[논문]LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 염증반응에서 감송향(甘松香)에서 추출한 8α-hydroxy pinoresinol의 항염증 효과

최선복; 박성주

doi:10.6116/kjh.2016.31.5.1.

LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 염증반응에서 감송향(甘松香)에서 추출한 8α-hydroxy pinoresinol의 항염증 효과
Anti-inflammatory Effects of 8α-hydroxy pinoresinol isolated from Nardostachys jatamansi on Lipopolysaccharide-induced Inflammatory Response in RAW 264.7 Cells. 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.31 no.5, 2016년, pp.1 - 6

최선복 (원광대 학교한의과 대학 본초학교실) , 박성주 (원광대 학교한의과 대학 본초학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Nardostachys jatamansi (NJ) is a medicinal herb that has been reported in various traditional systems of medicine for its use in antispasmodic, a digestive stimulant, skin diseases. Previous studies have already reported that NJ effectively protects against inflammation. However, the active compound in NJ is unknown. Therefore, in the present study, we analyzed effects of a compound, 8α-hydroxy pinoresinol (HP), isolated from NJ against lipopolysaccharide (LPS) induced inflammation in RAW 264.7 cells.Methods : To examine the anti-inflammatory effect of HP against LPS, intraperitoneally pre-treat the HP (100, 200, 500 and 1,000 nM) 1 h prior to LPS challenges. LPS was stimulated with 500 ng/ml in RAW 264.7 cells. To identify the anti-inflammatory effect of HP, we measured inflammatory mediators such as inducible nitric oxide synthase (iNOS) and its derivative nitric oxide (NO), cyclooxygenase-2 (COX-2), prostaglandin E2 (PGE2). Also we evaluated molecular mechanisms including mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor-kappaB (NF-κB) activation by western blot.Results : The HP inhibited production of inflammatory mediators, such as iNOS and its derivative NO, COX-2 and PGE2 in LPS- induced inflammationin RAW 264.7 cells. Additionally, HP also inhibited activation of p38 pathway signaling but not extracellularsignal-regulatedkinase (ERK), c-jun NH2-terminal kinase (JNK), and NF-κB.Conclusion : Our results suggest that HP has anti-inflammatory functions through the dephosphorylation of p38 and HP can provide beneficial strategy for prevention and therapy of inflammation.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

LPS로 유도된 Raw 264.7 cell에서 HP의 항염증 효과를 확인하였는데, 어떠한 신호전달경로에 의해서 이러한 효과를 나타내는지 관찰하기 위해 대표적인 신호전달경로인 MAPKs와 NF-κB의 활성을 확인해 보았다. HP 1,000 nM의 농도로 시간별로 (6, 9, 12, 24시간) 전 처리한 뒤 LPS를 30분간 자극하였다.
본 연구에서, LPS에 의한 RAW 264.7 cell의 자극에서 甘松香 유래 단일성분인 HP의 항염증 효과를 관찰하였을 때 다음과 같은 결론을 얻었다.
염증반응시 염증 매개물질인 COX-2와 PGE₂의 발현양이 증가하게 되는데, 이에 HP가 미치는 영향을 확인해 보았다. RAW 264.
이에 RAW 264.7 cell에서 HP가 LPS로 유도된 iNOS의 생성에 미치는 영향을 알아보고자 Western blot analysis를 통해 확인해 보았다. RAW 264.
선행 연구로는 LPS로 유도한 염증반응에서 甘松香의 항염증 효과가 보고되어 있으나¹⁰⁾, 아직까지 甘松香에서 유래한 단일성분인 8α-hydroxy pinoresinol (HP)의 항염증 효과는 보고된 바가 없다. 이에 본 연구에서는 대식세포의 세포주인 RAW 264.7 cell에서 HP의 항염증 효과에 대해 관찰하였다. 이를 위해 RAW 264.

제안 방법

7 cell에서 HP의 항염증 효과를 확인하였는데, 어떠한 신호전달경로에 의해서 이러한 효과를 나타내는지 관찰하기 위해 대표적인 신호전달경로인 MAPKs와 NF-κB의 활성을 확인해 보았다. HP 1,000 nM의 농도로 시간별로 (6, 9, 12, 24시간) 전 처리한 뒤 LPS를 30분간 자극하였다. LPS로 자극된 Raw 264.
HP가 RAW 264.7 cell의 세포생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT 분석을 통해 확인하였다. 그 결과 HP 처리농도 1,500 nM 이상에서 세포생존율이 80 % 이하로 떨어져 유의성 있는 영향을 나타냈다.
HP의 RAW 264.7 세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide (MTT)용액을 이용하여 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640 배지에서 2 × 10⁵/㎖의 밀도로 현탁하였고, 여러가지 농도로 LE를 처리하였다.
흡광도는 spectrophotometer (MD, USA)로 540 nm에서 측정하였다. NO의 농도는 아질산염의 표준커브를 통해 계산하였다.
7 cell에서 HP가 LPS로 유도된 iNOS의 생성에 미치는 영향을 알아보고자 Western blot analysis를 통해 확인해 보았다. RAW 264.7 cell에 HP (100, 200, 500, 1,000 nM)로 1시간 전 처리한 후, LPS로 자극하였다. LPS 처리군에 비해 HP 전 처리시 농도 의존적으로 iNOS의 생성을 억제하였으며, NO의 생성을 측정한 결과 iNOS의 발현양과 일치하게 LPS로 유도된 NO의 생성을 억제하였다 (Fig.
RAW 264.7 cell을 60 mm culture dish에 5 × 106cells/dish로 배양하고 serum free RPMI-1640 media 로 12시간 starvation 시킨 뒤 HP를 시간별로 (6, 9, 12, 24 시간) 전 처리 후 LPS 500 ng/ml로 30분간 자극하였다. Cold PBS로 3회 세척한 후 cell을 획득하여 5,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액은 버리고 cell pellet을 수거하였다.
동일한 양의 단백질에 sampling buffer (4x)를 넣은 뒤 10 % SDS- PAGE에 전기영동한 후 membrane에 옮겨 5 % skim milk로 2시간 blocking하였다. iNOS, COX-2의 활성과 p38, JNK, ERK의 phosphorylation, NF-κB를 ECL detetion용액(Amersham)으로 확인하였다.
甘松香을 열수 추출한 뒤 얻어낸 甘松香 물 추출물 15g을 H₂O로 현탁하여 녹는 부분을 ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)을 이용하여 순차적으로 분획하였다. 얻어낸 EtOAc 분획물 2.
7 세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide (MTT)용액을 이용하여 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640 배지에서 2 × 10⁵/㎖의 밀도로 현탁하였고, 여러가지 농도로 LE를 처리하였다. 24시간동안 배양한 뒤 5 ㎎/㎖의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다.
5 % naphtylethylendiamide)은 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 NO의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 측정하여 540 nM에서 흡광도를 측정하였다. 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 × 10₅의 밀도로 현탁하였고, HP를 농도별로 처리하였다. LPS를 500 ng/ml로 자극한 후 24시간 동안 배양한 뒤, 세포 상층액을 취해 96-well plate에 loading하였다.
7 cell에서 HP의 항염증 효과에 대해 관찰하였다. 이를 위해 RAW 264.7 cell에서 HP 전 처리시 LPS로 유도된 염증 매개물질인 iNOS, NO, COX₂, PGE₂의 발현양의 변화를 관찰하였으며, 이에 따른 기전 조사를 위해 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)와 nuclear factor-kappa B (NF-κB)의 활성화를 조사하여 염증반응의 억제에 대한 여부를 확인하였다.
그 결과 HP 처리농도 1,500 nM 이상에서 세포생존율이 80 % 이하로 떨어져 유의성 있는 영향을 나타냈다. 이에 HP 100 nM에서 1, 000nM까지의 농도를 이후 진행된 실험의 유효 농도로 설정하였다 (Fig. 1).
. 추가적으로 선행연구에서는 LPS에 의한 endotoxin shock뿐만 아니라, 여러 효과들이 입증되어 있어^{10, 15, 16)}, 이상의 선행연구를 살펴본 바 甘松香의 유래 단일 성분인 HP 또한 유의하게 항염증 효과가 나타날 것으로 사료되어 본 실험의 성분으로 선택하였다.

대상 데이터

Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, total and phosphospecific MAPKs 항체 (p38; extracellular signal-regulated kinase 1/2 [ERK 1/2]; c-Jun NH₂-terminal protein kinase [JNK])는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-Iκ-Bα는 Santa Cruz (CA, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.
구입하였다. LPS는 Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, total and phosphospecific MAPKs 항체 (p38; extracellular signal-regulated kinase 1/2 [ERK 1/2]; c-Jun NH₂-terminal protein kinase [JNK])는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-Iκ-Bα는 Santa Cruz (CA, USA)사에서 구입하였다.
RAW 264.7 celle 마우스의 대식세포주이며, 한국세포주은행 (KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양에는 10% FBS와 1% penicillin and streptomycin을 첨가한 RPMI-1640 배지가 사용되었으며, 세포는 37℃, 5% CO₂조건 배양기에서 배양하였다.
Roswell Park Memorial Institute culture medium (RPMI-1640), fetal bovine serum (FBS), penicillin, and streptomycin는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서구입하였다. LPS는 Sigma-Aldrich Chemical (St.
본 실험에서 사용한 甘松香 (Nardostachys jatamansi)은 옴니허브 (서울, 대한민국)에서 구입하여 원광대학교 한의과대학 본초학 교실에서 확인을 받은 후 사용하였다. 甘松香을 열수 추출한 뒤 얻어낸 甘松香 물 추출물 15g을 H₂O로 현탁하여 녹는 부분을 ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)을 이용하여 순차적으로 분획하였다.
따라서 초기 염증을 조절하는 것은 매우 중요한 문제이다. 본 연구에서는 대식세포의 세포주인 RAW 264.7 cell을 사용하였으며, 그람음성균의 외막성분인 LPS를 가지고 염증을 유발하였다.

데이터처리

로 나타내었다. 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 분석프로그램의 one way ANOVA에 준하였다. p-value가 0.

이론/모형

PGE₂수준은 manufacture’s protocol(Stressgen Biotechnologies, MI, USA)에 따라 immunoassay kits로 측정되었다.

성능/효과

2. HP는 RAW 264.7 cell에서 LPS 처리군에 비해 iNOS와 NO의 발현을 유의성 있게 억제하였다.
3. HP는 RAW 264.7 cell에서 LPS 처리군에 비해 COX-2와 PGE2의 발현을 유의성 있게 억제하였다.
4. HP는 RAW 264.7 cell에서 p38의 인산화를 억제하였다. 이상의 결과로 보아 HP는 RAW 264.
7 cell에 HP (100, 200, 500, 1,000 nM)로 1시간 전 처리한 후, LPS로 자극하였다. LPS 처리군에 비해 HP 전 처리시 농도 의존적으로 iNOS의 생성을 억제하였으며, NO의 생성을 측정한 결과 iNOS의 발현양과 일치하게 LPS로 유도된 NO의 생성을 억제하였다 (Fig. 2).
HP 1,000 nM의 농도로 시간별로 (6, 9, 12, 24시간) 전 처리한 뒤 LPS를 30분간 자극하였다. LPS로 자극된 Raw 264.7 cell에서 p38, EKR, JNK가 인산화 된 것을 확인하였으며, HP 9-24시간 전 처리시 ERK, JNK의 인산화는 억제하지 못하였으나, p38의 인산화를 억제하였다. 추가적으로, NF-κB의 활성화 지표인 Iκ -Bα의 분해를 조사한 결과, HP가 NF-κB의 활성에는 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다 (Fig.
7 cell의 세포생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT 분석을 통해 확인하였다. 그 결과 HP 처리농도 1,500 nM 이상에서 세포생존율이 80 % 이하로 떨어져 유의성 있는 영향을 나타냈다. 이에 HP 100 nM에서 1, 000nM까지의 농도를 이후 진행된 실험의 유효 농도로 설정하였다 (Fig.
그러나 HP 1,000 nM 전 처리군에서 유의성 있게 COX-2의 생성이 억제된 모습을 관찰할 수 있었다. 또한, COX-2에 의한 PGE2의 발현양 역시 HP 500 nM, 1,000 nM 처리군에서 LPS 처리군에 비해 유의하게 억제되었다 (Fig. 3).
따라서 본 지표들은 약물의 항염증 효능을 평가하는데 유용한 지표로 사용되고 있다. 본 연구에서 HP는 이러한 병리학적 영향을 미치는 iNOS의 발현과 이에 따른 NO의 생성을 억제하며, COX-2와 PGE2의 생성 역시 HP가 억제함으로서, 염증을 조절한다는 것을 알 수 있다.
염증반응이 일어나면 MAPKs는 세포내핵 안으로 이동하여 신호전달에 의해 인산화되는 것을 관여하며, 현재까지 p38, ERK, JNK가 알려져 있다^{20, 21)}. 본 연구에서 HP의 전 처리가 ERK, JNK의 인산화는 억제하지 못하였지만, p38의 신호전달 활성을 억제하였다. 이러한 결과들을 종합해보면, HP는 p38의 신호전달 활성억제를 통해 NO, PGE2와 같은 염증 매개인자를 억제하여 염증을 조절하는 것으로 생각된다.
본 연구에서 HP의 전 처리가 ERK, JNK의 인산화는 억제하지 못하였지만, p38의 신호전달 활성을 억제하였다. 이러한 결과들을 종합해보면, HP는 p38의 신호전달 활성억제를 통해 NO, PGE2와 같은 염증 매개인자를 억제하여 염증을 조절하는 것으로 생각된다. 더욱이 HP의 항염증 효과는 염증성 질환의 예방과 치료에 사용될 수 있을 것으로 생각되며, HP의 in vivo실험 및 다른 질환모델에서의 추가적인 실험을 진행하는데 있어 중요한 척도가 될 수 있을 것으로 사료된다.
7 cell에서 p38, EKR, JNK가 인산화 된 것을 확인하였으며, HP 9-24시간 전 처리시 ERK, JNK의 인산화는 억제하지 못하였으나, p38의 인산화를 억제하였다. 추가적으로, NF-κB의 활성화 지표인 Iκ -Bα의 분해를 조사한 결과, HP가 NF-κB의 활성에는 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다 (Fig. 4).

후속연구

이러한 결과들을 종합해보면, HP는 p38의 신호전달 활성억제를 통해 NO, PGE2와 같은 염증 매개인자를 억제하여 염증을 조절하는 것으로 생각된다. 더욱이 HP의 항염증 효과는 염증성 질환의 예방과 치료에 사용될 수 있을 것으로 생각되며, HP의 in vivo실험 및 다른 질환모델에서의 추가적인 실험을 진행하는데 있어 중요한 척도가 될 수 있을 것으로 사료된다.
7 cell에서 p38의 인산화를 억제하였다. 이상의 결과로 보아 HP는 RAW 264.7 cell에서 염증반응에 대한 보호 효과를 가지며 항염증 치료에 응용할 수 있다고 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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