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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 해마를 효소를 이용하여 해마 단백질을 가수분해하고 그렇게 얻은 해마 단백질 유래 효소 가수분해물의 에탄올에 의해 유도된 간 손상 보호 효과를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 9 g/body weight의 농도로 4주간 매일 같은 시간에 1회 투여하였다. 7일마다 실험동물의 체중과 사료 섭취량을 측정하였다.
- 투여 방법은 급성 알코올 독성 유도 실험과 동일하게 수행하고 투여량을 달리하였다. ALC를 25 mg/body weight의 농도로, 에탄올은 0.9 g/body weight의 농도로 4주간 매일 같은 시간에 1회 투여하였다. 7일마다 실험동물의 체중과 사료 섭취량을 측정하였다.
- ALC의 TGF-β에 의한 간 손상 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다.
- Chang 세포에서 ALC의 처리가 세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 수행하여 세포생존율을 측정하였다(Fig. 1A). 실험 결과 ALC는 수행된 모든 농도(0.
- GOT · GPT 측정 Kit (Asan, Korea)를 사용하여 GOT와 GPT 활성을 측정하였다.
- 합성된 cDNA는 −20 ℃에 냉동보관하며 사용하였으며 중합효소 연쇄반응에 이용하였다. 각 유전자의 발현양은 GAPDH 발현양을 기준으로 정량 분석하였다.
- 알코올 중독이 되면 환자들의 식이섭취량이 유의적으로 감소되고 다른 영양소의 흡수가 저하되어 영양 결핍으로 인해 체중이 감소된다는 보고가 있으며(Mezey 1980; Scheig 1970), 알코올을 과량으로 섭취 시 열 발생으로 인한 에너지 소모가 증가되기 때문에 체중이 감소되는 현상이 발생한다는 연구 결과가 있다(Pikaar 등, 1987). 따라서 4주간 ALC (25 mg/kg body weight)와 에탄올(0.9 g/body weight)을 투여하여 만성 알코올 독성을 유도하고 실험기간 동안 7일마다 실험동물의 체중과 사료 섭취량을 측정하였다(Fig. 4A, B). 4주간의 체중 변화는 정상군이 마리 당 평균 2.
- 간성상세포가 활성화되어 있는 동안 발현된다고 알려진 α-SMA와 vimentin의 mRNA 발현을 확인하였다(Friedman 2008). 또한 EMT marker인 slug를 확인하였다. EMT는 상피세포(epithelial cell)가 전이능력과 침윤능력을 보유하는 세포인 간엽세포(mesenchymal cell)로 분화하는 과정이다.
- 실험을 수행하기 위하여 무작위로 정상군 5마리, 알코올 투여군 10마리, ALC 투여군 10마리로 그룹을 나누어 실험을 수행하였다. 먼저 정상군과 알콜투여군에 생리식염수를 투여하고, ALC 투여 군에는 ALC (50 mg/kg body weight)을 경구투여 후 30분 뒤에, 정상군에는 생리식염수를, 나머지 두 그룹에는 에탄올(2 g/kg body weight)을 일주일 간 같은 시간에 매일 1회 투여하였다.
- 5×104 cell/mL의 농도로 200 μL씩 96 well plate에 분주하여 37 ℃, 5 % CO2 incubator에서 배양하였다. 분주 16시간 후에 ALC를 농도별로 처리하여 24시간 후 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 배양액 제거 후 MTT 용액을 4시간 동안 처리한 다음 150 μL DMSO에 30분간 녹여 분광광도계를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 실험 동물의 간 중량 측정을 위하여 급성 알코올 독성 유도 실험의 경우 투여 처리기간인 1주 후, 만성 알코올 독성 유도 실험의 경우 4주 후 마취하고 심장 채혈한 후 간을 적출하였다. 적출한 간은 생리식염수로 세척한 다음 수분을 제거하고 중량을 측정하였다.
- 실험수행을 위해 동물을 무작위로 정상군, 알코올 투여군, ALC 투여 군에 각 10마리씩으로 나누어 실험을 수행하였다. 투여 방법은 급성 알코올 독성 유도 실험과 동일하게 수행하고 투여량을 달리하였다.
- 실험을 수행하기 위하여 무작위로 정상군 5마리, 알코올 투여군 10마리, ALC 투여군 10마리로 그룹을 나누어 실험을 수행하였다. 먼저 정상군과 알콜투여군에 생리식염수를 투여하고, ALC 투여 군에는 ALC (50 mg/kg body weight)을 경구투여 후 30분 뒤에, 정상군에는 생리식염수를, 나머지 두 그룹에는 에탄올(2 g/kg body weight)을 일주일 간 같은 시간에 매일 1회 투여하였다.
- 이에 ALC의 간 보호 효능을 확인하기 위해 Chang 세포에 ALC를 2시간동안 전처리 하고 TGF-β (10 ng/mL)를 24시간 처리하여 RT-PCR을 통해 유전자 발현 정도를 확인하였다(Fig. 2).
- 일주일 간 ALC (50 mg/kg body weight)와 에탄올(2 g/body weight)을 투여하여 간 독성을 유도한 후 간을 적출하고 그 무게를 확인하였다(Fig. 3A). 그 결과 정상군의 평균 간 무게(1.
- 실험 동물의 간 중량 측정을 위하여 급성 알코올 독성 유도 실험의 경우 투여 처리기간인 1주 후, 만성 알코올 독성 유도 실험의 경우 4주 후 마취하고 심장 채혈한 후 간을 적출하였다. 적출한 간은 생리식염수로 세척한 다음 수분을 제거하고 중량을 측정하였다.
- 정량 결과를 통해 0.9 μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
- 실험수행을 위해 동물을 무작위로 정상군, 알코올 투여군, ALC 투여 군에 각 10마리씩으로 나누어 실험을 수행하였다. 투여 방법은 급성 알코올 독성 유도 실험과 동일하게 수행하고 투여량을 달리하였다. ALC를 25 mg/body weight의 농도로, 에탄올은 0.
- 해마 원료에 단백질 가수분해 효소인 alcalase (Novozymes, Denmark)를 이용하여 50 ℃ pH 8.0 조건 하에 24시간 동안 가수분해를 진행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 normal liver cell line인 Chang 세포는 10 % fetal bovine serum (FBS)와 1 % penicillin/streptomycin(P/S)이 첨가된 Roswell Park Memorial Institute medium을 이용하여 배양하였고, 간암세포주 Huh7은 10 % FBS와 1 % P/S이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium을 사용하였으며 37℃, 5 % CO2 incubator에 배양하였다.
- 본 실험을 위하여 오리엔트바이오(Korea)로부터 5주령 ICR mice 수컷 55마리를 구입하여 사용하였다. 실험기간 동안 사육실의 온도는 24 ℃, 습도는 50 %를 유지하였으며 조명은 12시간을 주기로 하였다.
이론/모형
- ALC의 세포 독성은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. Chang 세포를 2.
- 배양액 제거 후 MTT 용액을 4시간 동안 처리한 다음 150 μL DMSO에 30분간 녹여 분광광도계를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 에탄올 독성 억제효과는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 세포를 96 well plate에 2.
성능/효과
- α-SMA, vimentin, slug의 유전자 발현 정도를 확인한 결과, TGF-β에 의해 증가된 vimentin, α-SMA, slug가 ALC 투여에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 실험 결과, 에탄올 처리에 의해 감소된 세포생존율이 ALC 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 0.1 mg/mL의 농도에서부터 유의적으로 증가하였으며 1 mg/mL의 농도에서는 대조군과 유사한 수준까지 세포생존율이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 ALC가 Huh7 세포를 에탄올 독성으로부터 보호하는 것을 확인하였다.
- 4A, B). 4주간의 체중 변화는 정상군이 마리 당 평균 2.5 g이 증가한 반면 대조군은 평균 1 g 증가하여 정상군에 비해 현저히 감소된 체중 증가량을 보여주었다. 반면 ALC 투여군은 마리 당 평균 2.
- 3B, C), GPT와 GOT 모두 정상군에 비해 대조군에서 유의적으로 증가하여 간조직에 손상이 발생함을 확인할 수 있었다. GPT 함량은 알코올 투여군과 비교하여 ALC 투여군에서 유의적 감소를 확인하였다. 간 중량과 GOT 함량은 알코올 투여군에 비해 유의적 차이는 보이지 않았다.
- In vitro에서 ALC가 에탄올에 의해 유도된 독성과 TGF-β에 의한 간 손상을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, in vivo를 통해서도 ALC 처리에 의해 급성 알코올 독성과 만성 알코올 독성으로 인한 간 손상이 약화되는 것을 확인하였다.
- 간 무게를 측정한 결과(Fig. 4C), 대조군의 간 무게(0.8±0.14 g)가 정상군(1.04±0.19 g)에 비해 유의적으로 감소된 것을 통해 만성 알코올 간 독성이 유도된 것을 확인하였다.
- 그 결과 정상군의 평균 간 무게(1.06±0.05 g)에 비해 알코올만 투여한 대조군의 평균 간 무게(0.6±0.19 g)가 유의성 있게 감소하였고 ALC 군(0.82±0.15 g)은 대조군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었다.
- 간 중량과 GOT 함량은 알코올 투여군에 비해 유의적 차이는 보이지 않았다. 그러나, 알코올 투여군에 비해 증가된 간 중량과 감소된 GPT 함량으로 볼 때 ALC 투여가 알코올 섭취로 인한 간 독성 예방에 효과가 있음을 추측할수 있었다.
- 1 mg/mL의 농도에서부터 유의적으로 증가하였으며 1 mg/mL의 농도에서는 대조군과 유사한 수준까지 세포생존율이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 ALC가 Huh7 세포를 에탄올 독성으로부터 보호하는 것을 확인하였다.
- 또한 ALC 투여군(0.94±0.096 g)은 대조군에 비해 유의적으로 증가된 것을 통해 알코올 투여로 유도된 간 독성이 ALC 투여에 의해 억제된 것을 확인할 수 있었다.
- 알코올의 만성적 투여는 왜소체 에탄올 산화체계(microsomal ethanol oxidizing system, MEOS)를 통해 알코올 산화가 증가되면서 활성산소인 O−2•, H2O2 및 OH• 생성되어 간세포의 손상이 발생하게 된다 (Lieber 1991). 비록 GOT에서 유의성을 관찰할 수 없었고 GPT 의 경우 ALC 투여에 의한 감소를 확인할 수 없었지만, 그 외의 실험동물의 체중, 사료 섭취량, 그리고 간 중량 결과를 종합해봤을 때, ALC 투여가 간을 알코올 독성으로부터 보호해주는 것을 확인할 수 있었다.
- 1A). 실험 결과 ALC는 수행된 모든 농도(0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 mg/mL)에서 세포 독성을 나타내지 않았으며 세포생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 1B). 실험 결과, 에탄올 처리에 의해 감소된 세포생존율이 ALC 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 0.
- 따라서 혈청 내의 GPT, GOT 활성 증가는 간 손상의 지표로 사용된다(Coudray 등, 1993). 실험 동물의 혈청 GPT와 GOT의 활성 측정 결과(Fig. 3B, C), GPT와 GOT 모두 정상군에 비해 대조군에서 유의적으로 증가하여 간조직에 손상이 발생함을 확인할 수 있었다. GPT 함량은 알코올 투여군과 비교하여 ALC 투여군에서 유의적 감소를 확인하였다.
- 6 g/day)에 비해 두 배 가까이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 위 결과는 알코올 투여 시 체중 및 식이섭취량이 감소되었다는 연구 결과와 일치하였으며(Scheig 1970), 위 결과를 통해 ALC 투여에 의해 알코올 독성에 따른 체중 감소가 억제된 것을 확인하였다.
- 식이섭취량 또한 체중과 유사한 경향을 보여주었다. 정상군(1.1 g/day)과 ALC (1.2 g/day)군이 대조군(0.6 g/day)에 비해 두 배 가까이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 위 결과는 알코올 투여 시 체중 및 식이섭취량이 감소되었다는 연구 결과와 일치하였으며(Scheig 1970), 위 결과를 통해 ALC 투여에 의해 알코올 독성에 따른 체중 감소가 억제된 것을 확인하였다.
- 혈청 GPT 및 GOT 활성을 측정결과(Fig. 4D, E), 대조군에서 정상군보다 감소된 GPT와 GOT를 확인할 수 있었다. 대조군과 ALC 군을 비교했을 때, GPT에 비해 GOT의 활성이 더 감소한 것을 관찰할 수 있었는데 이는 Soh 등(2003)과 Bae 등(2009)의 연구에서와 유사한 경향을 보여주었다.
후속연구
- 따라서 ALC의 간 보호 효과를 유추해볼 수 있었다. 그러나 동물실험에서 간 무게 변화나 GOT와 GPT 활성변화에서 통계적으로 유의성이 나타나지 않았기에 향 후 추가적인 연구가 필요할 것이라 사료된다.
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