효소분리 및 용매정제법으로 제조한 고농도 Sialic Acid(23%)가 함유된 GMP 가수분해분말의 마우스 골수세포의 소핵시험을 이용한 안전성 평가연구 In Vivo Evaluation of the Safety of Hydrolyzed GMP Powder containing Highly Concentrated Sialic Acid (23%) produced by Enzyme Separation and Solvent Enrichment Method using Micronucleus Test in Mice원문보기
본 시험물질인 GMP으로부터 sialic acid를 분리 및 이의 농도를 23%로 높게 정제한 GMP 가수분해물(23%-GNANA) 분말에 대해 발암성 유발 유 무 판단의 기초자료를 얻기 위하여 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험을 실시하였다. 결과로서, 다염성 적혈구의 소핵출현 적혈구의 출현비율은 음성 대조군과 시험물질 투여군간 평균 차이의 유의성이 없었다(p<0.05). 또한 동물개체별로 관찰한 결과에서도 음성대조군과 시험물질 투여군간 유의성이 없었으며(p<0.05), 시험물질의 용량의존성 반응은 전체적으로 나타나지 않았다. 이러한 결과로 보아, GMP로부터 제조한 23%-GNANA는 고농도로 sialic acid가 농축되었을 뿐, 일반 식품인 GMP 수준에서 마우스 골수세포에 대해 소핵의 유발성이 없는 것으로 판단되었다.
본 시험물질인 GMP으로부터 sialic acid를 분리 및 이의 농도를 23%로 높게 정제한 GMP 가수분해물(23%-GNANA) 분말에 대해 발암성 유발 유 무 판단의 기초자료를 얻기 위하여 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험을 실시하였다. 결과로서, 다염성 적혈구의 소핵출현 적혈구의 출현비율은 음성 대조군과 시험물질 투여군간 평균 차이의 유의성이 없었다(p<0.05). 또한 동물개체별로 관찰한 결과에서도 음성대조군과 시험물질 투여군간 유의성이 없었으며(p<0.05), 시험물질의 용량의존성 반응은 전체적으로 나타나지 않았다. 이러한 결과로 보아, GMP로부터 제조한 23%-GNANA는 고농도로 sialic acid가 농축되었을 뿐, 일반 식품인 GMP 수준에서 마우스 골수세포에 대해 소핵의 유발성이 없는 것으로 판단되었다.
This study was designed to determine the mutagenic potential of hydrolyzed glycomacropeptide (GMP) powder (hereafter referred to as 23%-GNANA; product name: HELICOBACTROL-23) in a micronucleus test using bone marrow in ICR mice. Three experimental groups were used: a 3-step concentration group, with...
This study was designed to determine the mutagenic potential of hydrolyzed glycomacropeptide (GMP) powder (hereafter referred to as 23%-GNANA; product name: HELICOBACTROL-23) in a micronucleus test using bone marrow in ICR mice. Three experimental groups were used: a 3-step concentration group, with a maximum concentration of 2,000 mg/kg, and other sequentially two-fold lower concentrations, a negative control group, and a positive control group. The test material was administered for 2 d to observe the frequency of micronucleus formation up to 48 h after the test material was absorbed by the body. When the polychromatic erythrocyte (PCE) content of erythrocytes was compared, no significant differences were noted between the negative control group and the test group (p<0.05). Similarly, when the average numbers of micronucleated PCE (MNPCE) in 2,000 PCE per animal were compared, no significant difference was observed between the negative control group and the test group (p<0.05). No dose-response relationship with regard to the concentration of the test material administered was noted. These results allow us to conclude that hydrolyzed whey protein powder does not cause formation of micronuclei in mouse bone marrow cells under the applied conditions. In this study, the average frequency of micronucleus formation in PCE was significantly higher in the positive control group compared with the negative control group; thus, the test conditions were appropriate for detecting the frequency of micronucleus formation induced by the test material. In conclusion, the safety of 23%-GNANA test substance was verified in an in vivo micronucleus test in mice, conducted before the registration of HELICOBACTROL-23 as a food additive.
This study was designed to determine the mutagenic potential of hydrolyzed glycomacropeptide (GMP) powder (hereafter referred to as 23%-GNANA; product name: HELICOBACTROL-23) in a micronucleus test using bone marrow in ICR mice. Three experimental groups were used: a 3-step concentration group, with a maximum concentration of 2,000 mg/kg, and other sequentially two-fold lower concentrations, a negative control group, and a positive control group. The test material was administered for 2 d to observe the frequency of micronucleus formation up to 48 h after the test material was absorbed by the body. When the polychromatic erythrocyte (PCE) content of erythrocytes was compared, no significant differences were noted between the negative control group and the test group (p<0.05). Similarly, when the average numbers of micronucleated PCE (MNPCE) in 2,000 PCE per animal were compared, no significant difference was observed between the negative control group and the test group (p<0.05). No dose-response relationship with regard to the concentration of the test material administered was noted. These results allow us to conclude that hydrolyzed whey protein powder does not cause formation of micronuclei in mouse bone marrow cells under the applied conditions. In this study, the average frequency of micronucleus formation in PCE was significantly higher in the positive control group compared with the negative control group; thus, the test conditions were appropriate for detecting the frequency of micronucleus formation induced by the test material. In conclusion, the safety of 23%-GNANA test substance was verified in an in vivo micronucleus test in mice, conducted before the registration of HELICOBACTROL-23 as a food additive.
본 연구에서는 안전식품 및 식품첨가물로 사용되고 있는 유청 단백질 내 지표성분인 sialic acid를 식품소재로 활용성을 높이기 위하여, 시험물질인 GMP 가수분해단백분말(23%-GNANA)을 GLP 가이드라인에 따라 “마우스 골수세포의 소핵시험”을 통한 안전성을 평가하였다.
제안 방법
본 시험에서 시험군을 용매대조군 1군, 투여군 3군(500 mg/kg, 1,000 mg/kg, 2,000 mg/kg 투여군)과 양성대조군(Mitomycin C, 2 mg/kg)으로 구성하여 총 5군을 구성하였다. 각 군당 5마리씩 총 25마리의 마우스를 사용하였다,
D로 표시하였으며, 이를 소핵 유발빈도로 하였다. 소핵 계수 후에 소핵 유무와 상관없이 합계 500개의 PCE와 NCE를 계수하여 PCE/(PCE+NCE)의 비율을 산출하고, 이를 세포독성의 지표로 설정하였다.
대상 데이터
GMP는 sialic acid가 7%가 결합된 형태로 판매되는 Natra PepGMP(Murry Goulburn Co-Operative Co., Australia)을 구입하여 원료로 사용하였다. 시험물질 제조를 위하여, 정제수에 7%(w/v)되게 GMP를 용해시킨 후 효소 Alcalase 2.
시험동물은 7주령의 ICR 계통의 수컷 마우스(SFP)를 (주)코아텍(한국)로부터 구입한 후, 7일간의 검역과 순화 과정을 거쳐 건강한 개체만을 시험에 사용하였다. 사육환경 및 운영은 시험법을 준수하여 SPF 실험동물실 및 사육조건에서 실시하였다.
시험물질 내 sialic acid의 분리효율 및 함유량 검정을 위한 표준체는 Sigma-Aldrich사(A2090)을 구입하여 0.1 ppm(w/w), 1 ppm 및 10 ppm 되게 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 지표성분인 sialic acid의 검출허용오차는 90~110% 범위 내에서 평가하였다.
데이터처리
본 소핵시험의 결과 용매대조군에 대한 시험물질 투여군의 소핵출현빈도와 전체 적혈구당 다염성 적혈구 비율에 대한 유의성 검정은 5%의 유의수준(p=0.05)에서 one-way ANOVA, multiple comparision 분석을 통해 SPSS 19.0K 통계 프로그램을 이용하여 실시하였다.
이론/모형
맹검법(blind method)에 의해 실시하였으며, FITC filter가 장착된 형광현미경을 사용하여 관찰하였다. 표본의 관찰기준은 핵이 없이 적색 형광빛을 나타내는 것을 PCE로 하였으며, NCE(normochromatic erythrocyte)는 형광빛을 나타내지 않고 음영으로만 구분되는 것으로 하였다.
본 연구는 한국식품의약품안전처의 “의약품등의 독성시험기준(고시 제 2014-136호, 2014.1.30), 비임상시험관리기주(고시 제 2014-6호, 2014. 2.12)”에 따라 실시하였다.
성능/효과
Fig. 3은 시험물질인 23%-GNANA 내 지표성분인 sialic acid의 분리효율 및 함유량을 분석한 결과로서, 23% sialic acid와 GMP 단백질이 87%(수분함량 제외)로 구성되어 있었으며, 분해효율은 100%였다. 따라서, 시험물질로 사용에 있어 적합함을 확인하였다.
05), 시험물질 투여군들에 있어서 시험물질에 의한 용량의존성 반응이 없었다. 동물개체별로 다염성 적혈구에서 관찰한 소핵출현 적혈구의 평균빈도는 음성대조군에서 0.13±0.027%, 500 mg/kg 투여군에서 0.15±0.035%, 1,000 mg/kg 투여군에서 0.14±0.022% 그리고 2,000 mg/kg 투여군에서는 0.13±0.045%로 관찰되었다.
Table 3은 시험물질인 23%-GNANA의 섭이에 따른 적혈구 증식억제 및 소핵출현빈도를 검정한 결과이다. 본 시험에서 양성대조군은 음성대조군과의 적혈구 증식억제율과 비교에서는 유의한 차이가 없었지만, 다염성 적혈구에서 관찰한 소핵출현 적혈구의 평균빈도에서는 유의하게 높아 시험물질의 소핵출현 빈도 확인을 위한 시험조건으로 적절한 것으로 판단된다.
전체 적혈구 중 다염성 적혈구의 평균비율은 음성대조군에서 40.7±1.35%, 500 mg/kg 투여군에서 40.2±1.44%, 1,000 mg/kg 투여군에서 39.7±1.15% 그리고 2,000 mg/kg 투여군에서는 39.9±1.34%로 관찰되었다. 통계적 검정결과, 모든 투여군의 평균비율이 음성대조군과 비교하여 유의성이 없었고(p>0.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
GMP란?
GMP(Glycomacropeptide)는 우유 속 단백질의 일종인 κ- casein에 chymosin의 작용으로 105번 Phe와 106번 Met 사이의 펩타이드 결합이 절단되어 생성되는 C-말단 63개의 펩타이드이며, 수용성 단백질이다(Yoon et al., 2000).
적혈구에서 미소핵은 어떻게 구분할 수 있는가?
, 1975). 적혈구에서 미소핵은 MayGrünwald Giemsa stain에 의해 미성숙 적혈구인 PCE와 성숙한 적혈구인 정염성 적혈구(normochromatic erythrocyte, NCE)로 구분할 수 있다. 각종 약제 또는 독성물질의 세포유전학적 독성평가에는 Metaphase analysis, Sister chromatid exchange(SCE)등이 많이 사용되었으나, 요즘에는 분석시간과 비용이 절약되면서 간편하게 정확한 결과를 도출시킬 수 있는 방법 중의 하나인 미소핵 검사가 널리 보편화되어 있다(Fenench et al.
GMP의 형태는 어떠한가?
, 2000). 그리고 N- acetylneuraminic acid(sialic acid), galactose(gal) 그리고 Nacetylgalactosamine(GalNAc)의 3개의 당이 3개 또는 4개가 연결된 형태로 Thr나 Ser 잔기에 연결되어 있다(Ernest et al., 2000).
참고문헌 (17)
Ernest, P. B. 2000. Biological activities of bovine glycomacropeptide. British Journal of Nutrition 84:39-46.
Iijima, R., Takahashi, H., Namme, R., Ikegami, S. and Yamazaki, M. 2004. Novel biological funtion of sialic acid (N-acetyl-neuraminic acid) as a hydrogen peroxide scavenger. FEBS Letters 561:163-166.
Joskic, G. Nikolic, M. and Tisma, V. S. 1997. Radiosensitivity of different aged human lymphocytes following electron irradiation in vitro. Neoplasma 44(2):117-121.
Ledeur, M. V. and Schmid. W. 1973.The micronucleus test methodological aspects. Mutation Research 19:109-117.
Moon, Y. I., Lee, W. J. and Oh, S. J. 2005. Glycomacropeptide hydrolysed from bovine ${\kappa}$ -casein; II. Chromatographic changes of ${\kappa}$ -casein macropeptide as related to trichloroacetic acid concentration. Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 17(1): 478-482.
Schauer, R. and Wien, S. V. 1984. Sialic acids: Chemistry, metabolism and function. Carbohydrate Research 129:5-7.
Sudharsan, A. and Heddle, J. A. 1982. Simultaneous detection of chromosomal aberration and sister-chromatid exchanges. Toxicology and Applied Pharmacology 62:445-454.
Wandl, E. O., Kain, R., Herbsthofer, T., Hienert, G. and Hobarth, G. 1989. Linear correlation between surviving fraction and the micronucleus frequency. J. Int. Radiat. Biol. 56(5): 771-775.
Wang, B., Brand-Miller, J., McVeagh, P. and Petocz, P. 2001. Concentration and distribution of sialic acid in human milk and infant formulas1-3. Am. J. Clin. Nutr. 74:510-515.
Wang, B., Yu, B., Karim, M., Hu, H., S., McGreevy, Y., Petocz, H. P., Held, S. and Miller, J. B. 2007. Dietary sialic acid supplementation improves learning and memory in piglets1-3. Am. J. Clin. Nutr. 85:561-569.
Yoon, Y. C., Cho, J. K., Song, C. H., Lee, S. and Chung, C. I. 2000. Purification of the glycomacropeptide from cheese whey. Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 20:159-165.
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