장기 배양이 가능한 세포사멸 저항성 세포주의 개발 및 이를 이용한 유용단백질 대량 생산 Development of mammalian cells resistant to apoptosis and production of useful proteins원문보기
보고서 정보
주관연구기관
고려대학교 Korea University
보고서유형
최종보고서
발행국가
대한민국
언어
한국어
발행년월
2008-01
과제시작연도
2003
주관부처
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA)
등록번호
TRKO201100015906
과제고유번호
1390004914
사업명
농업생명공학기술개발
DB 구축일자
2013-04-18
초록▼
첫째, 해당과정을 경유하여 생성되는 toxic by product인 젖산의 생성량 감소와 pH 감소를 줄일 수 있는 세포는 이를 생성하는 lactate dehydrogenase (LDH) 발현양을 anti-sense mRNA 발현 기술 도입으로 LDH 활성을 줄임으로써 획득한다. 둘째, 세포내 redox potential을 조절할 수 있는 항산화 유전자인 manganese superoxide dismutase (MnSOD) 의 도입을 통하여 항산화 능을 높임으로써 산화적 스트레스에 저항 할 수 았는 세포주를 개발한다. 셋
첫째, 해당과정을 경유하여 생성되는 toxic by product인 젖산의 생성량 감소와 pH 감소를 줄일 수 있는 세포는 이를 생성하는 lactate dehydrogenase (LDH) 발현양을 anti-sense mRNA 발현 기술 도입으로 LDH 활성을 줄임으로써 획득한다. 둘째, 세포내 redox potential을 조절할 수 있는 항산화 유전자인 manganese superoxide dismutase (MnSOD) 의 도입을 통하여 항산화 능을 높임으로써 산화적 스트레스에 저항 할 수 았는 세포주를 개발한다. 셋째, 위의 결과물로 수득된 세포주로부터 유용 단백질의 생산성의 증가에 있어 그 적합성 여부는 실제 유용 단백질인 EPO의 발현능으로 확인한다. 넷째，개발된 우량 세포주의 산업적 이용을 위해 대량 배양시 반드시 수반되어야 하는 부유성 세포로의 무혈청 배지 적응을 도모한다.
Abstract▼
Chinese hamster ovary (CHO) cells are an useful mammalian expreSSIOn host that have been extensively employed for the production of therapeutic recombinant glycoproteins (Hwang et al., 1999; Lao et al., 1997). These cells are easily genetically manipulated and proteins produced in these cells have a
Chinese hamster ovary (CHO) cells are an useful mammalian expreSSIOn host that have been extensively employed for the production of therapeutic recombinant glycoproteins (Hwang et al., 1999; Lao et al., 1997). These cells are easily genetically manipulated and proteins produced in these cells have a similar glycans to those of human, that is critical in vivo biological activity. In the higher production of therapeutic recombinant glycoproteins industrially, there are many obstacles such as pH acidification, insufficient oxygen supply, nutrient deprivation, and toxic metabolic byproducts (Chen et al., 2001). These are causesof inhibition of cell growth and decrease of productivity of the recombinant proteins (Esposito et al.,1999; Kowaltowski et al., 1999). Lactate and ammonia are the two major toxic by-products of cell culture, and they have adverse effects on cell growth and protein production (Cruz et al., 2000). Oxygen has a very low solubility, and dissolved oxygen concentration of the media has a critical effect on cell metabolism, which governs specific productivity of the recombinant protein. To maintain the high productivity, oxygen has to be supplied continuously, but rigorous agitation for oxygenation causes cell death. Although a variety of physical methods for aeration with reduced detrimental effect on animal cells have been developed, a method of oxygen supply for higher productivity, particularly in alarge scale culture with high cell densities, remains to be devised. Gene amplification is awidespread phenomenon in eukaryotes. It is an important process in the development of many organisms, emergence of drug resistance in tumor cells and some human parasites, and maturation of cancer cells. Moreover, using cultured cells, the gene amplification phenomenon has been applied to the production of recombinant therapeutic proteins(Schimke et al., 1984; Schimke et al., 1988). For high-level expression of recombinant proteins, most widely used amplification strategy is the use of dihydrofolate reductase-mediated amplification in the dhfr- deficient CHO cells through the methotrexate (MTX) treatment. In general, MTX -tolerant cell lines develop resistance against MTX owing to dhfr gene amplification. Amplification unit is much larger (l00 to 3000 kilo bases) than the size of the dhfr gene, the gene of interest, which is co-linked to the dhfr geneco-amplified.
목차 Contents
표지 ...1
제출문 ...2
요약문 ...3
SUMMARY ...7
CONTENTS ...9
목차 ...13
제 1 장 서 론 ...17
1. 연구개발의 목적 ...17
2. 연구개발의 필요성 ...17
가. 기술적 측면 ...17
나. 경제.산업적 측면 ...18
다. 사회.문화적 측면 ...19
제 2 장 국내외 기술개발 현황 ...20
1. 외국의 경우 ...20
2. 국내의 경우 ...20
제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ...21
제 1 절 연구개발수행 내용 ...21
1. 이론적 접근 방법 ...21
2. 실험적 접근방법 및 연구내용 ...21
가. 1차년도: 산화적 스트레스 저항성 세포주 개발 ...21
(1) 실험적 접근 방법 ...22
(가) 항산화 효소 유전자를 동물 세포에 도입...22
(나) 해당과정 우회 세포주 개발...22
(다) 해당과정 우회 세포주에서 산화적 스트레서에 대한 저항성 측정...22
(2) 연구내용 ...23
(가) Cell transfection...23
(나) Lactate dehydrogense (LDH) 활성 측정...23
(다) MnSOD 활성 측정...23
(라) Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 활성 측정...23
(마) 세포내 활성화 산소종 측정...24
(바) 미토콘드리아에서 생성되는 활성화 산소종 측정...24
(사) 세포 성장률과 세포주기 관찰...24
나. 2차년도: pH와 oxidative stress에 안정화된 세포주에 저산소증에서 유도될 수 있는 유전자 도입 ...24
(1) 실험적 접근 방법 ...24
(가) EPO 유전자의 클로닝과 동물세포에서 과량 생산이 가능한 벡터로의 도입...25
(나) 항산화 효소 MnSOD 과량 발현이 가능한 동물 세포주 개발...25
(다) 산화적 저항성 우량 세포주에서 EPO 생산성 확인...25
(2) 연구내용 ...25
(가) Cell transfection...25
(나) MnSOD의 과량 발현과 활성 측정...26
(다) 세포 성장률 (cell viability) 측정...26
(라)대조 세포주와 실험 세포주의 western blot과 RT-PCR을 통한 EPO 양 비교...26
(마) EPO 생산성 측정...27
다. 3차년도 : toxic by-product 생성을 줄일 수 잇는 세포주에 항산화 유전자 도입 ...27
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