생부자(生附子) 및 삼부탕(蔘附湯)의 aconitine 함량 분석 및 삼부탕 단회투여 독성시험 Single Oral Dose Toxicity Study and Aconitine Content Analysis of Raw Aconiti Tuber and Sambu-tang원문보기
Objectives: This study investigated the aconitine contents analysis of Buja extracts (raw material of Buja, hot water extract of Buja, and hot water extract of Sambu-tang) and the single oral dose toxicity of Sambu-tang-R in six-week-old Sprague-Dawley rats in order to compare the toxicity of Buja e...
Objectives: This study investigated the aconitine contents analysis of Buja extracts (raw material of Buja, hot water extract of Buja, and hot water extract of Sambu-tang) and the single oral dose toxicity of Sambu-tang-R in six-week-old Sprague-Dawley rats in order to compare the toxicity of Buja extracts.Methods: Aconitine content analysis is that Buja extracts were hold purity test. To detect single oral dose toxicity, six-week-old Sprague-Dawley rats were divided into two groups, a normal control group and a sambutang-R (2,000 mg/kg) group. For 14 days of treatment, clinical signs, body weight, clinical chemistry, necropsy, and histopathology were examined.Results: The aconitine contents of the Buja extracts were Buja-RH (0.1738%), Buja-RD (0.1746%), and Sambu-tang-R (0.0961%). There were no cases of death in either the control group or the experimental group. Nor was there any disorder to the clinical signs or any significant change in body weight in either group. There was no significant change of clinical chemistry or disorder of necropsy findings in either the control or the experimental group. And there was no difference in histopathological findings in comparing the control group with the experimental group.Conclusions: These results suggest that the aconitine content of the hot water extract of Buja was similar to the raw material of Buja, but the hot water extract of Sambu-tang had greatly decreased aconitine content. These results also suggest that a single oral lethal dose of Sambu-tang-R for Sprague-Dawley rats exceeds 2,000 mg/kg for both female and male rats.
Objectives: This study investigated the aconitine contents analysis of Buja extracts (raw material of Buja, hot water extract of Buja, and hot water extract of Sambu-tang) and the single oral dose toxicity of Sambu-tang-R in six-week-old Sprague-Dawley rats in order to compare the toxicity of Buja extracts.Methods: Aconitine content analysis is that Buja extracts were hold purity test. To detect single oral dose toxicity, six-week-old Sprague-Dawley rats were divided into two groups, a normal control group and a sambutang-R (2,000 mg/kg) group. For 14 days of treatment, clinical signs, body weight, clinical chemistry, necropsy, and histopathology were examined.Results: The aconitine contents of the Buja extracts were Buja-RH (0.1738%), Buja-RD (0.1746%), and Sambu-tang-R (0.0961%). There were no cases of death in either the control group or the experimental group. Nor was there any disorder to the clinical signs or any significant change in body weight in either group. There was no significant change of clinical chemistry or disorder of necropsy findings in either the control or the experimental group. And there was no difference in histopathological findings in comparing the control group with the experimental group.Conclusions: These results suggest that the aconitine content of the hot water extract of Buja was similar to the raw material of Buja, but the hot water extract of Sambu-tang had greatly decreased aconitine content. These results also suggest that a single oral lethal dose of Sambu-tang-R for Sprague-Dawley rats exceeds 2,000 mg/kg for both female and male rats.
본 논문에서는 생부자 원약재, 생부자 열수 추출물 및 삼부탕 열수 추출물의 aconitine 함량을 분석하고, 암수 Sprague-Dawley 랫드를 이용하여 삼부탕 열수추출물의 단회투여독성 시험에 대한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
(주)동의한약분석센터(Busan, Korea)에서 aconitine의 함량을 분석하였다. 그 분석법은 다음과 같다.
모든 동물에 대해서 투여 후 14일에 isoflurane 마취하에 배대동맥에서 방혈하여 안락사시키고 부검하였다. 부검을 실시한 모든 동물에 대해서 전신의 장기 및 조직에 대하여 상세한 육안검사를 실시하였다.
삼부탕의 간독성 여부를 알아보기 위하여 혈액생화학적 검사, 조직검사 및 부검을 시행하였다. 혈액생화학적 검사에서, ALT의 경우 수컷 대조군은 27.
순도시험을 통한 aconitine의 함량 분석과 蔘附湯의 Sprague-Dawley계 암수 6주령 랫드에 단회 경구투여 시 사망유무, 일반증상, 체중변화, 혈액생화학적 검사, 육안적 부검소견 및 조직병리학적 검사를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
임상에서 많이 응용되고 있는 附子와 人蔘으로 조성된 蔘附湯은 안전성을 확보하고 있는지 확인하기 위하여, 암수 Sprague-Dawley 랫드를 이용하여 蔘附湯의 단회 경구투여 독성시험을 실시하였다.
조직병리학적 검사는 대조군 및 시험물질 투여군(G1 및 G2)의 간의 장기 및 조직에 대하여 검경하였다.
투여당일에는 투여 후 30분, 1, 2, 4 및 6시간째에 일반상태(독성징후의 종류, 발현시기, 회복시기 등) 및 사망유무를 관찰하였다. 투여 후 1일부터 14일까지는 매일 1회 일반증상을 관찰하였다.
투여당일에는 투여 후 30분, 1, 2, 4 및 6시간째에 일반상태(독성징후의 종류, 발현시기, 회복시기 등) 및 사망유무를 관찰하였다. 투여 후 1일부터 14일까지는 매일 1회 일반증상을 관찰하였다.
대상 데이터
(주)오리엔트바이오(ORIENTBIO Inc., Korea)의 SPF 환경에서 사육하고 공급한 5주령의 Sprague-Dawley 랫드(Crl : CD(SD))의 암수 각 12마리를 구입하여 1주 간 실험실 환경에 적응하도록 한 후 실험에 사용하였다.
(Anhui, China)를 통하여 구입하였고 이를 사용하였다. 蔘附湯의 조성약물인 人蔘(Ginseng Radix Alba)은 한국 충남 금산군에서 생산된 백삼 4년근으로 광명생약(Busan, Korea)에서 구입하였고 이를 사용하였다.
군 분리는 모든 동물에 대하여 순화종료일에 실시하였다. 군 분리일의 평균체중에 가까운 암수 각 10마리를 선발하였다. 선발한 동물을 각 군 평균체중이 균등하도록 무작위로 암수 각 2군, 군당 5마리로 군 분리하였다.
단회투여 독성시험에 사용한 蔘附湯(Sambu-tang-R)은 전자저울(CP323S, Sartorius, Germany)로 칭량하여 유리 조제병에 넣고, 부형제를 일부 넣어 교반기로 현탁시키고 부형제를 가하여 규정농도(200 mg/mL)로 조제하였다. 조제물은 투여당일 조제하였다.
실험에 사용된 물질은 生附子(Buja-RH) 원약재, 生附子 열수추출물(Buja-RD), 生附子 함유 蔘附湯 열수추출물(Sambu-tang-R)을 사용하였다.
데이터처리
Folded-F 검정법을 사용하여 등분산성을 검정한 결과(유의수준 : 0.05), 등분산인 경우 Student t-test를, 등분산이 기각되면 Aspin-Welch t-test를 실시하여 유의성을 확인하였다(유의수준 : 양측 0.05 및 0.01).
실험에서 얻어진 체중 및 혈액생화학적 검사 결과는 SAS(version 9.3, SAS Institute Inc., USA)를 사용하여 검정하였다
이론/모형
본 시험은 다음의 Good Laboratory Practice Regulation을 준수하였고[“비임상시험관리기준” 식품의약품안전처 고시 제 2014-67호(2014년 2월 12일)], 다음의 시험기준에 근거하여 실시하였다[“의약품등의 독성시험기준” 식품의약품안전처 고시 제 2014-136호(2014년 7월 30일)]. 독성시험방법은 다음과 같다.
혈액생화학 분석기(7180, HITACHI, Japan)로 다음 항목들을 측정하였다. 알라닌 아미노기전이효소(alanine aminotransferase, ALT)와 아스파테이트 아미노기전이효소(aspartate aminotransferase, AST)는 JSCC법, 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)는 4-Nitrophenyl-phosphate 2Na법, 락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)는 UV-Kinetic법, 감마 글루타밀트란스펩티다제(gamma glutamyl transpeptidase, GGT)는 IFCC법으로 측정하였고, 단위는 모두 U/L로 하였다.
0 mg을 클로로포름에 녹여 표준액으로 한다. 이들 액을 가지고 박층크로마토그래프법에 따라 시험한다. 검액 및 표준액 100 μL(확인용은 별도로 50 μL)씩을 박층크로마토그래프용 실리카겔을 써서 만든 박층판에 점적한다.
6. 간조직 검사에서 암수 2,000 mg/kg 삼부탕 투여군은 대조군과 비교하여 이상이 없는 것으로 나타났다.
본 실험에서는 생부자 열수추출시 생부자 원약재에 비하여 aconitine 함량은 큰 차이가 없었고, 생부자에 인삼을 配伍하여 열수추출시 생부자 열수추출물에 비하여 aconitine 함량이 29% 감소하였다. 염부자에 물을 가하여 100 ℃로 2시간 가열시 aconitine이 가수분해되어 aconitine계 알칼로이드 함량이 줄어들어 독성도 감소된다25,26는 연구결과가 있으나 본 연구에서는 생부자 열수추출시 별다른 차이가 없었다.
5. 부검 시, 암수 대조군 및 2,000 mg/kg 삼부탕 투여군에서 장기 및 조직의 육안적 이상 소견은 없는 것으로 나타났다.
이상의 연구결과를 종합해 보면, 생부자 단독으로 열수추출 하였을 때의 aconitine 함량은 큰 차이가 없었고, 人蔘과 配伍한 삼부탕을 열수추출 하였을 때의 aconitine 함량은 생부자 단독으로 열수추출 하였을 때의 aconitine 함량보다 29% 감소하여 인삼이 부자의 독성을 줄일 수 있는 것으로 생각된다. 삼부탕을 암수 6주령 랫드에 단회 경구 투여하여 삼부탕 투여군과 대조군을 비교 시 사망례가 없었으며, 일반증상 및 체중에 대하여도 유의한 변화가 없었고, 혈액생화학적 검사, 육안적 부검소견 및 조직병리학적 검사에 대해서도 유의성 있는 이상 결과가 없는 것으로 나타났다. 이는 부자 단미를 사용하기 보다는 부자에 인삼을 배오한 삼부탕의 안전성이 더 우수하다는 실험적 근거로써 의미있는 연구라고 판단된다.
7. 삼부탕의 단회 경구 투여를 한 결과, 치사량은 암수 모두 2,000 mg/kg을 상회하는 것으로 판단된다.
생부자의 원약재, 생부자 열수추출물과 생부자로 조성된 삼부탕 열수추출물에 함유된 aconitine 함량을 분석한 결과 각각 0.1738%, 0.1746% 및 0.0961%로 나타났다.
3. 암수 2,000 mg/kg 삼부탕 투여군에서 대조군과 비교시 유의성 있는 체중변화는 없는 것으로 나타났다.
2. 암수 대조군 및 2,000 mg/kg 삼부탕 투여군에서 사망례는 없었으며, 일반증상의 이상도 없는 것으로 나타났다.
이상의 연구결과를 종합해 보면, 생부자 단독으로 열수추출 하였을 때의 aconitine 함량은 큰 차이가 없었고, 人蔘과 配伍한 삼부탕을 열수추출 하였을 때의 aconitine 함량은 생부자 단독으로 열수추출 하였을 때의 aconitine 함량보다 29% 감소하여 인삼이 부자의 독성을 줄일 수 있는 것으로 생각된다. 삼부탕을 암수 6주령 랫드에 단회 경구 투여하여 삼부탕 투여군과 대조군을 비교 시 사망례가 없었으며, 일반증상 및 체중에 대하여도 유의한 변화가 없었고, 혈액생화학적 검사, 육안적 부검소견 및 조직병리학적 검사에 대해서도 유의성 있는 이상 결과가 없는 것으로 나타났다.
4. 혈중 ALT, AST, ALP, GGT 및 LDH의 농도는 암수 2,000 mg/kg 삼부탕 투여군에서 대조군과 비교하여 유의성 있는 변화는 없는 것으로 나타났다.
후속연구
결론적으로 생부자의 aconitine 함량과 단회 경구 투여 독성시험 결과에서 보듯이 한의학적 진단에 따라 적절하게 사용된다면 부자의 독성을 극복할 수 있을 것으로 생각된다.
따라서 본 실험에서는 연구방법의 차이로 열수추출시 aconitine이 가수분해되어 aconitine계 알칼로이드 함량이 줄어드는 것은 증명하지 못하였고, 인삼이 부자의 aconitine계 알칼로이드 함량을 감소시키는 것으로 생각할 수 있으나 더 자세한 기전은 추가 연구가 필요하다.
본 연구는 현재 유통되고 있는 생부자에 국한한 점과 동물실험 개체수가 작고, 간에 대해서만 조직검사를 한 것에 대한 제한점이 있다.
향후 국내에 유통되고 있는 炮製한 부자와 비교 분석하고, 인삼 이외의 여러 다른 한약재와 配伍 시 부자의 aconitine계 알칼로이드 함량변화 및 독성시험 관련하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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