘피 부위별 추출물이 세포에 미치는 영향을 평가하였으며, UVB 로 손상을 유도한 human keratinocyte (HaCaT cells) 에서잘피의 세포보호효과를 확인하였다. 항염증 효과를 확인하기 위해 UVB로 손상을 유도한 HaCaT cells에서 잘피추출물의 COX-2 발현 억제 효과를 평가하였고, LPS로 손상을 유도한 RAW 264.7 cell에서 PGE2생성수준을 평가하였다.
이론/모형
- 1. Cell viability was measured by a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) assay. In order to measure Zostera marina(ZM) toxicity, the cells were treated with the indicated concentrations of ZM.
- 세포 생존율을 측정하기 위한 실험은 water soluble tetrazolium salt-1(WST-1) assay 방법을 이용하였다. HaCaT celle 96-well plate에 4 × 103 cell/well 농도로 분주하여 24 시간 배양 후 잘피 시료를 각각 1.
성능/효과
- 1. HaCaT 세포에 잘피 부위별 추출물을 처리하여 WST-1 assay를 통해 세포의 생존율을 확인한 결과 잘피 전체 0.5 mg/ml 시료를 제외한 모든 잘피 추출물에서 90% 이상의 높은 생존율을 보였다.
- 2. UVB로 손상을 유도한 HaCaT 세포에서 잘피 추출물의 세포보호 효과를 확인하고자 WST-1 assay를 이용하여 실험한 결과 모든 잘피 추출물에서 세포의 생존율이 80%이상으로 잘피의 UVB에 대세포보호 효과가과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
- 3. UVB를 조사한 HaCaT 세포에서 잘피 추출물을 처리한 세포의 경우 COX-2 발현이 감소된 것을 확인하였고 이는 잘피 추출물이 염증 매개 인자인 COX-2의 발현을 억제하는 것으로 판단된다. 또한 COX-2의 유도로 생성되는 PGE₂의 생합성 저해 정도를 확인하기 위해 LPS로 손상을 유도한 RAW 264.
- 측정하였다. 그 결과 UVB를 처리하지 않은 군에서는 COX-2가 낮게 발현되었고 이와 대조적으로 UVB를 단독으로 처리한 군에서는 COX-2 단백질 발현양이 뚜렷하게 증가하였다. 이와 비교했을 때 잘피 전체 추출물을 처리한 군에서는 시료를 처리하지 않은 UVB를 단독 처리한 세포군보다 COX-2 발현이 감소되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 또한 UVB를 조사한 군과 조사하지 않은 군을 대조군으로 하여 실험을 진행하였다. 그 결과 잘피 부위별 추출물을 때처리했을 때 세포 생존율은 잘피 뿌리 추출물 0.50 mg/ml 농도를 제외한 모든 시료에서 80% 이상인 것을 확인하였고 잘피 뿌리 추출물 0.50 mg/ml 농도 또한 79.8%로 다른 잘피 부위별 시료와 유사한 높은 생존율을 나타내었으며, 60%이하의 세포 생존율을 나타내는 UVB 조사 대조군 보다 약 24% 높은 세포 생존율을 확인하였다 (Fig. 2).
- COX-2 발현에 의해 생성된 PGE2는 염증반응 시 나타나는 통증, 부종, 홍반과 같은 증상의 원인일 뿐만 아니라 세포증식에 영향을 주어 각종 질병의 유발에 관여한다. 따라서 PGE2 생성에 있어서 잘피 추출물이 미치는 영향을 실험한 결과는 Fig. 4에 나타난 바와 같으며, 결과에서 알 수 있듯이 정상군인 음성대조군의 경우에는 PGE2 생성의 증가가 나타나지 않았지만, LPS를 단독으로 처리한 양성대조군에서는 PGE2 생성이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 반면 LPS 처리에 의한 PGE2의 생성 증가는 잘피 추출물에 의하여 억제됨을 확인할 수 있었으며, 즉, 잘피 추출물은 COX-2의 발현억제와 이로 인한 PGE2의 생성 저해로 이어지는 것을 알 수 있었다.
- UVB를 조사한 HaCaT 세포에서 잘피 추출물을 처리한 세포의 경우 COX-2 발현이 감소된 것을 확인하였고 이는 잘피 추출물이 염증 매개 인자인 COX-2의 발현을 억제하는 것으로 판단된다. 또한 COX-2의 유도로 생성되는 PGE₂의 생합성 저해 정도를 확인하기 위해 LPS로 손상을 유도한 RAW 264.7 세포에 잘피 추출물을 처리한 후 염증 매개체인 PGE2의 함량을 측정한 결과 잘피 추출물에 의해 감소되는 것을 확인하였다.
- 4에 나타난 바와 같으며, 결과에서 알 수 있듯이 정상군인 음성대조군의 경우에는 PGE2 생성의 증가가 나타나지 않았지만, LPS를 단독으로 처리한 양성대조군에서는 PGE2 생성이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 반면 LPS 처리에 의한 PGE2의 생성 증가는 잘피 추출물에 의하여 억제됨을 확인할 수 있었으며, 즉, 잘피 추출물은 COX-2의 발현억제와 이로 인한 PGE2의 생성 저해로 이어지는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 잘피 추출물로 인해 LPS에 의한 염증과 정에서 중요한 매개 인자인 COX 및 PGE2의 감소가 일어나므로 전체적인 염증의 진행이 억제되고 있다는 사실로 확인할 수 있었다.
- 최근 정상적인 생리 기능은 유지하면서 염증반응을 감소시키기 위해 COX-2만 선택적으로 억제하려는 연구가 활발히 진행되고 있다14). 본 연구에서는 잘피 추출물의 항염증 효과를 확인하고자 염증 매개 인자인 COX-2의 단백질 발현양을 측정한 결과 UVB를 처리하지 않은 음성대조군에서는 COX-2 발현이 낮았으며, UVB를 단독으로 처리한 양성대조군에서는 COX-2 단백질 발현양이 증가하였다. 반면 잘피 전체 추출물을 처리한 군에서는 양성대조군보다 COX-2 발현이 감소되었다(Fig.
- 측정하였다. 세포 생존율은 잘피 전체 추출물 0.50 mg/ml 농도를 제외한 모든 잘피 시료에서 90% 이상의 생존율을 확인하였다(Fig. 1). 잘피 전체 추출물 1.
- 반면 LPS 처리에 의한 PGE2의 생성 증가는 잘피 추출물에 의하여 억제됨을 확인할 수 있었으며, 즉, 잘피 추출물은 COX-2의 발현억제와 이로 인한 PGE2의 생성 저해로 이어지는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 잘피 추출물로 인해 LPS에 의한 염증과 정에서 중요한 매개 인자인 COX 및 PGE2의 감소가 일어나므로 전체적인 염증의 진행이 억제되고 있다는 사실로 확인할 수 있었다. 일반적으로 Raw 264.
- 3). 이상의 결과로 볼 때 잘피 추출물은 자외선에 의해 증가된 COX-2 발현을 억제하여 일련의 염증반응을 최소화함으로써 PGE2생성 저해작용에 관여하고 생체조직의 염증과 관련되는 증상을 완화하여 줄 수 있을 것으로 사료된다. COX-2 발현에 의해 생성된 PGE2는 염증반응 시 나타나는 통증, 부종, 홍반과 같은 증상의 원인일 뿐만 아니라 세포증식에 영향을 주어 각종 질병의 유발에 관여한다.
- 그 결과 UVB를 처리하지 않은 군에서는 COX-2가 낮게 발현되었고 이와 대조적으로 UVB를 단독으로 처리한 군에서는 COX-2 단백질 발현양이 뚜렷하게 증가하였다. 이와 비교했을 때 잘피 전체 추출물을 처리한 군에서는 시료를 처리하지 않은 UVB를 단독 처리한 세포군보다 COX-2 발현이 감소되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 0%로 대조군 보다 22% 감소한 것을 확인하였다. 잘피 뿌리 추출물 1.00, 0.50, 0.25 mg/ml의 농도에서 각각 102.3%, 100.0%, 94.4%로 농도 의존적으로 생존율이 감소하는 것을 볼 수 있으며 1.00 mg/ml에서는 근소하게 생존율이 증가함을 확인하였다. 잘피 잎줄기 추출물 1.
- 00 mg/ml에서는 근소하게 생존율이 증가함을 확인하였다. 잘피 잎줄기 추출물 1.00, 0.50, 0.25 mg/ml의 농도에서 각각 113.6%, 116.4%, 108.0%로 세포 생존율이 대조군보다 증가함을 확인하였고 잘피 잎줄기가 부위별 추출물 중 가장 높은 생존율을 보인 것을 확인하였다.
- 1). 잘피 전체 추출물 1.00 mg/ml 와 0.25 mg/ml 에서는 각각 113.0%와 114.7%로 대조군 보다 약 10%이상의 생존율을 보였으나 0.50 mg/ml에서는 78.0%로 대조군 보다 22% 감소한 것을 확인하였다. 잘피 뿌리 추출물 1.
- 잘피 전체 추출물 1.00, 0.50, 0.25 mg/ml농도에서 각각 81.1%, 83.6%, 83.5%를 나타내었고 잘피 뿌리 추출물에서는 각각 80.9%, 84.5%, 79.8%, 잘피 잎줄기 추출물에서 85.1%, 86.1%, 83.2%를 나타내어 부위별 시료 중 잎줄기 추출물에서 세포 생존율이 가장 높아 세포보호 효과가 가장 높게 나타났으나 부위별 세 가지 시료에서의 생존율은 큰 차이가 없는 것으로 판단된다.
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