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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 해수관상어센터로부터 기증받은 빅 벨 리 해마를 다양한 효소를 사용해 가수분해 하여 각 가수분해물의 수율, 단백질 함량과 alkyl 라디칼 소거능 측정을 통해 우수한 효소 가수분해물을 선정하여 기능성소재 응용가능성을 검토하였다. 효소 가수분해물 중 우수 효소 가수분해물인 DP는 Vero Cells에 대한 세포독성이 없이 농도의존적으로 ROS 생성을 감소시켰고, AAPH에 대한 산화반응을 억제 함으로서 항산화 효능을 가진다는 것을 확인하였다.
- 하지만 이전에 많은 생리활성 연구가 진행된 북해마(Hippocampus kuda Bleeker), 갈귀해마(Hippocampus guttu- latus), Short-snouted seahorse (Hippocampus hippocampus)종 등에 비해 빅벨리해마는 생리활성 연구가 많이 부족한 상황이다. 따라서 이 연구에서는 소화효소 2종(trypsin, pepsin) 과식품용 가수분해 효소 5종(neutrase, protamex, alcalase, koji- zyme, flavourzyme)을 이용한 빅벨리해마 가수분해물들의 제조와 가수분해물 유래의 각 분자량별 분획물을 이용해 염증을 유발하고 세포 내 조직을 손상시키며, 노화와 암, 당뇨, 뇌졸증, 동맥경화, 심혈관 질환, 빈혈, 위궤양, 치매 등의 질병을 야기하는 원인으로 알려져 있는 자유 라디칼에(Beckman et al., 1990; Cho et al., 2012; Heo et al., 2005; Ahn et al., 2007; Park et al.,2004) 대한 소거능을 확인함으로써 해마의 항산화 활성을 평가하고자 한다.
- 이와 같은 결과는 DP의 각 분자량별 분획물 중 저분자 분획물에 뛰어난 alkyl radical 소거능이 확인되어 DP의 저분자 펩타이드가 활성을 나타냄을 제시한다. 다른 연구들에서도 이와 비슷한 결과들을 확인할 수 있었으며(Ko et al.
제안 방법
- 8 mL를 맞추고 농도별(25, 50, 100, 200 µg/mL) 시료를 100 µL씩 처리하였다. 1시간 노출시킨 후 15 mM 농도의 AAPH를 100 µL 처리하였고 이후 생존율 변화를 관찰하였다. 대조 구는 시료처리 없이 산화적 스트레스만 유발시킨 실험군과 산화적스트레스를 유도시키지 않은 실험군으로 하였다.
- ,2014). 7-9 hpf (hours post-fertilization)에 zebrafish embryo 를 12 well plates에 각각 15마리씩 넣어준 뒤 embryo medium 1.8 mL를 맞추고 농도별(25, 50, 100, 200 µg/mL) 시료를 100 µL씩 처리하였다. 1시간 노출시킨 후 15 mM 농도의 AAPH를 100 µL 처리하였고 이후 생존율 변화를 관찰하였다.
- 7종의 단백질 효소 가수분해물의 총 단백질의 함량은 Pierce® BCA protein assay kit를 사용하여 측정하였고, 단백질의 정량의 표준물질은 BSA를 사용하였다.
- Alkyl radical 소거활성에 대한 해마 단백질 효소 가수분해물들의 효과를 평가하였다. 이 중 우수한 활성을 가진 추출물의 IC50값(mg/mL)을 산출한 결과 DP가 0.
- 각 추출조건에 따른 효소가수분해물의 수율은 단백질 효소 가수분해 후 얻어진 가수분해물 일부의 무게를 100℃ 드라이 오븐에서 수분을 제거한 나머지 고형분 함량을 기준으로 수율을 측정하였다. 7종의 단백질 효소 가수분해물의 총 단백질의 함량은 Pierce® BCA protein assay kit를 사용하여 측정하였고, 단백질의 정량의 표준물질은 BSA를 사용하였다.
- 이 후 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며 2 mg/mL 농도의 MTT를 50 µL처리하였다. 그리고 37℃ 에서 3시간 배양하고 형성된 불용성 결정을 dimethylsufoxide (DMSO)로 완전히 녹인 후에 빛을 차단시켜 12시간 보관 후에 ELISA reader를 사용하여 540 nm 흡광도에서 측정한 뒤 값을 구하였다.
- 1시간 노출시킨 후 15 mM 농도의 AAPH를 100 µL 처리하였고 이후 생존율 변화를 관찰하였다. 대조 구는 시료처리 없이 산화적 스트레스만 유발시킨 실험군과 산화적스트레스를 유도시키지 않은 실험군으로 하였다.
- 대조구는 시료처리 없이 산화적 스트레스만 유도시킨 실험군과 산화적 스트레스를 유도시키지 않은 실험군으로 구분하였다.
- 4C). 세포에서의 결과도 앞에 ESR을 이용한 alkyl radical 소거능 결과와 마찬가지로 저분자 분획물이 항산화 활성을 갖음을 확인했고, DP의 우수한 항산화 활성을 in vivo에서도 확인하기 위해 연구를 진행함에 있어 ≤5 kDa의 분획물을 사용하여 zebrafish embryo 실험에 임하였다.
- 준하여 측정하였다. 수분함량은 105℃ 건조기에 24시간 유지하여 측정하였으며, 회분은 직접회화법으로 회분기를 이용하여 550℃에서 3시간 동안 회화한 뒤 측정하였다. 조단백은 Kjeldahl 법으로 측정 하였으며, 조지방은 Soxhlet 추출법을 이용하여 측정하였다.
- 2A에 나타내었다. 시료를 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL의 농도로 각각 처리하여 독성이 없음을 확인하였고, 독성이 없는 농도를 이용해 4 mM AAPH로 산화적 스트레스를 유도하여 세포생존률을 확인하였다. DP는 농도 의존적으로 AAPH 산화에 의한 세포 보호효과를 확인할 수 있었으며 (Fig.
- 0으로 조정해 주었다. 이 후 20분간 원심분리한 뒤 잔사를 제외한 상층액을 pore size 7 μm의 여과지를 사용하여 추출물을 여과하고 동결건조 후 분말화하여 최종적으로 7종의 단백질 효소가수분해물을 얻었다.
- 그 다음 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며 2 mg/mL 농도의 MTT를 50 µL 처리하였다. 이후 37℃ 인큐베이터에서 3시간 반응시키고, 37℃에서 3시간 배양한 후 형성된 불용성 결정을 DMSO로 완전히 녹여 빛을 차단시키고 12시간 보관 후에 ELISA reader를 사용하여 540 nm 흡광도에서 측정한 뒤 값을 구하였다.
- (2013)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 시료 20 µL, DW 20 µL, 40 mM AAPH 20 µL, 40 mM 4-POBN 20 µL를 혼합 후 37℃에서 30 분간 반응시킨 다음 capillary tube에 옮겨 전자스핀공명; Elec- tron spin resonance (JES-FA ESR, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 signal 값을 구하였다. 대조구는 시료 대신 용매인 DW 를 사용하였으며 분석조건은 다음과 같이 하였다.
- 해마 동결건조물을 이용하여 효소 대 기질비를 1:100 으로 하였으며, 각 효소별 최적온도 및 pH 조건에 따라 24시간 가수분해를 진행하였다. 한편 가수분해 수율을 높일 목적으로 DW 24시간 추출을 먼저 진행 한 후 pepsin과 trypsin을 각각 12시간 가수분해를 진행하여 DW-pepsin 가수분해물(DP) 와 DW-trypsin 가수분해물(DT)를 추가적으로 제조하였다. 가수분해를 정지시키기 위해 100℃에서 10분간 효소의 반응을 불활성화시킨 후 pH를 7.
- (2013)의 방법에 따라 제조되었고, 가수분해 효소 7종을 이용하여 해마의 효소적 가수분해물을 제조하여 물(distilled water, DW) 추출물과 비교하였다. 해마 동결건조물을 이용하여 효소 대 기질비를 1:100 으로 하였으며, 각 효소별 최적온도 및 pH 조건에 따라 24시간 가수분해를 진행하였다. 한편 가수분해 수율을 높일 목적으로 DW 24시간 추출을 먼저 진행 한 후 pepsin과 trypsin을 각각 12시간 가수분해를 진행하여 DW-pepsin 가수분해물(DP) 와 DW-trypsin 가수분해물(DT)를 추가적으로 제조하였다.
대상 데이터
- (Denmark)에서 구입하였다. 2, 2-azobis-(2- amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), α-(4-Pyridyl-1- oxide)-N-tert-butylnitrone (4-POBN), 3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2, 7-dichlo- rofluorescein diacetate (DCF-DA), sodium dodecyl sulfate (SDS), dimethyl sulfoxide (DMSO), bovine serum albumin (BSA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여사용하였다. Pierce® BCA protein assay kit는 Thermo Scien- tific™ (Rockford, IL, USA)에서 구입하여 사용하였고 RPMI 1640 배지와 fetal bovine serum (FBS)는 Gibco/BRL (Cana-da)에서 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여사용하였다. Pierce® BCA protein assay kit는 Thermo Scien- tific™ (Rockford, IL, USA)에서 구입하여 사용하였고 RPMI 1640 배지와 fetal bovine serum (FBS)는 Gibco/BRL (Cana-da)에서 구입하여 사용하였다. 이 밖에 모든 기타 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.
- Vero cell은 10% FBS, 1% antibiotic을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 배양 하였다. Cell culture flask에 적정농도로 37℃, 5% CO2 조건에서 세포상태에 따라 2-3일간 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
- 1)를제공 받았고, 동결건조 된 해마는 분쇄 후 사용되었다. 단백질 효소 가수분해에 사용된 소화효소 2종(trypsin, pepsin)은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였으며 식품용 가수분해 효소 5종(neutrase, protamex, alcalase, kojizyme, flavourzyme) 은 Novozyme Co. (Denmark)에서 구입하였다. 2, 2-azobis-(2- amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), α-(4-Pyridyl-1- oxide)-N-tert-butylnitrone (4-POBN), 3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2, 7-dichlo- rofluorescein diacetate (DCF-DA), sodium dodecyl sulfate (SDS), dimethyl sulfoxide (DMSO), bovine serum albumin (BSA)는 Sigma-Aldrich (St.
- 즉, 시료 20 µL, DW 20 µL, 40 mM AAPH 20 µL, 40 mM 4-POBN 20 µL를 혼합 후 37℃에서 30 분간 반응시킨 다음 capillary tube에 옮겨 전자스핀공명; Elec- tron spin resonance (JES-FA ESR, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 signal 값을 구하였다. 대조구는 시료 대신 용매인 DW 를 사용하였으며 분석조건은 다음과 같이 하였다.
- 본 실험에서 사용한 해마는 제주에 위치한 한국해수관상어종묘센터(CCORA)에서 약 20 cm 크기의 빅벨리해마(Fig. 1)를제공 받았고, 동결건조 된 해마는 분쇄 후 사용되었다. 단백질 효소 가수분해에 사용된 소화효소 2종(trypsin, pepsin)은 Sigma Chemical Co.
- 이 결과는 앞에 수율과 단백질 함량의 결과와도 관련이 있다. 수율과 단백질 함량이 높았던 DP가 활성 저분자 펩타이드의 양이 많이 함유한다는 것을 암시하며, 따라서 수율과 단백질 함량이 높고, alkyl radical 소거능이 우수한 DP를 이용하여 이후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계처리는 각각의 시료에 대한 평균±표준편차로 나타내었다. SPSS 프로그램(SPSS Inc. Ver. 12.0)을 사용하여 Oneway ANOVA-test를 실시하여 조사 항목들 간의 유의성 검증은 Turkey’s multiple range test로 P<0.05 수준에서 실시하였다.
- 실험결과의 통계처리는 각각의 시료에 대한 평균±표준편차로 나타내었다. SPSS 프로그램(SPSS Inc.
이론/모형
- AAPH로 세포에 산화적 스트레스를 유도하였을 때의 해마 가수분해물의 보호효과에 대한 활성을 확인하기 위해 Ko et al. (2012)의 방법을 따라 AAPH 자극을 주어 시료처리에 대한 세포 생존력을 측정하였다. 먼저 1×105 세포농도의 vero cells을만들어 96 wellplate에 180 µL를 seeding하였고, 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며 시료를 농도 별로 처리하였다.
- 가수분해물들의 alkyl radical 소거능은 Kang et al. (2013)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 시료 20 µL, DW 20 µL, 40 mM AAPH 20 µL, 40 mM 4-POBN 20 µL를 혼합 후 37℃에서 30 분간 반응시킨 다음 capillary tube에 옮겨 전자스핀공명; Elec- tron spin resonance (JES-FA ESR, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 signal 값을 구하였다.
- 산화적 스트레스를 유도하였을 때 해마 가수분해물에 의한 ROS 소거능을 확인하기 위해 Ko et al. (2012)의 방법을 따라 AAPH 자극을 주어 ROS의 변화를 측정하였다. 먼저 1×105 세포농도의 vero cells을 만들어 96 wellplate에 180 µL를 분주하였고, 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하여 시료들을 농도별로 처리하였다.
- 시료에 대한 세포독성을 확인하기 위해 Ko et al. (2012)의 방법을 따라 MTT assay 방법으로 측정하였다. 먼저 Vero cells (1×105 cells/mL)으로 96 wellplate에 190 µL를 분주하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하여 시료들을 농도 별로 처리하였다.
- 수분함량은 105℃ 건조기에 24시간 유지하여 측정하였으며, 회분은 직접회화법으로 회분기를 이용하여 550℃에서 3시간 동안 회화한 뒤 측정하였다. 조단백은 Kjeldahl 법으로 측정 하였으며, 조지방은 Soxhlet 추출법을 이용하여 측정하였다.
- 해마 건조 시료의 일반성분은 AOAC (Helrich, 1990) 방법에 준하여 측정하였다. 수분함량은 105℃ 건조기에 24시간 유지하여 측정하였으며, 회분은 직접회화법으로 회분기를 이용하여 550℃에서 3시간 동안 회화한 뒤 측정하였다.
- 해마의 단백질 효소 가수분해물은 Ko et al. (2013)의 방법에 따라 제조되었고, 가수분해 효소 7종을 이용하여 해마의 효소적 가수분해물을 제조하여 물(distilled water, DW) 추출물과 비교하였다. 해마 동결건조물을 이용하여 효소 대 기질비를 1:100 으로 하였으며, 각 효소별 최적온도 및 pH 조건에 따라 24시간 가수분해를 진행하였다.
성능/효과
- 4B). 4 mM AAPH로산화적 스트레스를 유도하여 분자량별 분획물을 50 μg/mL, 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때, Vero cells에서 Total ROS 생성이 농도의존적으로 감소하는 경향이 확인되었고, ≤5 kDa 의 분획물의 100 μg/mL 농도 처리에 의해 Total ROS 생성이 61.01±0.49%로 감소하였다. 또한 펩신 가수분해물이 저분 자화 됨에 따라 ≤5 kDa의 분획물이 Total ROS 생성을 가장 많이 감소시키는 것을 확인하였다(Fig.
- MTT assay를 통하여 세포생존율을 측정한 결과 ≥10 kDa, 5-10 kDa, ≤5 kDa의 각 분획물을 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 처리하였을 때, Vero cells에 대한 세포독성은 나타나지 않았다. 4 mM AAPH의 산화적 스트레스를 유도하였을 때 각 분획물을 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 Vero cells 에 세포생존률을 측정한 결과, Vero cells의 생존률이 농도 의존적으로 증가하는 경향을 확인하였다. 펩신 가수분해물이 저분 자화 됨에 따라 세포생존률이 증가하는 경향을 확인하였고, ≤5 kDa의 Fration의 100 μg/mL 농도 처리에 의해 세포생존률이 77.
- 70% epiboly 단계의 zebrafish embryo에 15 mM AAPH의 산화적 스트레스를 유도하여 경과시간에 따른 zebrafish embryo 의 생존율을 측정한 결과, 산화적 스트레스 유도 후 3시간이 경과하여 DP를 50, 200 μg/mL 농도 처리했을 때 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 경향이 확인 되었으며, 24시간, 48시간, 72 시간으로 경과함에도 이러한 경향은 유지되었다. 산화적 스트레스를 입지 않은 대조구와 산화적 스트레스를 입은 대조 구를 비교하였을 때 200 μg/mL의 농도처리는 약 50%에 가까운 생존율을 유지시켜 주는 것으로 확인되었으며 이로부터 펩신 가수분해물의 ≤ 5 kDa 분획물이 AAPH로 유도된 산화적 스트레스로 인한 보호효과가 확인되었다.
- 시료를 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL의 농도로 각각 처리하여 독성이 없음을 확인하였고, 독성이 없는 농도를 이용해 4 mM AAPH로 산화적 스트레스를 유도하여 세포생존률을 확인하였다. DP는 농도 의존적으로 AAPH 산화에 의한 세포 보호효과를 확인할 수 있었으며 (Fig. 2B), AAPH로 세포에 자극을 주고 세포 내 AAPH 산화에의 한 ROS 생성 정도를 측정한 결과, 농도의존적으로 AAPH에의한 세포의 ROS 생성을 줄여 주는 것을 확인하였다(Fig. 2C).
- 사용하여 나누었다. DP를 5 kDa과 10 kDa의 크기 막으로 가수분해물을 ≥ 10 kDa, 5-10 kDa, ≤ 5 kDa의 각 분획물로 분배하였고, Fig. 3A의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 통해 해마 펩신 가수분해물과 가수분해물의 각 분자량별 분획물의 분자량 크기에 따라 다양한 밴드 패턴이 나타나 분자량별로 분획물이 잘 분리된 것을 확인하였다. 각 분획물들 중, ≤ 5 kDa 분획물이 가장 강한 alkyl radical 소거능을 확인할 수 있었고 IC50 값은 0.
- 효소 가수분해물 중 우수 효소 가수분해물인 DP는 Vero Cells에 대한 세포독성이 없이 농도의존적으로 ROS 생성을 감소시켰고, AAPH에 대한 산화반응을 억제 함으로서 항산화 효능을 가진다는 것을 확인하였다. DP를 한외여과막을 통해각 분자량 별로 분획물을 나누고, alkyl 라디칼 소거능을 확인하였을 때, 저분자량인 ≤ 5 kDa의 분획물이 가장 우수한 라디칼 소거 능을 보였고, vero cells에 대한 세포독성을 보이지 않는 농도들에서 농도의존적으로 ROS 생성과 AAPH에 대한 산화 억제 효과를 보임으로 저분자량의 DP 분획물이 항산화 효능을 가진다는 것을 확인하였다. 또한, ≤ 5 kDa의 분획물은 AAPH가감소시킨 zebrafish embryo의 생존율을 향상시켰다는 것을 확인하였다.
- 54 mg였으나, 7 종의 단백질 효소 가수분해를 이용하여 효소 가수분해물을 제조한 경우, 증가된 수율을 확인할 수 있었다. DP에 경우 다른 단백질 효소 가수분해물에 비해 가장 높은 786.67±15.28 mg 의 수율을 확인하였고, DT의 경우 이보다 낮은 520.00±25.17 mg의 수율을 확인할 수 있었다(Table 2). 식품용 가수분해 효소 5종을 이용한 효소 가수분해물에서는 전반적으로 높은 수율을 확인할 수 있었다.
- , 2006). DW로 24시간 추출한 추출물의 수율은 1 g의 건조해마로부터 374.5±3.54 mg였으나, 7 종의 단백질 효소 가수분해를 이용하여 효소 가수분해물을 제조한 경우, 증가된 수율을 확인할 수 있었다. DP에 경우 다른 단백질 효소 가수분해물에 비해 가장 높은 786.
- 4A에 나타내었다. MTT assay를 통하여 세포생존율을 측정한 결과 ≥10 kDa, 5-10 kDa, ≤5 kDa의 각 분획물을 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 처리하였을 때, Vero cells에 대한 세포독성은 나타나지 않았다. 4 mM AAPH의 산화적 스트레스를 유도하였을 때 각 분획물을 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 Vero cells 에 세포생존률을 측정한 결과, Vero cells의 생존률이 농도 의존적으로 증가하는 경향을 확인하였다.
- 3A의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 통해 해마 펩신 가수분해물과 가수분해물의 각 분자량별 분획물의 분자량 크기에 따라 다양한 밴드 패턴이 나타나 분자량별로 분획물이 잘 분리된 것을 확인하였다. 각 분획물들 중, ≤ 5 kDa 분획물이 가장 강한 alkyl radical 소거능을 확인할 수 있었고 IC50 값은 0.15±0.01 mg/mL으로 확인되었다(Fig. 3B).
- 0 mg의 수율을 확인할 수 있었다(Table 2). 또한 동결건조된 해마 조시료 1 g으로부터 얻을 수 있는 총 단백질은 DW로 24시간을 추출한 추출물이 93.38±3.04 mg으로 확인되었으며, 그 외 모든 효소 가수분해물들에서는 DW로 24시간을 추출한 추출물 대비 약 2배 가량 높은 총 단백질을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다(Table 2). 소화효소를 이용하여 가수분해한 효소 가수분해물에서는 DP 효소 가수분해물이 221.
- 49%로 감소하였다. 또한 펩신 가수분해물이 저분 자화 됨에 따라 ≤5 kDa의 분획물이 Total ROS 생성을 가장 많이 감소시키는 것을 확인하였다(Fig. 4C). 세포에서의 결과도 앞에 ESR을 이용한 alkyl radical 소거능 결과와 마찬가지로 저분자 분획물이 항산화 활성을 갖음을 확인했고, DP의 우수한 항산화 활성을 in vivo에서도 확인하기 위해 연구를 진행함에 있어 ≤5 kDa의 분획물을 사용하여 zebrafish embryo 실험에 임하였다.
- DP를 한외여과막을 통해각 분자량 별로 분획물을 나누고, alkyl 라디칼 소거능을 확인하였을 때, 저분자량인 ≤ 5 kDa의 분획물이 가장 우수한 라디칼 소거 능을 보였고, vero cells에 대한 세포독성을 보이지 않는 농도들에서 농도의존적으로 ROS 생성과 AAPH에 대한 산화 억제 효과를 보임으로 저분자량의 DP 분획물이 항산화 효능을 가진다는 것을 확인하였다. 또한, ≤ 5 kDa의 분획물은 AAPH가감소시킨 zebrafish embryo의 생존율을 향상시켰다는 것을 확인하였다. 이 모든 결과로부터, 빅벨리해마 유래 DP 가수분해물은 항산화 효과를 가지며, 향후 기능성 화장품 소재나 식품으로 활용하기 위한 매우 효과적인 재료가 될 수 있다고 판단된다.
- 경과함에도 이러한 경향은 유지되었다. 산화적 스트레스를 입지 않은 대조구와 산화적 스트레스를 입은 대조 구를 비교하였을 때 200 μg/mL의 농도처리는 약 50%에 가까운 생존율을 유지시켜 주는 것으로 확인되었으며 이로부터 펩신 가수분해물의 ≤ 5 kDa 분획물이 AAPH로 유도된 산화적 스트레스로 인한 보호효과가 확인되었다. 이와 같은 결과는 in vivo 모델 zebrafish embryo에서 DP 저분자 분획물의 AAPH 산화 보호 효과를 확인함으로써 해마 가수분해물이 동물 모델에서도 항산화 활성이 있음을 제시한다.
- 04 mg으로 확인되었으며, 그 외 모든 효소 가수분해물들에서는 DW로 24시간을 추출한 추출물 대비 약 2배 가량 높은 총 단백질을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다(Table 2). 소화효소를 이용하여 가수분해한 효소 가수분해물에서는 DP 효소 가수분해물이 221.21±7.02 mg의 총 단백질을 얻을 수 있는 것으로 확인되었고, 식품용 가수분해 효소 5종을 이용한 효소 가수분해물에서는 전반적으로 높은 총 단백질을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다(Table 2). 이와 같은 결과는 가수분해물의 수율이 높을 수록 단백질 함량도 높은 것이 확인되어 DW 추출물에 비해 수율과 단백질 함량이 높았던 DP와 DT, 식품용 가수분해 효소 5종에서 가수분해가 많이 진행되었고 그에 따라 많은 양의 저분자 펩타이드가 함유되어 있을 것으로 사료된다.
- 식품용 가수분해 효소 5종을 이용한 효소 가수분해물에서는 전반적으로 높은 수율을 확인할 수 있었다. 이 중 DP와 대등하게 높은 수율을 보인 효소 가수분해물은 neutrase로 가수분해한 효소 가수분해물과 alcalase로 가수분해한 효소 가수분해물로 확인 되었으며, 각각 783.33±20.0 mg, 780.00±10.0 mg의 수율을 확인할 수 있었다(Table 2). 또한 동결건조된 해마 조시료 1 g으로부터 얻을 수 있는 총 단백질은 DW로 24시간을 추출한 추출물이 93.
- 효과를 평가하였다. 이 중 우수한 활성을 가진 추출물의 IC50값(mg/mL)을 산출한 결과 DP가 0.15±0.00 mg/mL, DT 가 0.15±0.00 mg/mL, Neutrase로 가수분해한 효소 가수분해물이 0.18±0.16 mg/mL으로 확인되었으며, DP와 DT가 전체가수분해물 중 가장 우수한 alkyl radical 소거활성을 나타내는 것을 확인하였다(Table 2). 이 결과는 앞에 수율과 단백질 함량의 결과와도 관련이 있다.
- 산화적 스트레스를 입지 않은 대조구와 산화적 스트레스를 입은 대조 구를 비교하였을 때 200 μg/mL의 농도처리는 약 50%에 가까운 생존율을 유지시켜 주는 것으로 확인되었으며 이로부터 펩신 가수분해물의 ≤ 5 kDa 분획물이 AAPH로 유도된 산화적 스트레스로 인한 보호효과가 확인되었다. 이와 같은 결과는 in vivo 모델 zebrafish embryo에서 DP 저분자 분획물의 AAPH 산화 보호 효과를 확인함으로써 해마 가수분해물이 동물 모델에서도 항산화 활성이 있음을 제시한다.
- 02 mg의 총 단백질을 얻을 수 있는 것으로 확인되었고, 식품용 가수분해 효소 5종을 이용한 효소 가수분해물에서는 전반적으로 높은 총 단백질을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다(Table 2). 이와 같은 결과는 가수분해물의 수율이 높을 수록 단백질 함량도 높은 것이 확인되어 DW 추출물에 비해 수율과 단백질 함량이 높았던 DP와 DT, 식품용 가수분해 효소 5종에서 가수분해가 많이 진행되었고 그에 따라 많은 양의 저분자 펩타이드가 함유되어 있을 것으로 사료된다.
- 4 mM AAPH의 산화적 스트레스를 유도하였을 때 각 분획물을 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 Vero cells 에 세포생존률을 측정한 결과, Vero cells의 생존률이 농도 의존적으로 증가하는 경향을 확인하였다. 펩신 가수분해물이 저분 자화 됨에 따라 세포생존률이 증가하는 경향을 확인하였고, ≤5 kDa의 Fration의 100 μg/mL 농도 처리에 의해 세포생존률이 77.17±2.12%로 증가하였다(Fig. 4B). 4 mM AAPH로산화적 스트레스를 유도하여 분자량별 분획물을 50 μg/mL, 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때, Vero cells에서 Total ROS 생성이 농도의존적으로 감소하는 경향이 확인되었고, ≤5 kDa 의 분획물의 100 μg/mL 농도 처리에 의해 Total ROS 생성이 61.
- 해마의 조단백질의 함량으로 58.47%을 확인하여 해마의 대부분이조 단백질로 이루어짐을 확인하였다.
- 효소 가수분해물 중 우수 효소 가수분해물인 DP는 Vero Cells에 대한 세포독성이 없이 농도의존적으로 ROS 생성을 감소시켰고, AAPH에 대한 산화반응을 억제 함으로서 항산화 효능을 가진다는 것을 확인하였다. DP를 한외여과막을 통해각 분자량 별로 분획물을 나누고, alkyl 라디칼 소거능을 확인하였을 때, 저분자량인 ≤ 5 kDa의 분획물이 가장 우수한 라디칼 소거 능을 보였고, vero cells에 대한 세포독성을 보이지 않는 농도들에서 농도의존적으로 ROS 생성과 AAPH에 대한 산화 억제 효과를 보임으로 저분자량의 DP 분획물이 항산화 효능을 가진다는 것을 확인하였다.
후속연구
- 또한, ≤ 5 kDa의 분획물은 AAPH가감소시킨 zebrafish embryo의 생존율을 향상시켰다는 것을 확인하였다. 이 모든 결과로부터, 빅벨리해마 유래 DP 가수분해물은 항산화 효과를 가지며, 향후 기능성 화장품 소재나 식품으로 활용하기 위한 매우 효과적인 재료가 될 수 있다고 판단된다.
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