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문제 정의
- 본 연구에서는 공기노출 및 절식 등의 요인에 따른 참담치의 생존 및 스트레스 정도를 관찰하는 연구의 일환으로 공기노출및 절식에 따른 참담치 치패의 폐사율 및 스트레스 관련 유전자인 Hsp70과 GST 단백질의 mRNA 유전자 발현을 조사하고자 한다. 본 연구를 통한 결과는 환경요인인 수온과 공기노출 및 절식과의 상관성을 밝히고 또한 참담치 스트레스 정도의 파악에 Hsp70 및 GST 유전자가 생체지표유전자 (Biomarker gene) 의 활용 가능성에 대해 알아보고자 한다.
- 본 연구에서는 공기노출 및 절식 등의 요인에 따른 참담치의 생존 및 스트레스 정도를 관찰하는 연구의 일환으로 공기노출및 절식에 따른 참담치 치패의 폐사율 및 스트레스 관련 유전자인 Hsp70과 GST 단백질의 mRNA 유전자 발현을 조사하고자 한다. 본 연구를 통한 결과는 환경요인인 수온과 공기노출 및 절식과의 상관성을 밝히고 또한 참담치 스트레스 정도의 파악에 Hsp70 및 GST 유전자가 생체지표유전자 (Biomarker gene) 의 활용 가능성에 대해 알아보고자 한다.
- 본 연구에서는 공기노출 및 절식과 관련하여 참담치의 폐사와 Hsp70 및 GST 유전자의 스트레스 관련 지표유전자로서의 가능성을 살펴보았다. 공기노출과 절식의 환경요인이 참담치를 비롯한 해양생물에 미치는 생체 내 기전 연구결과는 현재 미비한 상태이다.
제안 방법
- 내재표준유전자 β-actin의 PCR 조건은 pre-denaturation 95℃, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초, 24회; extension 72℃, 10분 수행하였다. PCR 수행을 위한 annealing 온도의 설정은 gradient PCR을 수행하여 최적의 온도를 선택하였으며, PCR 수행의 반복횟수는 각각 18회부터 32회 수행한 PCR 산물을 전기영동하여 PCR 산물의 포화상태가 이루어지기 전의 횟수를 선택하여 결정하였다. RT-PCR은 실험구당 3개의 total RNA를 이용하여 각각 3회 반복 수행하였다.
- PCR 수행을 위한 annealing 온도의 설정은 gradient PCR을 수행하여 최적의 온도를 선택하였으며, PCR 수행의 반복횟수는 각각 18회부터 32회 수행한 PCR 산물을 전기영동하여 PCR 산물의 포화상태가 이루어지기 전의 횟수를 선택하여 결정하였다. RT-PCR은 실험구당 3개의 total RNA를 이용하여 각각 3회 반복 수행하였다. 증폭된 PCR산물은 ethidiumbromide (100 ng/ml) 가 포함된 2% 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인하였으며 band intensity는 Gel DocTM XR+ System (Bio-Rad, California, USA) 을 이용하여 분석하였다.
- 침지시킨 조직은 마이크로 튜브에 넣은 후에 실험에 사용하기 전까지 - 80℃ 초저온냉동고에 보관하였다. Total RNA의 추출은 RNAiso Plus (TaKaRa Co. Shiga, Japan) 시약 용액을 이용하여 제조사가 준비하고 제시한 방법에 따라 시행하였다. 추출한 total RNA는 분광광도계 (NanoVue, GE Healthcare) 를 이용하여 정량 하였고, RNA quality는 260/280 ratio 1.
- Daejeon, Korea) 를 이용하여 최종 반응용액 20 μl 로시행하였다. 각 유전자의 RT-PCR 조건은 Hsp70 및 GST 의경우 pre-denaturation 95℃, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초, 28회; extension 72℃, 10분 수행하였다. 내재표준유전자 β-actin의 PCR 조건은 pre-denaturation 95℃, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초, 24회; extension 72℃, 10분 수행하였다.
- 대조군은 23℃에서 시간이 경과하지 않은 0시간 실험구에서 수집하여 실험에 사용하였다. 공기노출 실험동물을 대상으로 한 유전자 발현 분석에 있어서 23℃ 온도의 실험구를 선택한 이유는 다른 실험구 온도인 17℃ 및 20℃에 비하여 시간의 경과에 따른 스트레스에 대한 실험동물의 폐사율이 급격히 변하는 양상을 보여 23℃ 온도 실험구를 선택하였다. 절식실험을 위한 참담치의 수집은 25℃ 온도 실험구에서 대조군, 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일 경과의 실험동물을 각각 10마리씩 수집하여 실험에 이용하였다.
- 공기노출 실험의 조건은 17℃, 20℃ 및 23℃에서 3일 (72 시간) 동안 노출시켰으며, 절식실험은 15℃, 20℃ 및 25℃에서 5일 동안 먹이를 공급하지 않으면서 사육하였다. 폐사개체 확인은 패각이 벌어진 상태인 것을 죽은 개체로 판단하였다.
- 공기노출에 따른 개체의 생체 내 스트레스 수준을 알아보기 위하여 23℃ 기온에 24시간 공기노출 시킨 참담치 초기부착치패에서 Hsp70 및 GST 유전자의 발현을 살펴보았다. Hsp70 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 1시간 및 3시간 경과 실험구에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
- 내재표준유전자 β-actin의 PCR 조건은 pre-denaturation 95℃, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초, 24회; extension 72℃, 10분 수행하였다.
- 폐사개체 확인은 패각이 벌어진 상태인 것을 죽은 개체로 판단하였다. 모든 실험구는 3반복 수행하였다.
- 절식기간에 따른 개체의 생체 내 스트레스 수준을 알아보기 위하여 25℃ 수온에 5일간 절식 시킨 참담치 초기부착치패에서 Hsp70 및 GST 유전자의 발현을 살펴보았다. Hsp70 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 1일 및 2일 경과 실험구에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
- 대조군은 25℃에서 시간이 경과하지 않은 0시간 실험구에서 수집하여 실험에 사용하였다. 절식상태의 실험동물을 대상으로 한 유전자 발현 분석에 있어서 25℃ 온도의 실험구를 선택한 이유는 공기노출 상태의 실험구와 마찬가지로 다른 실험구 온도인 15℃ 및 20℃에 비하여 시간의 경과에 따른 실험동물의 폐사율이 급격히 변하는 양상을 보여 25℃ 온도 실험구를 선택하였다. 모든 실험구는 3반복 수행하였다.
- 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR) 은 RT를 통해 얻은 20 μl 의 cDNA 중에서 cDNA 1 μl 와 각각의 유전자 primer인 Hsp70 (Accession No: KF322135) F (5’-TGGAATACCTCCAGCACCAA-3’), R (5’-AGCATCATTGACCATGCGTT-3’), GST (Accession No: KC525103) F (5’-GAAATTGTCTTAGTAGGTGGATC-3’), R (5’-CAGGCTGGTTGTCGGAGTAAGT-3’), 내재표준유전자로 사용한 β-actin (Liu et al. 2014) primer F (5'-ATGAAACCA CCTACAACAGT-3'), R (5'-TAGACCCACCAATCCAGACG-3’) 및 AccuPower HotStart PCR premix (Bioneer Co. Daejeon, Korea) 를 이용하여 최종 반응용액 20 μl 로시행하였다.
- RT-PCR은 실험구당 3개의 total RNA를 이용하여 각각 3회 반복 수행하였다. 증폭된 PCR산물은 ethidiumbromide (100 ng/ml) 가 포함된 2% 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인하였으며 band intensity는 Gel DocTM XR+ System (Bio-Rad, California, USA) 을 이용하여 분석하였다.
- 추출한 total RNA에서 1μg 을 취하여 oligo(dT)18(0.5 μg) primer와 AccuPower RT premix (Bioneer Co. Daejeon, Korea) 를 이용하여 최종 반응용액 20μl 로 42℃에서 1시간 시행하여 cDNA를 합성하였다.
대상 데이터
- Total RNA 추출을 위한 시료의 준비는 실험구당 3개의 사육용기별로 각각 10개체씩 실험동물의 조직을 준비하였다. 각 사육용기에 따른 10 개체의 조직은 함께 혼합하여 total RNA의 추출을 위해 사용하였다.
- 각 사육용기에 따른 10 개체의 조직은 함께 혼합하여 total RNA의 추출을 위해 사용하였다. Total RNA의 추출을 위한 조직은 패각을 제외한 육질 부위 및 부속 조직 전체를 수집하여 사용하였다. 수집한 조직은 식염수로 깨끗하게 세척 및 식염수를 제거한 다음, 액체질소에 침지시켰다.
- 본 연구에 사용된 참담치 (Mytilus coruscus, Gould) 는 초기부착치패 (1.0 ± 0.2 mm 내외) 로 국립한국농수산대학교 생물사육장에서 사육한 생물이며 사육을 위한 해수는 멸균해수를 사용하였다.
- 2 mm 내외) 로 국립한국농수산대학교 생물사육장에서 사육한 생물이며 사육을 위한 해수는 멸균해수를 사용하였다. 사육용기로는 2 L 유리소재 비이커를 사용하였으며, 실험생물인 참담치는 각각의 실험구에 100마리씩 수용하여 다연실배양기(multi room incubator) 에서 사육하였다.
- 유전자 발현 분석을 위한 참담치의 수집은 공기노출실험의 경우 23℃ 온도 실험구에서 대조군, 1시간, 3시간, 6시간, 12 시간 및 24시간 경과의 실험동물을 각각 10마리씩 수집하여 실험에 이용하였다. 대조군은 23℃에서 시간이 경과하지 않은 0시간 실험구에서 수집하여 실험에 사용하였다.
- 공기노출 실험동물을 대상으로 한 유전자 발현 분석에 있어서 23℃ 온도의 실험구를 선택한 이유는 다른 실험구 온도인 17℃ 및 20℃에 비하여 시간의 경과에 따른 스트레스에 대한 실험동물의 폐사율이 급격히 변하는 양상을 보여 23℃ 온도 실험구를 선택하였다. 절식실험을 위한 참담치의 수집은 25℃ 온도 실험구에서 대조군, 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일 경과의 실험동물을 각각 10마리씩 수집하여 실험에 이용하였다. 대조군은 25℃에서 시간이 경과하지 않은 0시간 실험구에서 수집하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 공기노출 및 절식에 따른 폐사율 개체의 통계처리는 Statistical Analysis System (SASInc., 1999) program을 이용한 ANOVA 및 Duncan's Multiple Range Test 방법으로 유의성 (P < 0.05) 을 분석하였다.
- 유전자 발현에 대한 대조군과 실험구와의 유의성 검정을 위해 Student's t-test를 수행하였으며, p값이 0.05이하인 경우에 유의한 것으로 판정하였다.
성능/효과
- GST 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 시간의 경과에 따른 실험구에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다 (Fig. 2). 대조군과 비교하여 실험구에서의 GST 발현은 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간에서 각각 1.
- 스트레스 관련 유전자인 Hsp70 및 GST 유전자는 환경요인에 따른 생체 내 스트레스의 상태를 알아볼 수 있는 생체지표유전자로 활용이 가능하다. 공기노출에 대한 Hsp70 및 GST 유전자의 발현양 상을 살펴본 결과 Hsp70은 23℃ 기온에서 6시간 경과부터 유의적인 발현양상이 나타났으며, GST 유전자의 경우는 24시간 경과 시까지 유의적인 발현의 차이가 나타나지 않았다(Fig.1, 2). 패류의 생존에 있어서 상한치사수온을 살펴보면 전복 pinto abalone (Haliotis kamtschatkana) 은 26.
- Hsp70 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 1일 및 2일 경과 실험구에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 그러나 3일 경과의 실험구에서부터 유의적인 발현의 증가가 나타나기 시작하여 5일경과 실험구에서 가장 높은 발현 양상이 나타났다 (Fig. 3). 대조군과 비교하여 실험구에서의 Hsp70 발현은 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일에서 각각 1.
- Hsp70 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 1시간 및 3시간 경과 실험구에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 그러나 6시간 경과의 실험구에서부터 유의적인 발현의 증가가 나타나기 시작하여 24시간 경과 실험구에서 가장 높은 발현 양상이 나타났다 (Fig. 1). 대조군과 비교하여 실험구에서의 Hsp70 발현은 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간에서 각각 1.
- 그러나 절식이 4일∼5일동안 지속되면 수온과 관계없이 폐사율이 급격히 높아지는 것으로 나타났다 (Table 2).
- 2 mm 내외) 를 실험생물로 이용하여 공기노출 및절식에 따른 생존율을 조사한 결과 참담치 초기부착치패의 공기노출시간에 따른 폐사율은 노출시간 대비 기온이 높을수록 폐사율이 높아졌으며 노출 24시간부터 폐사개체가 급격히 많아지는 것으로 나타났다 (Table 1). 그리고 17℃와 20℃ 실험구는 24시간 이후 비교적 폐사율이 서서히 증가하는 양상을 보여 안정화 되는 것으로 나타났으나, 23℃ 실험구에서는 폐사율이 지속적으로 높아지는 것으로 나타났다 (Table 1). 이러한 결과는 해양생물의 대사율이 수온에 직접적인 영향을 받으며 개체크기에 따라서는 반비례한다는 보고와 일치한다 (Fry, 1971; Dabrowski, 1986).
- 9%로 나타났다. 기간별 폐사 양상은 수온 25℃에서는 절식 3일부터 폐사개체가 많이 관찰되는 것으로 나타났으며 절식 3일부터 절식 5일까지의 폐사율은 38.9%로 매우 높게 나타났다. 그러나 수온 18℃와 20℃에서는 절식 4일부터 폐사개체가 많아지기 시작하였으며 절식 5일에 각각 22.
- 2). 대조군과 비교하여 실험구에서의 GST 발현은 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간에서 각각 1.03, 1.23, 1.17, 1.2 및 1.13배로 나타났다.
- 4). 대조군과 비교하여 실험구에서의 GST 발현은 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일에서 각각 1.07, 1.07, 1.10, 1.17 및 2.93배로 나타났다.
- Teixeira 등 (2013) 의 보고에 의하면 해양생물 산호가 공기에 노출되면 heat shock cognate 70 (Hsc70), Hsp70 및 GST의 발현이 유도된다고 보고하였다. 본 연구에서 24시간 경과까지 GST 발현은 유의적인 증가가 없었다. 이러한 결과는 참담치와 산호의 종의 다름도 원인이 되며, 공기노출에 대응한 GST 발현은 Hsp70보다 늦게 반응이 일어날 수 있음을 제시할 수 있다.
- 종합해보면 Hsp70은 고온에 노출되어 스트레스를 받게 되면 세포의 보호를 위해 발현을 하는 것을 알 수 있다. 본 연구에서는 23℃ 온도 설정 상태에서 시간의 경과에 따른 Hsp70의 발현을 살펴본 결과 시간의 경과에 따라 발현이 증가되어 나타나는 결과는 패류가 공기에 노출되면서 산소의 부족을 느껴 체내 스트레스를 받게 되므로 나타나는 현상으로 빈산소에 노출된 해양생물 성게에서 Hsp70 유전자의 발현이 증가한다는 보고와 경향성이 같음을 알 수 있다 (Lee et al., 2012). 또한 지중해담치 Mytilus galloprovincialis의 공기노출에 따른 빈산소의 영향에 대한 연구결과 18℃ 48시간까지는 개체의 폐사는 관찰되지 않았으나, 32℃에서는 20시간부터 폐사가 증가하기 시작하였고, 분자반응에서는 Hsp70 및 Hsp90이 공기노출에 따라 발현이 증가한다는 보고와 경향이 같음을알 수 있다 (Anestis et al.
- 패류 및 해양생물의 절식에 따른 생체 내 기전에 대한 연구는 매우 미비한 상태이다. 본 연구에서는 절식관련 Hsp70 및 GST의 발현 변화에 있어서 Hsp70이 GST 보다 빠르게 반응하는 것을 볼 수 있으며, Hsp70 및 GST는 절식에 따른 지표로 나타냄을 알 수 있었다.
- 그러나 실내에서 대량으로 치패를 사육하는 과정에서는 충분한 먹이생물공급이 원활하지 못한 경우가 빈번하게 발생되고 있다. 본 연구에서는 절식기간에 따른 참담치 초기부착치패의 폐사율을 조사한 결과 절식기간 대비 수온이 높을수록 폐사가 일찍 일어나며, 폐사율도 높아지는 것으로 나타났다 (Table 2). 그러나 절식이 4일∼5일동안 지속되면 수온과 관계없이 폐사율이 급격히 높아지는 것으로 나타났다 (Table 2).
- 본 연구에서는 참담치 초기부착치패 (1.0 ± 0.2 mm 내외) 를 실험생물로 이용하여 공기노출 및절식에 따른 생존율을 조사한 결과 참담치 초기부착치패의 공기노출시간에 따른 폐사율은 노출시간 대비 기온이 높을수록 폐사율이 높아졌으며 노출 24시간부터 폐사개체가 급격히 많아지는 것으로 나타났다 (Table 1).
- 절식에 대한 Hsp70 및 GST 유전자의 발현양상을 살펴본 결과 Hsp70은 25℃ 수온에서 3일 경과부터 유의적인 발현양상이 나타났으며, GST 유전자의 경우는 5일 경과 시부터 유의적인 발현이 나타났다 (Fig. 3, 4). 해양생물에 있어서 먹이의 부족과 관련해서 생체 내 분자반응은 Hsp70 및 Hsp90 등과 산화적 스트레스 관련 단백유전자들이 관여한다고 알려져 있다 (Antonopoulou et al.
- , 1998). 종합해보면 Hsp70은 고온에 노출되어 스트레스를 받게 되면 세포의 보호를 위해 발현을 하는 것을 알 수 있다. 본 연구에서는 23℃ 온도 설정 상태에서 시간의 경과에 따른 Hsp70의 발현을 살펴본 결과 시간의 경과에 따라 발현이 증가되어 나타나는 결과는 패류가 공기에 노출되면서 산소의 부족을 느껴 체내 스트레스를 받게 되므로 나타나는 현상으로 빈산소에 노출된 해양생물 성게에서 Hsp70 유전자의 발현이 증가한다는 보고와 경향성이 같음을 알 수 있다 (Lee et al.
- 4% 상승한 것으로 나타났다. 참담치 초기부착치패의 노출시간에 따른 폐사율은 노출시간 대비 기온이 높을수록 폐사율이 높아지는 것으로 나타났으며 참담치 치패의 안정적인 생존이 유지되는 기온범위에서는 24시간 이후 비교적 안정화 되는 것으로 나타났으나 23℃처럼 높은 기온 대에서는 지속적으로 폐사율이 높아지는 것으로 나타났다 (Table 1).
- 참담치 초기부착치패의 노출시간에 따른 폐사율을 관찰한 결과 실험 종료 시에 기온 23℃에서 49.5%로 가장 높은 폐사율을 보였으며 기온 17℃에서 29.6%로 가장 낮게 나타났다. 그리고 20℃에서는 33.
- 참담치 초기부착치패의 절식기간에 따른 폐사율을 관찰한 결과 실험 종료시 수온 25℃에서 54.0%로 가장 높은 폐사율을 보였으며 수온 15℃에서 39.3%로 가장 낮게 나타났다. 그리고 20℃에서는 41.
- Shiga, Japan) 시약 용액을 이용하여 제조사가 준비하고 제시한 방법에 따라 시행하였다. 추출한 total RNA는 분광광도계 (NanoVue, GE Healthcare) 를 이용하여 정량 하였고, RNA quality는 260/280 ratio 1.8 이상을 확인하였으며, 역전사반응 (Reverse Transcription: RT) 전까지 - 80℃ 초저온냉동고에 보관하였다.
- 9%로 나타났다. 폐사 양상은 노출 24시간에 모든 기온 실험구에서 폐사율이 급격히 높아진 것으로 나타났고 24시간부터 72시간까지 17℃와 20℃ 실험구에서 폐사율이 각각 10.3%와 8.3% 상승한 것으로 나타났으나 23℃ 실험구에서는 18.4% 상승한 것으로 나타났다. 참담치 초기부착치패의 노출시간에 따른 폐사율은 노출시간 대비 기온이 높을수록 폐사율이 높아지는 것으로 나타났으며 참담치 치패의 안정적인 생존이 유지되는 기온범위에서는 24시간 이후 비교적 안정화 되는 것으로 나타났으나 23℃처럼 높은 기온 대에서는 지속적으로 폐사율이 높아지는 것으로 나타났다 (Table 1).
후속연구
- 이러한 결과는 참담치와 산호의 종의 다름도 원인이 되며, 공기노출에 대응한 GST 발현은 Hsp70보다 늦게 반응이 일어날 수 있음을 제시할 수 있다. 향후 공기노출 기간의 재설정을 통한 연구의 필요성이 있다.
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