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문제 정의
- 본 연구에서는 해조류 추출물 20종의 치매 예방 및 개선 소재로서의 가치를 검토하기 위해 총폴리페놀 함량, ABTS radical 소거능, acetylcholinesterase(AChE) 저해 활성, β-secretase 효소 억제 활성 및 신경세포 보호 효과를 비교하였다.
- 이에 본 실험에서는 해조류 추출물 20종을 대상으로 총폴리페놀 함량, ABTS radical 소거 활성, AChE 억제 활성, β-secretase 억제 활성 및 산화 스트레스에 의한 신경세포 보호 효과를 측정하여 해조류의 치매 예방 및 개선 소재로서의 가치를 검토하였다.
- 이에 본 연구에서는 해조류 추출물의 기억력 효능을 확인하기 위해 AChE 저해 활성을 측정하였으며 그 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 그 결과 감태 35.
- 이에본 연구에서는 Aβ 생성에 영향을 미칠 수 있는 β-secretase 효소에 대한 해조류 추출물의 억제 활성을 측정하였다.
제안 방법
- ABTS radical 소거 활성은 Arnao 등(19)의 방법을 변형하여 측정하였다. 2.
- Acetylcholinesterase(AchE) 저해 활성은 Ellman법(20)을 변형하여 측정하였다. Cuvette에 2.
- H2O2 처리농도 확립을 위하여 배양 세포에 10~50 μM 농도의 H2O2를 처리하여 세포생존율이 50% 되는 농도를 선정하였다.
- Substrate인 Rh-EVNLDAEFK-quencher는 β-secretase에 의해 잘려져 형광을 나타내므로 형광분광계(Infinite M200, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 Ex 545/Em 585 nm 파장으로 형광강도를 측정하였다.
- 배양된 SH-SY5Y 세포를 96 well plate에 2×104 cells/well 농도로 분주하여 24시간 동안 pre-incubation 후 30 μM 농도의 H2O2를 처리하여 세포독성을 유발하고, 해조류 추출물을 농도별(50, 100 μg/mL)로 처리하여 24시간 더 배양하였다.
- 본 실험에서는 20종 해조류 추출물의 비교를 위해 총폴리페놀 함량을 측정하였고, 그 결과를 Table 1에 나타내었다. 20종의 해조류 추출물 중 감태의 총폴리페놀 함량이 123.
- 본 실험에서는 Trolox를 대조물질로 20종 해조류 추출물의 ABTS radical 소거능을 비교하였으며, 그 결과를 Table 1에 제시하였다. 검둥감태와 감태 추출물의 IC50 값은 각각 0.
- 세포 배양조건은 Dulbecco's modified Eagle medium(Gibco, Carlsbad, CA, USA)에 10% fetal bovine serum(Gibco)과 1% penicillin streptomycin(Gib co)을 첨가하여 사용하였으며, incubator 조건은 37°C 온도에서, 5% CO2가 공급되어 세포배양에 적절하도록 설정하였다.
- 5 mL를 첨가하여 교반한 다음 실온에서 1시간 동안 발색시켜 UV spectrometer(V-530, Jasco, Tokyo, Japan)를 사용하여 765 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총폴리페놀 함량은 0~0.5 mg/mL 농도의 phloroglucinol(Sigma-Aldrich Co.)을 표준곡선으로 계산하였다.
- 이에 본 연구에서는 H2O2로 산화 스트레스를 유도한 SHSY5Y cell에 해조류 추출물을 처리하여 산화 스트레스에 의한 신경세포 보호 효과를 측정하였고, 그 결과를 Fig. 3에 제시하였다. H2O2 처리농도 확립을 위하여 배양 세포에 10~50 μM 농도의 H2O2를 처리하여 세포생존율이 50% 되는 농도를 선정하였다.
- 해조류 추출물의 β-secretase 효소 활성은 BACE1(β-secretase) FRET assay kit(Panvera, Madison, WI, USA)을 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 해조류 추출물은 제주테크노파크(Jeju, Korea)에서 제공받아 사용하였으며, 가시뼈대그물말(Dictyopteris prolifera), 갈래잎모자반(Sargassum pinnatifidum), 감태(Ecklonia cava), 개서실(Chondria crassicaulis), 검둥감태(Ecklonia kurome), 꽈배기모자반(Sargassum siliquastrum), 모란갈파래(Ulva conglobata), 미역 (Undaria pinnatifida), 미역쇠(Petalonia binghamiae), 바위수염(Myelophycus simplex), 바위주름(Petrospongium rugosum), 불레기말(Colpomenia sinuosa), 쌍발이모자반 (Sargassum patens), 알쏭이모자반(Sargassum confusum), 왜모자반(Sargassum yezoense), 잎파래(Enteromorpha linza), 지충이(Sargassum thunbergii), 짝잎모자반(Sargassum hemiphyllum), 참그물바탕말(Dictyota dichotoma), 톳(Hizikia fusiformis)으로 총 20종이다.
- 본 실험에서 사용한 human neuroblastoma SH-SY5Y 세포(VA 20108)는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양조건은 Dulbecco's modified Eagle medium(Gibco, Carlsbad, CA, USA)에 10% fetal bovine serum(Gibco)과 1% penicillin streptomycin(Gib co)을 첨가하여 사용하였으며, incubator 조건은 37°C 온도에서, 5% CO2가 공급되어 세포배양에 적절하도록 설정하였다.
- 제공받은 해조류 추출물은 메탄올을 용매로 실온에서 24시간 교반 추출하며 상등액을 여과(Whatman No. 2, Whatman International Ltd., Maidstone, UK) 및 감압농축 (LABOROTA 4000, Heidoph, Schwabach, Germany) 후 동결건조 시킨 것으로, 시료 검액은 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 일정 농도로 용해해 시험 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 각 처리군 간의 유의성 검증은 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 이용하여 확인하였으며, P<0.05 수준으로 Tukey's test를 실시하였다.
- 모든 결과는 SPSS(version 18.0 SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- H2O2 처리에 의한 해조류 추출물의 신경세포 보호 효과는 MTT assay를 이용하여 측정하였다(21). 배양된 SH-SY5Y 세포를 96 well plate에 2×104 cells/well 농도로 분주하여 24시간 동안 pre-incubation 후 30 μM 농도의 H2O2를 처리하여 세포독성을 유발하고, 해조류 추출물을 농도별(50, 100 μg/mL)로 처리하여 24시간 더 배양하였다.
- 총폴리페놀 함량은 Folin과 Denis의 방법(18)에 따라 측정하였다. 일정 농도의 해조류 추출물 0.
성능/효과
- 20종의 해조류 추출물 중 감태의 총폴리페놀 함량이 123.00±4.31 mg/g으로 가장 높았으며, 검둥감태 110.34±5.80 mg/g, 꽈배기모자반 47.38±7.01 mg/g, 왜모자반 36.19±3.88 mg/g, 개서실 28.96±0.70 mg/g 순으로 총폴리페놀 함량이 높은 것으로 측정되었다.
- 해조류 추출물의 총폴리페놀 함량과 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 감태 추출물의 총폴리페놀 함량이 가장 높았으며, 검둥감태와 감태 추출물이 높은 ABTS radical 소거능을 나타내었다. AChE 저해 활성을 검토한 결과 감태, 검둥감태, 바위수염이 30% 이상의 높은 저해 활성을 보였고 그중 감태가 가장 높은 억제율을 나타내었다. 또한, β-secretase 효소 억제 활성은 검둥감태, 감태, 왜모자반 추출물에서 관찰되었다.
- Fig. 2에 제시한 바와 같이 감태와 검둥감태 추출물에서 각각 84.41±1.70%, 81.17±2.43%로 높은 억제 활성을 보였고, 왜모자반이 18.82±6.29%로 비교적 낮은 억제 활성이 있는 것으로 나타났다.
- H2O2 농도가 증가할수록 세포생존율은 유의적으로 감소하였고, H2O2 30 μM 처리농도에서 세포생존율이 약 50%로 측정되어 시험조건을 확립하였다.
- 24% 순으로 20종 중 3종이 30% 이상의 저해 활성을 나타내었다. 가시뼈대그물말, 모란갈파래, 쌍발이모자반, 짝잎모자반, 참그물바탕말, 톳은 20~30%의 저해 활성을 갖는 것으로 관찰됐지만 미역을 포함한 11종의 해조류 추출물은 10~20%의 비교적 낮은 저해 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
- 검둥감태와 감태 추출물의 IC50 값은 각각 0.07±0.00 mg/mL, 0.08±0.00 mg/mL로 대조물질인 Trolox(IC50 0.12 mg/mL)보다 높은 ABTS radical 소거 활성을 보여, 총폴리페놀 함량이 높은 검둥감태와 감태 추출물이 ABTS radical 소거능 역시 우수한 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 감태 35.85±0.54%, 검둥감태 31.77±2.56%, 바위수염 31.14±1.24% 순으로 20종 중 3종이 30% 이상의 저해 활성을 나타내었다.
- 그러나 감태, 검둥감태 및 왜모자반 3종을 제외한 나머지 해조류 추출물에서는 10% 미만의 억제 활성이 관찰되어 β-secretase 효소 활성 억제 효과가 미미한 것으로 확인되었다.
- 또한, 본 연구에서 제시한 바와 같이 감태는 다른 해조류에 비해 총폴리페놀 함량도 가장 높았으며, 우수한 ABTS radical 소거 활성도 나타내었다. 따라서 감태 추출물에 존재하는 다량의 항산화 성분이 신경 세포 내 ROS를 효과적으로 감소시켜 신경세포사멸 억제 효과를 갖는 것으로 판단된다.
- 6배 증가하여 신경 세포 보호 효과를 보고하였다. 또한, 본 연구에서 제시한 바와 같이 감태는 다른 해조류에 비해 총폴리페놀 함량도 가장 높았으며, 우수한 ABTS radical 소거 활성도 나타내었다. 따라서 감태 추출물에 존재하는 다량의 항산화 성분이 신경 세포 내 ROS를 효과적으로 감소시켜 신경세포사멸 억제 효과를 갖는 것으로 판단된다.
- 이는 해조류의 플로로탄닌 성분이 AChE 저해에 전적으로 기인하는 것이라 보고하였다. 본 연구에서도 감태 및 검둥감태의 폴리페놀 함량은 높았으며, 이에 우수한 AChE 저해 활성을 보인 것으로 생각한다. 반면 바위수염 추출물은 총폴리페놀 함량이 낮음에도 불구하고 높은 AChE 저해 활성을 나타내었다.
- 특히 감태 추출물의 경우 50 μg/mL 농도에서도 74.82±3.05%의 세포생존율을 나타내어 신경세포 보호 효과가 다른 해조류 추출물과 비교하여 우수한 것으로 확인되었다.
- 한편 H2O2 30 μM과 각각의 해조류 추출물(50, 100 μg/mL)을 동시에 처리한 결과 H2O2 단독처리구에 비하여 100 μg/mL 농도에서 감태 96.26±2.03%, 검둥감태 81.58±2.91%, 왜모자반 74.61±4.19%의 세포생존율을 보여 산화 스트레스에 의해 유도된 신경세포사멸을 억제하는 것으로 나타났다.
- 세포생존율 측정을 위해 MTT solution을 처리하여 37°C, 4시간 동안 반응시켰고, DMSO를 첨가하여 보라색으로 염색된 for mazan을 용해해 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 해조류 추출물 용해 시 사용된 DMSO는 신경세포에 0.1% 농도로 최종 처리하였고, 신경세포 사멸 및 보호 효과에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. Cell viability는 control의 생존율에 대한 백분율로 나타내었다.
- 본 연구에서는 해조류 추출물 20종의 치매 예방 및 개선 소재로서의 가치를 검토하기 위해 총폴리페놀 함량, ABTS radical 소거능, acetylcholinesterase(AChE) 저해 활성, β-secretase 효소 억제 활성 및 신경세포 보호 효과를 비교하였다. 해조류 추출물의 총폴리페놀 함량과 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 감태 추출물의 총폴리페놀 함량이 가장 높았으며, 검둥감태와 감태 추출물이 높은 ABTS radical 소거능을 나타내었다. AChE 저해 활성을 검토한 결과 감태, 검둥감태, 바위수염이 30% 이상의 높은 저해 활성을 보였고 그중 감태가 가장 높은 억제율을 나타내었다.
후속연구
- 따라서 β-secretase 효소 억제 활성을 나타낸 감태와 검둥감태는 항치매 효과를 갖는 건강기능식품소재로 활용 가능성이 높을 것으로 판단되며 향후 Aβ 형성 조절 기전에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
- 43 mg/g으로 본 실험에서 측정된 값과 유사한 수치를 나타내었다. 또한, Cho 등(25)은 에탄올 추출한 꽈배기모자반이 대표적인 항산화 식품인 양파, 토마토보다 폴리페놀 함량이 높은 것으로 보고된 바 있어 해조류의 우수한 항산화 성분을 활용한 기능성 식품 소재로의 개발 가능성이 기대된다.
- H2O2에 의해 유도된 신경세포 독성에 대한 보호 효과는 감태, 검둥감태, 왜모자반 추출물 100 μg/mL 농도에서 관찰되었다. 이상의 결과로 미루어 보았을 때 감태 추출물이 치매 예방 및 개선제로서의 활용 가능성이 가장 뛰어난 것으로 생각되며, 추가로 생리활성 물질 구명 및 작용기전 입증을 위한 후속 연구가 진행되어야 할 것으로 생각한다.
- Lin 등(33)은 갈조류의 카로티노이드류인 fucoxanthin이 AChE 활성을 저해하는 것으로 보고하였다. 이에 바위수염 추출물에 함유된 fucoidan, fucoxanthin 등에 의해 AChE 활성이 저해된 것으로 생각되며, 향후 연구에서는 유효성분의 AChE 억제 활성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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