[논문]감마선을 이용한 육종 차조기의 항염증 효과

심부용; 박정현; 김성규; 지중구

doi:10.12925/jkocs.2019.36.2.488

감마선을 이용한 육종 차조기의 항염증 효과
Effects of anti-inflammatory on Perilla frutescens var. crispa Induced by mutants with γ-Ray 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.36 no.2, 2019년, pp.488 - 497

심부용 (중부대학교 산학협력단) , 박정현 ((주)에스에프씨바이오) , 김성규 ((주)에스에프씨바이오) , 지중구 (중부대학교 한방건강관리학과)

초록
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본 연구는 감마선을 이용한 육종 차조기 추출물을 통해 항염증 효능을 평가하고자 하였다. RAW 264.7 세포에서 MTT를 통해 세포 생존율을 평가하였으며, LPS로 유도한 RAW 264.7 세포에서 ROS, NO, 염증성 사이토카인, $NF-{\kappa}B$, COX-2 등을 ELISA, Luminex 및 PCR로 측정하였다. 그 결과, 육종 차조기 추출물은 $25{\mu}g/m{\ell}$ 이하에서 세포독성이 없었으며, LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 ROS, NO, 사이토카인($IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha}$)의 생성을 억제하였다. 또한, $NF-{\kappa}B$, COX-2의 발현을 감소시켜 육종 차조기 추출물은 뛰어난 항염증 효과를 보였다. 이와 같은 결과는 염증 매개체로 인해 발생하는 질환을 개선하기 위한 새로운 건강식품 및 치료제의 원료로 개발될 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to confirmed anti-inflammatory effect the apple Induced by mutants with ${\gamma}-Ray$ extract. Cell viability was assessed by MTT assay using RAW 264.7 cells. The extracts measured through changes in the levels of reactive oxygen species (ROS), nitric oxide (NO), inflammatory cytokines, NF-kB, and COX-2 on LPS-induced RAW 264.7 cells. All test results were analyzed by ELISA reader, Luminex and RT-PCR. In result, the extracts was not toxic below in 25 ug/ml, and extracts was inhibited the productions nitric oxide, ROS, cytokines (IL-1b, IL-6, TNF-a), NF-kB and COX-2 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Also, the expression levels were decreased on mRNA of $NF-{\kappa}B$ and COX-2. In other words, Perilla frutescens var. crispa Induced by mutants with ${\gamma}-Ray$ extracts showed significant anti-inflammatory effect. These results may be developed as a raw material for new health food and therapeutics to ease the related to the above mediators.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. The Sequences of Primers in This Study
그림 Fig. 1. Effect of Perilla frutescens var. crispa Induced by mutants with γ-Ray extracts on cell viability in RAW 264.7 cells.
그림 Fig. 2. Effect of Perilla frutescens var. crispa Induced by mutants with γ-Ray extracts on ROS levels in RAW 264.7 cells.
그림 Fig. 3. Effect of Perilla frutescens var. crispa Induced by mutants with γ-Ray extracts on NO levels in RAW 264.7 cells.
그림 Fig. 4. Effect of Perilla frutescens var. crispa Induced by mutants with γ-Ray extracts on cytokine IL-1β(A), IL-6(B), and TNF-α(C) levels in RAW 264.7 cells.
그림 Fig. 5. Effect of Perilla frutescens var. crispa Induced by mutants with γ-Ray extracts on mRNA NF-κB (A), and COX-2 (B) expression in RAW 264.7 cells.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 식·의약 소재로 활용이 상대적으로 적합한 초임계 유체 추출을 활용한 형질전환 차조기로 관절염, 아토피피부염, 크론병과 같은 염증성 질환에 관한 가능성을 다각도로 확인하고자 세포독성을 바탕으로 다양한 염증성 매개체 확인을 과학적으로 진행한 결과, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구는 방사선 형질전환 차조기의 초임계 유체 추출물(이하, 육종 차조기)이 염증성 질환의식·의약품 소재로써 안전성과 가능성을 검증하고자 세포독성 및 항산화, 항염증 등과 관련된 대표 매개체에 관한 연구를 진행한 결과는 다음과 같다.

제안 방법

배양 후 10 ㎕의 CCK-8 solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO₂⁾에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 ELISA reader기를 이용하여 흡광도의 변화를 측정한 후 시료를 첨가하지 않은 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
96 well plate에 배양한 시료를 nitric oxide detection kit의 구성 물품인 N1 buffer 50 ㎕를 각 well에 처리하고 10분간 상온에서 반응시키고 N2 buffer 50 ㎕를 추가하여 10분간 다시 반응시켰다. 반응 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 배양액에 LPS만을 처리한 대조군을 기준으로 NO 생성 저해 효능을 백분율로 표시하였다.
방사선 형질전환 차조기(이하, 육종 차조기)는 한국원자력연구원(Korea)의 방사선육종연구센터에서 수령한 건조물을 제분하여 추출(압력 400bar, 온도 50℃), 분리(압력 40 bar, 온도 40℃), CO₂ 유량(550 ㎖-12 min)의 조건에서 총 3시간 동안 초임계 유체 추출을 진행하였다. 추출 후 수분을 제거한 원료를 –4℃에서 냉장 보관하며 실험에 이용하였다.
7 세포를 2×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 육종 차조기 추출물 5, 10, 25 (㎍/㎖)의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 배양 후, 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, DCF-DA를 10 µM씩 처리하여 15분 동안 세포 배양기에서 반응시켰다.
5×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 육종 차조기 추출물 5, 10, 25 (㎍/㎖)의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양한 시료를 다음과 같은 방법에 따라 각각 활용하였다.
세척 후 PBS를 150 ㎕를 넣고 5분 간 shaking한 후 Luminex를 이용하여 cytokine IL-1β, IL-6, TNF-α 생성량을 측정하였다.
역전사(reverse transcription) 반응은 RT premix kit의 mixture (reaction buffer, dNTPsmixture, RNase inhibitor, stabilizer, oligo dT15primer)를 사용하여 total RNA 1 ㎍이 되도록 diethyl pyrocarbonate(DEPC) 처리된 증류수에 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하여 첨가하였다. 첨가 후 45℃에서 60분 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 후 95℃에서 5분 동안 반응하여 M-MLV RT를 불활성화한 다음 합성이 완료된 cDNA를 유전자 발현량 측정에 사용하였다.
배양 후, 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, DCF-DA를 10 µM씩 처리하여 15분 동안 세포 배양기에서 반응시켰다. 염색 후 원심 분리한 다음 상등액을 제거하고 PBS 400 ㎕를 부유시켜 Flow cytometer를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였으며, 배양액에 LPS만을 처리한 대조군을 기준으로 활성산소 저해 효능을 백분율로 표시하였다.
배양 후, easy blue 1 ㎖와 chloroform 200 ㎕를 넣고 혼합하여 원심분리한 상층액 400 ㎕에 binding buffer 400 ㎕를 넣어 다시 반응시킨 뒤 반응액 700 ㎕를 column에 주입하여 원심분리하였다. 원심분리한 column에 washing buffer A와 B를 각각 700 ㎕씩 순차적으로 넣어 원심분리한 뒤 elution buffer를 50 ㎕ 넣고 원심분리하여 추출된 total RNA를 확보하였다.
7 세포를 96 well plate에 2×10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 새로운 배양액으로 교체한 후 육종 차조기 추출물을 각각 5, 10, 25, 50, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 CCK-8 solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO₂⁾에서 30분간 반응시켰다.
역전사(reverse transcription) 반응은 RT premix kit의 mixture (reaction buffer, dNTPsmixture, RNase inhibitor, stabilizer, oligo dT15primer)를 사용하여 total RNA 1 ㎍이 되도록 diethyl pyrocarbonate(DEPC) 처리된 증류수에 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하여 첨가하였다. 첨가 후 45℃에서 60분 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 후 95℃에서 5분 동안 반응하여 M-MLV RT를 불활성화한 다음 합성이 완료된 cDNA를 유전자 발현량 측정에 사용하였다.
합성이 완료된 cDNA를 증폭을 위하여 real-time PCR을 진행하였으며, real-time 전용 tube에 cDNA 1 ㎕, 각 primer 2 ㎕, SYBR Green 10 ㎕, DEPC-DW 5 ㎕씩 넣어 다음과 같이 진행하였다. 94℃에서 2분 동안 반응한 다음 95℃에서 5초, 65℃에서 30초를 40회 반복하여 진행하였고 이후 유전자 발현량은 대조군 대비 계산하였으며, 사용된 primer의 sequence는 Table 1과 같다.

대상 데이터

본 연구에 활용된 차조기는 200Gy의 감마선을 조사하여 방사선 육종을 진행함으로써 기존 차조기가 가지고 있는 isoegomaketone 성분 함량을 10배 이상 높인 형질전환 천연물이며, 이전 연구[4,8]를 통해 메탄올 추출된 형질전환 차조기가 RAW 264.7 세포와 3T3-L1 세포에서 항염증 및 항비만 효과를 확인한 바 있으나 초임계 유체추출을 활용하여 진행한 연구는 진행된 바가 없다.
시약은 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(D-PBS : Welgene Co.,, Korea), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., UK), 우태아혈청 (fetal bovine serum:FBS, Invitrogen Co., U.S.A.), lipopolysaccharide(LPS : Sigma Co., U.S.A.), CCK-8 (Dojindo,U.S.A), Mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), penicillin (Hyclone, Co., U.S.A.), streptomycin(Hyclone Co., U.S.A.), (2,7)-dichlorodihydrofluorescin diacettate (DCFHDA : Sigma Co., U.S.A.), trypan blue (Sigma Co., U.S.A.) 등을 사용하였다.
한국세포주은행 (Korea)에서 구매한 RAW 264.7 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin으로 조성된 DMEM 배지 1 ㎖에 넣어 부유시키고 세포배양기 (37℃, 5% CO₂⁾에서 배양하였다. 계대배양 횟수는 5회 이상으로 하였고, 시료들을 처리하기 전에 24시간을 적응시켰다.

데이터처리

대조군 대비 실험군간의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하였고, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다(***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05).
모든 실험결과는 3회 반복 측정하였으며 평균값±표준편차(mean±S.D)로 표시하였다.

성능/효과

1. 육종 차조기는 RAW 264.7 세포의 25 ㎍/㎖ 농도 이하에서는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았으나 50 ㎍/㎖ 농도 이상에서는 독성이 확인되었다.
2. 육종 차조기는 과생성된 활성산소(ROS)와 일산화질소(NO) 생성을 10, 25 (㎍/㎖) 농도에서 대조군 대비 유의성 있게 감소시켰다.
3. 육종 차조기는 염증성 사이토카인 생성을 IL-1β에서는 10, 25 (㎍/㎖) 농도에서, IL-6와 TNF-α는 모든 농도에서 대조군 대비 유의성 있게 감소시켰다.
4. 육종 차조기는 NF-κB와 COX-2의 유전자 발현을 10, 25 (㎍/㎖) 농도에서 대조군 대비 유의성 있게 감소시켰다.
따라서 전임상 단계 중 안전성과 가능성 등을 확보한 본 연구를 통해 추후 이와 관련된 질환을 유도한 동물 실험을 통해 효능을 입증할 예정이나, 이와 같은 연구결과는 육종 차조기가 식· 의약품 소재로 충분히 활용 가치가 높은 소재임을 과학적으로 증명하였다.
본 연구에서 육종 차조기 추출물에 관한 연구범위 설정을 위해 세포독성을 확인한 결과, 육종 차조기 추출물은 25 ㎍/㎖ 농도 이하에서 대조군 대비 95% 이상의 생존율이 확인되었으며, 50 ㎍/㎖ 이상에서는 독성이 확인되었다(Fig. 1). 이와 같은 결과는 박 등이 동일한 RAW 264.
본 연구에서 육종 차조기 추출물에 대한 NFκB와 COX-2의 유전자 발현을 확인한 결과, 10, 25 (㎍/㎖) 농도에서 대조군 대비 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig. 5).
본 연구에서 육종 차조기 추출물에 대한 NO 생성량을 확인한 결과, 10, 25 (㎍/㎖) 농도에서 대조군 대비 약 19%, 52%의 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig. 3). 이와 같은 결과는 과생성된 NO를 대식세포가 제거 시 육종 차조기 추출물이 효과적인 도움을 주는 원료이며, 앞선 활성산소 생성량 억제 효능의 결과와 부합되는 점을 볼 때 육종 차조기 추출물이 신경계, 심혈관계, 만성 염증성 질환 등에 효과가 있는 원료임을 더욱 뒷받침하고 있다.
본 연구에서 육종 차조기 추출물에 대한 염증성 사이토카인 생성량을 확인한 결과, IL-1β는 10, 25 (㎍/㎖) 농도에서, IL-6와 TNF-α 생성량은 모든 농도에서 대조군 대비 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig. 4).
본 연구에서 육종 차조기 추출물에 대한 활성산소 저해 효능을 확인한 결과, 10, 25 (㎍/㎖) 농도에서 대조군 대비 약 28%, 61%의 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig. 2). 이와 같은 결과는 과생성된 활성산소를 육종 차조기 추출물에서 유의적으로 저해시키는 것으로 볼 때 활성산소에 의해 발생한다고 알려진 암, 심혈관계 질환, 염증, 노화 등의 질환에 활용할 수 있는 원료로서의 가능성을 제시하고 있다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 육종 차조기는 25 ㎍/㎖ 농도 이하에서 활용 가능하며, 10, 25(㎍/㎖) 농도에서 활성산소 및 염증 매개체의 감소가 효과적인 것으로 나타나, 본 연구결과에서 확인한 염증 매개체와 관련된 아토피피부염, 관절염, 심혈관질환 등에 효과가 있을 것으로 판단된다. 따라서 전임상 단계 중 안전성과 가능성 등을 확보한 본 연구를 통해 추후 이와 관련된 질환을 유도한 동물 실험을 통해 효능을 입증할 예정이나, 이와 같은 연구결과는 육종 차조기가 식· 의약품 소재로 충분히 활용 가치가 높은 소재임을 과학적으로 증명하였다.

후속연구

2). 이와 같은 결과는 과생성된 활성산소를 육종 차조기 추출물에서 유의적으로 저해시키는 것으로 볼 때 활성산소에 의해 발생한다고 알려진 암, 심혈관계 질환, 염증, 노화 등의 질환에 활용할 수 있는 원료로서의 가능성을 제시하고 있다.
1). 이와 같은 결과는 박 등이 동일한 RAW 264.7 세포에서 육종 차조기의 메탄올 추출을 통해 진행한 독성 결과가 100 ㎍/㎖의 농도까지 안전성이 확보되었음을 보고한 결과보다 낮은 농도에서 독성이 나타난 점은 본 연구가 초임계 유체 추출로 진행하였기에 발생한 결과로 해석되며, 초임계 유체 추출 시 안전성 확보 범위를 제공한 기초적 연구자료로 활용될 수 있다.
이와 같은 결과는 앞선 염증 매개체의 감소가 전사체인 NF-κB의 감소를 통해 발생한 결과임을 보여주고 있어 육종 차조기의 항염증 효능이 기전적으로 설명되고 있으며, COX-2의 감소결과 역시 앞선 염증 질환에 대한 효과적 원료로서의 활용 가능성을 더욱 높이고 있다.
4). 이와 같은 결과는 육종 차조기 추출물이 급성 및 만성단계의 염증성 질환에 대한 대안으로 활용될 수 있으며, 더 나아가 염증성 사이토카인 중 상대적으로 IL-6 생성 억제를 크게 시키는 점은 IL-6가 주요 매개체로 평가받는 아토피피부염, 관절염 등에 큰 효과가 있을 것으로 사료된다.
특히, 육종 차조기는 앞선 매개체 생성 감소 효능 결과를 바탕으로 연관성을 확인한 바, 관절염 질환의 치료제로 사용되는 COX-2 억제제의 역할과 유사함을 나타내고 있어 항관절염 효능을 나타내는 식·의약품 소재로써도 충분히 고려해 볼 수 있다고 판단되어 이 같은 가설은 추후 동물 실험을 통해 검증해보고자 한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	차조기(Perilla frutescens var. crispa)는 무엇인가?	차조기(Perilla frutescens var. crispa)는 꿀풀과(Laminaceae)에 속하는 일년생의 초본으로 들깨(Perilla frutescens var. frutescens) 와는 같은 종의 서로 다른 변종으로 줄기의 길이, 잎의 색, 향, 종자 크기 등으로 구별되며, 들깨는 유료작물로, 차조기는 약용작물과 향신채 등으로 활용되고 있다[2].
	활성 산소를 제거함으로써 질환 발병의 예방과 개선을 할 수 있는 까닭은 무엇인가?	면역 기전에서 대식세포는 인체에 병원 미생물, 바이러스와 같은 유해한 물질이 침투할 경우, 생체 방어를 보다 효과적으로 수행하기 위해 반응성 높은 독성 물질인 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 생산하여 살균작용과 세포 상해 작용을 유도하게 된다[10]. 하지만 활성산소는 역할 수행 후 원활하게 제거되지 않아 정상 세포에 작용하면 암, 심혈관계 질환, 염증, 노화 등을 유발하게 된다[11]. 따라서 활성산소는 인체 내 과도한 발생 시 다양한 질환을 유발하므로 과도하게 생산된 활성산소의 효과적인 저해 효능을 가진 원료는 질환 발병의 예방과 개선에 활용될 수 있다.
	차조기의 효능으로 알려진 것은 무엇인가?	frutescens) 와는 같은 종의 서로 다른 변종으로 줄기의 길이, 잎의 색, 향, 종자 크기 등으로 구별되며, 들깨는 유료작물로, 차조기는 약용작물과 향신채 등으로 활용되고 있다[2]. 현재까지 알려진 차조기의 효능으로는 항산화, 항알레르기, 항균, 항암 및 당뇨 등이 알려져 있으며, 플라보노이드, 비타민 A, D, E, isoegomaketone(IK) 등의 성분이 함유되어 있다[3,4]. 특히, IK는 perillaketone (PK) 성분과 함께 차조기 추출물의 주요한 성분 중 하나로 차조기 특유의 향을 내는 방향성 성분으로 항암을 비롯한 항염증, apoptosis 등에 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다[5-7].

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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