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문제 정의
- 이러한 낮은 상태의 혈구수는 살충효과가 나타나는 4일 까지 지속하였다. 본 결과는 이산화염소가 화랑곡나방의 혈구세포에 대한 세포독성을 지닌다는 기존 결과를 뒷받침하였다. 이러한 이산화염소의 세포치사효과가 아폽토시스에 의해 이뤄지는 지를 이후 연구에서는 TUNEL 분석 방법으로 진행하였다.
- 본 연구는 비타민E 처리는 곤충 세포의 아폽토시스 유발을 억제하였다. 비타민 E는 높은 항산화제로서 활성산소의 작용을 길항적으로 억제하는 것으로 알려지고 있다(Herrera and Barbas, 2001).
- 이러한 아폽토시스는 개체의 방어기작으로서 외부 병원체 침입에 대한 면역반응 또는 위해한 물질의 노출에 대해서 세포가 피해를 받게 될 때에도 일어난다(Norbury and Hickson, 2001). 본 연구는 이러한 기반 위에 이산화염소가 활성산소에 기인하여 곤충세포주의 아폽토시스를 유발하는 지 그리고 이러한 아폽토시스가 곤충의 혈구세포에서 일어나는지, 그리고 이러한 아폽토시스 유발이 살충력에 영향을 주었는지를 증명하는 데 목표를 두었다.
- 본 연구는 이산화염소의 살충 기작을 탐구하는 일련의 연구 과정의 일환으로 수행되었다. 기존의 연구는 이산화염소가 발생시키는 활성산소가 살충 효과를 주는 주요 치사 인자로 추정하였다(Kumar et al.
가설 설정
- Both positive and negative control cells provided from Abcam (Cambridge, UK) were analyzed. (B) Effect of different concentrations of chlorine dioxide on Sf9 cells by incubation for 24 h. Immunofluorescence assay of bromo deoxyuridine (‘BrdU’) was detected by its monoclonal antibody in a rhodamine mode of a fluorescence microscope (DM 2500, Leica,Wetzlar, Germany) at 400 x magnification.
제안 방법
- Sf9 세포주에서 일어난 아폽토시스가 화랑곡나방의 충체 내에 있는 혈구세포에서도 관찰되는 지를 분석하기 위해 서로 다른 농도의 이산화염소를 주입하고 24 시간 후에 분석하였다(Fig. 3). 주입된 이산화염소의 농도가 증가할수록 TUNEL 양성 반응 신호는 증가하는 것으로 관찰되었다(Fig.
- 유리 모세관은 micropipette puller (PN-30, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 제조하였다. 각 농도 처리는 3 반복으로 실시하였으며, 각 반복은 10 마리의 5령충을 대상으로 실시하였다. 처리 후 25℃ 실내 조건에서 24 시간 방치 후 사망률을 조사하였다.
- 고정액을 제거하기 위해 3 분간 원심분리(300 ×g) 후 1 × 106 개 세포를 1차 세척완충용액(Abcam)으로 2 회 세척한 후 50 μL의 DNA 표지용액(10 μL terminal deoxyribonucleotidyl transferase (TdT) 반응완충용액, 0.75 μL TdT 효소, 8 μL BrdUTP, 32.25 μL 탈이온증류수)에 현탁시키고 37℃에서 60 분간 반응시켰다.
- 2). 본 연구에 이용된 TUNEL 분석의 아폽토시스의 판별력을 판정하기 위해 두 가지 양성 및 음성 대조구에 대해서 분석을 실시하였다. 양성 대조구세포는 본 연구에 이용된 TUNEL 분석 키트로 처리한 결과 형광현미경의 rhodamine모드에서 붉은 양성 반응을 보였다.
- 기존의 연구와 같이 본 연구에서도 이산화염소는 충체로 주입할 경우 뚜렷한 살충효과를 재확인하여 주었다. 비록 50 ppm의 낮은 농도로 주입하여도 살충효과가 나타나지만, 이후 혈구세포독성 연구에서는 400 ppm의 이산화염소 농도를 기반으로 실시하였다. 이 농도를 처리하고 전체혈구수를 분석한 결과 처리 후 1 일 이후부터 뚜렷한 혈구수 감소를 나타냈는데 이는 이산화염소의 살충작용이 일어나는 4 일 이후 보다 빠른 시기에 충체 내에서는 세포치사를 유발시키고 있다는 사실을 내재하고 있다.
- 처리 후 25℃ 실내 조건에서 24 시간 방치 후 사망률을 조사하였다. 사망 판정은 핀셋으로 복부를 가볍게 눌렀을 때 자의적 행동이 없는 상태로 규정하였다.
- 유충은 인공사료(800 g rice bran, 200 g 이스트 추출물, 500 mL 글리세롤, 2 g sorbic acid, 2 g methyl p-hydroxybenzoate)를 이용하여 온도28 ± 1℃, 상대습도 65-75%, 일장 16:8 (L:D) h 조건의 배양기에서 사육되었다. 소집단이 겪는 임의유전적부동을 줄이기 위해 매 세대 100 마리 이상의 암수를 교미시켜 차세대를 형성하였다. 성충은 10% 설탕물을 제공하였다.
- 형광현미경 관찰은 BF, rhodamine 및 DAPI 필터를 이용하여 세포, DNA 절편 및 핵을 각각 관찰하였다. 아폽토시스의 나타내는 세포 비율 결정은 임의로 100 개의 세포를 선택하고 여기에서 적색의 형광을 보이는 세포를 계수하여 백분율로 환산하여 산출하였다. 이러한 계수는 3 회 반복하였다.
- 이산화염소의 살충효과는 처리된 가장 낮은 농도인 50ppm 수준에서 나타났으며 주입 농도가 증가함에 따라 살충효과는 증가하였다. 이러한 양독 반응을 기준으로 뚜렷한 살충효과를 보이는 100 ppm의 이산화염소를 화랑곡나방의 혈강에 주입하고 시기별로 진행되는 전체혈구수의 변화를 추적하였다(Fig. 1B). 전체 혈구수는 처리 1일 후에 본래의 약 60% 수준으로 감소하였다.
- 반면에 동일 조건으로 처리되고 관찰된 음성 대조구 세포는 이러한 형광 반응이 전혀 나타나지 않았다. 이러한 판별력 위에 서로 다른 이산화염소 농도를 Sf9 세포에 처리하고, 24 시간 경과 후에 TUNEL 분석을 실시하였다. 눈에 띠는 형광신호는 20 ppm의 농도 이상에서 나타났으며, 40 ppm 이상에서는 거의 모든 세포에서 형광을 나타냈다.
- 이산화염소 액상 주입 처리는 0, 50, 100, 200. 400 및 800 ppm을 이용하였다.
- 이산화염소에 의해 나타나는 아폽토시스가 이 물질이 생성시키는 활성산소에 의해 이뤄지는 지를 분석하기 위해 항산화제인 비타민 E를 처리하여 아폽토시스 억제 효과를 분석하였다(Fig. 4). 앞에서 보듯 400 ppm 농도의 이산화염소 처리는 약 75% 이상의 아폽토시스를 유발하였다(Fig.
- 이산화염소의 아폽토시스 유발효과는 Sf9 세포주를 이용하여 관찰하였다(Fig. 2). 본 연구에 이용된 TUNEL 분석의 아폽토시스의 판별력을 판정하기 위해 두 가지 양성 및 음성 대조구에 대해서 분석을 실시하였다.
- 이산화염소의 아폽토시스 유발효과와 살충효과를 기능적으로 연결시키기 위해 서로 다른 농도를 처리하고 사망률 감소 효과를 분석하였다(Fig. 5). 400 ppm의 이산화염소를 처리한 결과 앞에서 보듯 높은 살충효과를 보였다.
- 1 mL의 항체반응용액(Anti-BrdU-Red Antibody 5 μLRinse Buffer 95 μL)을 첨가한 후 실내 암 조건에서 30 분간 반응시켰다. 이후 PBS로 2회 세척 후 슬라이드옮겨 형광현미경(DM 2500, Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰하였다. 세포 전체 관찰은 Bright field (BF) 모드를 이용하였고, DNA 절편을 관찰하기 위해 rhodamine 필터를 이용하였다.
- 5)과 혼합하고 얼음 위에서 20 분간 반응 후 다시 곤충세포배양용액(TC-100 insect cell culture medium, Hyclone, Daegu, Korea)에 현탁시켰다. 이후 혈구세포의 DNA 절편을 관찰하기 위한 방법은 앞에서 기술한 방법과 동일하게 적용하였다. 혈구세포의 경우 핵을 형광현미경으로 관찰하기 위해 4’,6-diamindino-2-phenylindole (DAPI, Thermo Scientific, Meridian, Rockford, USA)을 1:1,000의 희석 비율로 하여 상온에서 2 분간 염색시켰다.
- 화랑곡나방 5령충을 대상으로 서로 다른 농도(0-800 ppm)의 이산화염소 1 μL를 혈강 주입하였다. 처리 1 일 경과 후 복부 다리를 절단하고 나오는 혈림프를 수거하였다. 수거된 혈림프(약 100 μL)는 900 μL의 항응고용액(1.
- 각 농도 처리는 3 반복으로 실시하였으며, 각 반복은 10 마리의 5령충을 대상으로 실시하였다. 처리 후 25℃ 실내 조건에서 24 시간 방치 후 사망률을 조사하였다. 사망 판정은 핀셋으로 복부를 가볍게 눌렀을 때 자의적 행동이 없는 상태로 규정하였다.
- 혈강 주입(1 μL)은 유리 모세관을 이용하여 초미량펌프가 장착된 미세조정장치(SYS-microcontroller, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 주입하였다.
- 혈구세포의 경우 핵을 형광현미경으로 관찰하기 위해 4’,6-diamindino-2-phenylindole (DAPI, Thermo Scientific, Meridian, Rockford, USA)을 1:1,000의 희석 비율로 하여 상온에서 2 분간 염색시켰다.
- 혈구세포의 경우 핵을 형광현미경으로 관찰하기 위해 4’,6-diamindino-2-phenylindole (DAPI, Thermo Scientific, Meridian, Rockford, USA)을 1:1,000의 희석 비율로 하여 상온에서 2 분간 염색시켰다. 형광현미경 관찰은 BF, rhodamine 및 DAPI 필터를 이용하여 세포, DNA 절편 및 핵을 각각 관찰하였다. 아폽토시스의 나타내는 세포 비율 결정은 임의로 100 개의 세포를 선택하고 여기에서 적색의 형광을 보이는 세포를 계수하여 백분율로 환산하여 산출하였다.
- 화랑곡나방 5령충을 대상으로 서로 다른 농도(0-800 ppm)의 이산화염소 1 μL를 혈강 주입하였다.
- 화랑곡나방의 혈구세포에 대한 세포치사효과를 분석하기 위해 우선 이산화염소의 농도별 살충효과를 분석하였다(Fig.1A). 이산화염소의 살충효과는 처리된 가장 낮은 농도인 50ppm 수준에서 나타났으며 주입 농도가 증가함에 따라 살충효과는 증가하였다.
대상 데이터
- 이산화염소 액상 주입 처리는 0, 50, 100, 200. 400 및 800 ppm을 이용하였다. 혈강 주입(1 μL)은 유리 모세관을 이용하여 초미량펌프가 장착된 미세조정장치(SYS-microcontroller, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 주입하였다.
- 본 연구에 사용된 화랑곡나방은 실내 누대 사육충으로 1994년 대구의 건조 채소류 저장창고에서 유래되었다. 유충은 인공사료(800 g rice bran, 200 g 이스트 추출물, 500 mL 글리세롤, 2 g sorbic acid, 2 g methyl p-hydroxybenzoate)를 이용하여 온도28 ± 1℃, 상대습도 65-75%, 일장 16:8 (L:D) h 조건의 배양기에서 사육되었다.
- 본 연구에 이용된 비타민E는 Sigma-Aldrich Korea (Seoul,Korea)에서 제공된 α-tocopherol을 사용하였으며 dimethyl sulfoxide (Amresco)를 이용하여 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 mM로 희석하였다.
- 본 연구에 이용된 이산화염소는 800 ppm의 저장 용액이었다. 이 시약은 프루고팜(Suwon, Korea)에서 제공되었다.
- 유충은 인공사료(800 g rice bran, 200 g 이스트 추출물, 500 mL 글리세롤, 2 g sorbic acid, 2 g methyl p-hydroxybenzoate)를 이용하여 온도28 ± 1℃, 상대습도 65-75%, 일장 16:8 (L:D) h 조건의 배양기에서 사육되었다.
데이터처리
- 모든 살충효과 및 아폽토시스 결과는 백분율 자료로서 arsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석 및 처리 평균 간 비교를 실시하였다. 평균간비교는 SAS의 ANOVA 분석에서 제공되는 DUNCAN의 다중평균간 비교법을 이용하였다.
- 모든 살충효과 및 아폽토시스 결과는 백분율 자료로서 arsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석 및 처리 평균 간 비교를 실시하였다. 평균간비교는 SAS의 ANOVA 분석에서 제공되는 DUNCAN의 다중평균간 비교법을 이용하였다. 이때 제1형 오류의 확률(α)은 0.
이론/모형
- Influence of chlorine dioxide on induction of apoptosis in Sf9 cells. DNA damage was assessed by TUNEL method. (A) Control test of TUNEL assay.
- TUNEL 분석법을 이용한 아폽토시스 정량화는 Abcam(Cambridge, UK)의 ab66110 제품인 In situ BrdU-Red DNA Fragmentation Assay Kit을 이용하였다. 간략하게 서로 다른 이산화염소 농도(0-50 ppm)를 Sf9 세포 배양액에 24 시간 처리하였다.
- 이후 PBS로 2회 세척 후 슬라이드옮겨 형광현미경(DM 2500, Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰하였다. 세포 전체 관찰은 Bright field (BF) 모드를 이용하였고, DNA 절편을 관찰하기 위해 rhodamine 필터를 이용하였다. 모든 현미경 자료는 400 배의 배율에서 확인하였다.
- 본 결과는 이산화염소가 화랑곡나방의 혈구세포에 대한 세포독성을 지닌다는 기존 결과를 뒷받침하였다. 이러한 이산화염소의 세포치사효과가 아폽토시스에 의해 이뤄지는 지를 이후 연구에서는 TUNEL 분석 방법으로 진행하였다.
성능/효과
- 3B). 400 ppm 이상의 이산화염소 농도처리에서는 큰 차이 없이 75-80% 혈구세포가 아폽토시스 반응을 보이는 것으로 나타났다.
- , 2016). 두 종류의 바이러스에 대해 이산화염소는 활성산소에 기인된 항바이러스 기작을 나타냈으며, 유사하게 인체 암세포에 대한 세포독성을 나타냈다.
- , 2015). 본 연구는 이산화염소의 살충기작물질인 활성산소가 세포독성을 보이며, 이러한 세포독성은 대상 곤충 세포의 아폽토시스를 유발함으로 초래된다는 것을 보여준다.
- 본 연구에 이용된 TUNEL 분석의 아폽토시스의 판별력을 판정하기 위해 두 가지 양성 및 음성 대조구에 대해서 분석을 실시하였다. 양성 대조구세포는 본 연구에 이용된 TUNEL 분석 키트로 처리한 결과 형광현미경의 rhodamine모드에서 붉은 양성 반응을 보였다. 반면에 동일 조건으로 처리되고 관찰된 음성 대조구 세포는 이러한 형광 반응이 전혀 나타나지 않았다.
- 1A). 이산화염소의 살충효과는 처리된 가장 낮은 농도인 50ppm 수준에서 나타났으며 주입 농도가 증가함에 따라 살충효과는 증가하였다. 이러한 양독 반응을 기준으로 뚜렷한 살충효과를 보이는 100 ppm의 이산화염소를 화랑곡나방의 혈강에 주입하고 시기별로 진행되는 전체혈구수의 변화를 추적하였다(Fig.
- 이상의 결과를 통해 이산화염소의 살충효과는 이 물질이 충체 내에서 활성산소를 생성시키고 이 활성산소는 다시 곤충의 여러 세포에 아폽토시스를 유발하여 세포독성을 일으켜 궁극적으로 치사에 이르게 한 것으로 설명된다.
- 3). 주입된 이산화염소의 농도가 증가할수록 TUNEL 양성 반응 신호는 증가하는 것으로 관찰되었다(Fig. 3A). 이를 정량화하면, 뚜렷한 아폽토시스 양성 반응이 100 ppm 이상의 이산화염소 농도에서 나타났다(Fig.
- 이러한 두 가지 중요한 세포 변화가 본 연구에서 유발되었다. 즉, 세포 부풀음이 관찰되었고, DNA 절편화가 TUNEL 분석법으로 나타났다. 따라서 이산화염소는 곤충 세포 치사를 유발하는 데아폽토시스 과정을 야기하는 것으로 판단된다.
- 그러나 비타민E를 함께 처리한 결과 비타민E의 농도가 높아짐에 따라 살충력의 감소를 나타냈다. 통계적으로 뚜렷한 살충력 감소 효과는 25 mM이상에서 나타났다.
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