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문제 정의
- 7 세포주를 이용한 염증 관련 단백질 발현 확인을 통한 항염증 효과와 최종적으로 3T3-L1 세포 분화 억제를 통한 항비만 효과를 Oil Red O 염색의 결과로 분석하였다. 본 연구를 통해 조릿대 부위별 조추출물의 분획별 효과에 대한 공통적인 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
- 7 세포에 유발한 염증상태에 미치는 영향을 파악하고, 나아가 3T3-L1 비만전구세포에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 통해 다양한 조릿대의 잎과 줄기 분획 중에서 자유기에 의한 산화적 스트레스를 효과적으로 억제하고 염증상태를 완화시키며 지방세포 분화를 억제하는 분획을 선별하고자 하였다.
제안 방법
- 이에 본 연구에서는 국내 자생 조릿대를 잎과 줄기로 나누고 70% 에탄올 조추출물(SBE)을 각각 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물의 용매별로 분별추출하여 5분획을 얻었다. 각 분획의 페놀함량을 분석하였으며, 양이온 및 음이온 소거능을 통해 항산화능력을 확인하였다. 이어서 Raw 264.
- 다양한 천연물 유래 추출물을 이용한 항산화 및 항비만 효과 연구가 관심을 얻고 있다. 본 연구에서는 조릿대 잎과 줄기에 포함된 성분을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획의 항산화 효과를 비교하고 LPS로 Raw 264.7 세포에 유발한 염증상태에 미치는 영향을 파악하고, 나아가 3T3-L1 비만전구세포에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 통해 다양한 조릿대의 잎과 줄기 분획 중에서 자유기에 의한 산화적 스트레스를 효과적으로 억제하고 염증상태를 완화시키며 지방세포 분화를 억제하는 분획을 선별하고자 하였다.
- 각 분획의 페놀함량을 분석하였으며, 양이온 및 음이온 소거능을 통해 항산화능력을 확인하였다. 이어서 Raw 264.7 세포주를 이용한 염증 관련 단백질 발현 확인을 통한 항염증 효과와 최종적으로 3T3-L1 세포 분화 억제를 통한 항비만 효과를 Oil Red O 염색의 결과로 분석하였다. 본 연구를 통해 조릿대 부위별 조추출물의 분획별 효과에 대한 공통적인 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
- 이에 본 연구에서는 국내 자생 조릿대를 잎과 줄기로 나누고 70% 에탄올 조추출물(SBE)을 각각 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물의 용매별로 분별추출하여 5분획을 얻었다. 각 분획의 페놀함량을 분석하였으며, 양이온 및 음이온 소거능을 통해 항산화능력을 확인하였다.
- 조릿대 추출물의 ABTS radical 소거활성은 Van den Berg등의 방법을 변형하여 측정하였다. 증류수에 녹인 7.
- 조릿대 추출물의 DPPH radical 소거능은 free radical에 대한 환원력을 측정한 Bondet 의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 에탄올에 녹인 0.
- 조릿대 추출물의 superoxide anion 소거능은 xanthine oxidase에 의한 tetrazolium salt (NBT)의 푸른색 formazan dye 생성억제 능력을 측정하여 확인하였다. 3 mM hypoxanthine과 1.
- 조릿대의 잎과 줄기 70% 조추출물을 다양한 분획으로 나누어 항산화 및 항염증, 지방전구세포 분화 억제능을 관찰하였다. 그 결과 조릿대의 잎과 줄기 각각의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획에서 높은 페놀 함량과 함께 강한 항산화능을 확인하였으며 Raw 264.
- 조릿대의 줄기와 잎의 추출물의 아질산염 생성 억제능을 평가하였다. Raw 264.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 조릿대(Sasa borealis)는 2015년 8월 경상남도 진주 죽림원에서 동정된 후 300 g을 제공받아서 사용하였다. 조릿대는 음지에서 3일간 실온에서 자연건조 시킨 후 조릿대 잎과 줄기 부분으로 각기 분리한 후 세절하였다.
- 쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포와 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 한국세포주은행 (KCLB)에서 구매하여 계대배양하였다. 10%의 FBS와 1%의 penicillin-streptomycin을 함유하는 DMEM에서 배양하였다.
이론/모형
- Raw 264.7 세포에서 LPS로 유도된 COX-2 와 iNOS 단백질의 발현에 대한 조릿대의 효과를 Western blot을 이용하여 관찰하였다. NO assay와 같은 조건의 처리를 한 세포를 수거 후 Radioimmuno-precipitation assay (RIPA) 용액으로 단백질을 분리하였다.
- 세포 생존률의 측정은 EZ-Cytox cell viability assay kit (Daeil Lab Service, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 96 well culture plate에 Raw 264.
- 조릿대 잎과 줄기 각 분획 추출물의 페놀 함량을 folin-ciocalteu 시약을 이용한 방법으로 측정하였다. 40 μl의 분획 추출물에 200 μl의 Folin-ciocalteu와 1160 μl의 증류수를 첨가 하고 3분간 반응시켰다.
성능/효과
- 또한 지질 과다축적과 지방세포 비대는 cytokine을 포함한 proinflammatory 인자와 관련된 것으로 보고되고 있으며25) 따라서 앞서 제시된 조릿대의 디클로로메탄층과 에틸아세테이트 분획이 COX-2와 iNOS 발현을 억제시킨 것을 근거로 항비만 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 3T3-L1을 이용한 실험 결과 조릿대의 잎과 줄기의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획은 지방전구세포의 분화와 지질 축적 양을 대조군에 비해 유의하게 억제하는 결과를 나타내었다.
- 조릿대의 잎과 줄기 70% 조추출물을 다양한 분획으로 나누어 항산화 및 항염증, 지방전구세포 분화 억제능을 관찰하였다. 그 결과 조릿대의 잎과 줄기 각각의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획에서 높은 페놀 함량과 함께 강한 항산화능을 확인하였으며 Raw 264.7 세포에서 NO 생성을 효과적으로 억제하고, 염증 관련 인자인 iNOS 및 COX-2 발현을 감소시키면서 최종적으로 지방전구세포의 분화를 유의하게 억제하는 효과를 확인하였다. 따라서 다양한 질환에 대한 치료물질로서 조릿대의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획의 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 또한 COX-2의 경우, LPS 처리 군이 비처리군에 비해 2.8배가 증가하였으며, 잎 추출물에서는 헥산과 디클로로메탄 분획이 각각 2.3배, 1.6배로 억제 효과를 나타내었고, 줄기 추출물에서는 헥산 분획이 2.0배로 COX-2 발현을 억제하였다(Fig. 4).
- 7 세포에서 잎과 줄기의 분획에서 공통적으로 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획에서 세포 독성을 가지지 않으면서 NO의 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 해당 세포에서 염증 관련 단백질 발현을 Western blot 방법을 통해 확인한 결과 잎과 줄기의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획에서 억제된 iNOS 발현을 확인할 수 있었다. 또한 잎의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획에서는 COX-2의 발현량 또한 감소한 것을 확인할 수 있었다.
- 본 연구 결과 조릿대의 잎과 줄기의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획이 항산화 및 항염증 효과가 뛰어난 것으로 나타났으며 지방분화세포의 분화 억제와 지질 축적 감소의 효과를 통해 잠재적인 항비만 효과 또한 관찰할 수 있었다. 향후 조릿대의 잎과 줄기 분획을 이용한 항산화, 항염증 및 항비만 연구를 통해 잠재적인 질환 치료물질의 개발이 기대된다.
- 생성된 NO는 IL-6, TNF-α와 같은 cytokine을 생산하여 병리적인 혈관확장과 세포독성, 조직손상 등의 유해한 작용으로 염증을 심화시키고 염증질환과 면역질환등 다양한 질환을 유발하므로 NO의 발현의 조절은 이후 proinflammatory cytokine의 조절23)과 염증의 종결24)에 있어 중요하다. 본 연구에서 LPS로 감작한 Raw 264.7 세포에서 잎과 줄기의 분획에서 공통적으로 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획에서 세포 독성을 가지지 않으면서 NO의 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 해당 세포에서 염증 관련 단백질 발현을 Western blot 방법을 통해 확인한 결과 잎과 줄기의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획에서 억제된 iNOS 발현을 확인할 수 있었다.
- 한편, 조릿대의 줄기의 지방간 완화 효능에 대한 송 등의 연구18)에서, 항염증 및 항비만 효과가 알려진 luteolin 등의 phenol이 검출되었다. 이러한 사실들로 미루어 볼 때, 조릿대의 잎과 줄기에 함유된 생리 활성물질이 에틸아세테이트 또는 디클로로메탄 분획에 함유될 것으로 예상할 수 있다.
- 항산화 능력을 종합해볼 때, 잎과 줄기 분획의 에틸아세테이트(EA) 및 디클로로메탄(DCM)에서 다른 분획에 비하여 뛰어난 항산화능을 나타내었다. 특히 잎 에틸아세테이트 분획은 DPPH와 ABTS 자유 라디컬 소거능이 뚜렷하게 나타났으며 이는 가장 높은 페놀 함량을 나타낸 결과와 일치한다. 페놀은 다양한 항알러지, 항염증, 항균 및 항산화 효과 등의 다양한 생리활성을 나타는 것으로 알려져 있다22).
- 항산화 능력을 종합해볼 때, 잎과 줄기 분획의 에틸아세테이트(EA) 및 디클로로메탄(DCM)에서 다른 분획에 비하여 뛰어난 항산화능을 나타내었다. 특히 잎 에틸아세테이트 분획은 DPPH와 ABTS 자유 라디컬 소거능이 뚜렷하게 나타났으며 이는 가장 높은 페놀 함량을 나타낸 결과와 일치한다.
후속연구
- 7 세포에서 NO 생성을 효과적으로 억제하고, 염증 관련 인자인 iNOS 및 COX-2 발현을 감소시키면서 최종적으로 지방전구세포의 분화를 유의하게 억제하는 효과를 확인하였다. 따라서 다양한 질환에 대한 치료물질로서 조릿대의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획의 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 페놀은 다양한 항알러지, 항염증, 항균 및 항산화 효과 등의 다양한 생리활성을 나타는 것으로 알려져 있다22). 이런 점을 고려해볼 때, 항산화 능력이 뛰어난 조릿대 70% 에탄올 조추출물의 에틸아세테이트 분획에서 추가적인 효과를 기대해볼 수 있다.
- 본 연구 결과 조릿대의 잎과 줄기의 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획이 항산화 및 항염증 효과가 뛰어난 것으로 나타났으며 지방분화세포의 분화 억제와 지질 축적 감소의 효과를 통해 잠재적인 항비만 효과 또한 관찰할 수 있었다. 향후 조릿대의 잎과 줄기 분획을 이용한 항산화, 항염증 및 항비만 연구를 통해 잠재적인 질환 치료물질의 개발이 기대된다.
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