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문제 정의
- 따라서 본 연구자는 급성 위염 및 역류성 식도염 동물모델에 미발아 현미와 발아 조건을 달리한 현미를 처치하여 보호 효능을 비교 실험하였고, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 영천에서 재배한 현미 1.2 kg을 발아기 (NAGO, Gyeongsan-si, Korea) (Fig 1.)에 물 3.5 L 와 함께 24, 30, 36, 48시간으로 발아시간을 달리하여 발아하였다 (Fig 2.).
- ICR 마우스를 군당 6마리씩 4그룹으로 구분하여 실험을 실시하였다. 실험 전날까지 고형사료와 물을 충분히 공급하였고 위 점막 손상 유발 실험 24시간 전부터 절식하였다.
- ROS 측정은 혈청과 25 mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 emission wavel ength of 530 nm와 excitation wavelength of 485 nm를이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다14).
- SD 흰쥐를 군당 6마리씩 7그룹으로 구분하여 실험을 실시하였다. 1주일 동안 고형사료와 물을 충분히 공급하여 실험실 환경에 적응시킨 후 수술 24시간 전부터 절식하였다.
- pH 측정 전 정확한 측정을 위하여 pH 4와 pH 7의 완충액 (buffer solution)의 순서로 교정한 후 수집한 위 내용물의 pH를 pH 측정기 (Istek Product, Korea)를 활용하여 측정하였다.
- 실험 전, 정상군 (Nor)은 아무런 처치를 하지 않았으며, 위점막 손상 대조군 (Con)은 증류수를 경구 투여하였고, 미 발아 현미 추출물 투여군 및 48시간 발아 현미 추출물 투여군은 현미를 미세하게 분쇄하여 100 mL씩 경구 투여 한 후, 1시간 방치하였다. 그 다음 위 점막 손상을 유발하기 위하여 150 mM H Cl/60% ethanol을 각 0.5 ml 씩 경구 투여하였고 한 시간 후 개복하여 위 조직을 적출하였다12).
- 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5 회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PB S-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 en hanced chemiluminescence (ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q20 00 Chemidoc (Lugen Sci Co. Ltd, Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densito graph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.
- 실험은 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회의 승인 (DHU2015-081, DHU2015-082)을 얻어 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료 (Samyang Co.
- 현미를 발아법을 통하여 생리활성을 증대시키려는 연구가 활발히 진행되고 있지만9-11), 발아 조건을 달리한 현미의 상부 위장관 보호 효능에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구자는 급성위염 및 역류성 식도염 동물모델에 발아 시간을 달리한 현미를 단회 투여한 후 부검하여 얻은 혈청 및 식도, 위를 분석하여 그 개선 효과를 평가하였고 그 결과는 다음과 같다.
- 실험 당일 미발아 현미 및 발아시간을 달리한 현미를 미세하게 분쇄하게 100 mL씩 경구투여하고 1시간 후 Zoletile mixture (Vibrac, France) 25 mg/kg를 복강 주사하여 마취하였다. 복부를 2 cm 정도 개복을 하고, 대만 부위 및 인접한 날문 부위를 실크실로 묶은 후 복막과 피부를 봉합하였다. 수술 후 회복 챔버에 머무르게 한 뒤 케이지로 이동시켰다13).
- 부검 후 위를 대만부를 따라 절개하여 위 내용물을 수집하였다. pH 측정 전 정확한 측정을 위하여 pH 4와 pH 7의 완충액 (buffer solution)의 순서로 교정한 후 수집한 위 내용물의 pH를 pH 측정기 (Istek Product, Korea)를 활용하여 측정하였다.
- 수술 5시간 후, 식도 및 위를 분리하였고 수술용 가위를 이용하여 식도를 세로로 절단하였다. 절단된 식도 내부는 0.
- 식도의 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris–HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT, protease inhibitor cocktail 을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (BioSpec Produ ct, Oklahoma, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12, 000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다.
- 식도조직에서 염증성 매개 인자인 NFκB를 측정하였다. 정상군에서 1.
- 1주일 동안 고형사료와 물을 충분히 공급하여 실험실 환경에 적응시킨 후 수술 24시간 전부터 절식하였다. 실험 당일 미발아 현미 및 발아시간을 달리한 현미를 미세하게 분쇄하게 100 mL씩 경구투여하고 1시간 후 Zoletile mixture (Vibrac, France) 25 mg/kg를 복강 주사하여 마취하였다. 복부를 2 cm 정도 개복을 하고, 대만 부위 및 인접한 날문 부위를 실크실로 묶은 후 복막과 피부를 봉합하였다.
- 실험 전날까지 고형사료와 물을 충분히 공급하였고 위 점막 손상 유발 실험 24시간 전부터 절식하였다. 실험 전, 정상군 (Nor)은 아무런 처치를 하지 않았으며, 위점막 손상 대조군 (Con)은 증류수를 경구 투여하였고, 미 발아 현미 추출물 투여군 및 48시간 발아 현미 추출물 투여군은 현미를 미세하게 분쇄하여 100 mL씩 경구 투여 한 후, 1시간 방치하였다. 그 다음 위 점막 손상을 유발하기 위하여 150 mM H Cl/60% ethanol을 각 0.
- 적출한 위 조직을 고정한 다음, 광학 디지털 카메라 (Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였고, 손상된 위점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co., Gyeonggi, Korea) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적을 측정한 후, 위 전체 면적과 비교하여 비율로 표시하였다.
- 식도를 세로로 절단하였다. 절단된 식도 내부는 0.9% NaCl로 세척한 후 깨끗한 부직포 위에 전개했으며 이를 광학 디지털 카메라 (Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 식도점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co.
- 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5 회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PB S-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 en hanced chemiluminescence (ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q20 00 Chemidoc (Lugen Sci Co.
- 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12, 000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 buffer A에두 번 washing 한 다음 100 mL의 buffer C (50 mM HEPE S, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DT T, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol)를 첨가해 재 부유 시킨 뒤 10분마다 vortex을 3번 하였다. 4℃에서 12, 000 rpm으로 1 0분간 원심 분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층 액을 얻어 –8 0℃에서 각각 냉동 보관하였다.
대상 데이터
- ICR 마우스 6주령 수컷 24마리 및 Sprague-Dawley (SD) 흰쥐 6주령 수컷 42마리를 나라 바이오 (Nara biotechnology, Seoul, Korea)에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험은 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회의 승인 (DHU2015-081, DHU2015-082)을 얻어 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다.
- Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthca re (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였고, Phenylmethyls ulfonyl fluoride (PMSF), nuclear factor-kappa B (NFκ B), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygen ase2 (COX2), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), in terleukin-6 (IL-6), Histone, β-actin과 2차 항체는 Sa nta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였으며, Protease inhibitor mixture, Ethylenediamin etetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industr ies, Ltd. (Osaka. Japan)에서 구입하였다. 또한, 2′, 7′-Dic hlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)와 Dihydrorhoda mine 123는 Molecular Probes (Eugene, OR, U.
- Japan)에서 구입하였다. 또한, 2′, 7′-Dic hlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)와 Dihydrorhoda mine 123는 Molecular Probes (Eugene, OR, U.S.A.)에서 ECL Western Blotting Detection Reagents는 GE Health care로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, US A)에서 구입하였다.
- 본 실험은 미 발아 현미와 발아시간을 달리한 현미를 시료로 사용하였다. 영천에서 재배한 현미 1.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료 (Samyang Co., Seoul, Korea) (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 항생제무첨가) 와 물을 충분히 공급하였다.
데이터처리
- Normal rat; Nor; reflux esophagitis rat; Con, reflux esophagitis rat treated with brown rice; BR, reflux esophagitis rat treated with treated with 24h germinated brown rice; 24h, reflux esophagitis rat treated with treated with 30h germinated brown rice; 30h, reflux esophagitis rat treated with treated with 36h germinated brown rice; 36h, reflux esophagitis rat treated with treated with 48h germinated brown rice; 48h, a~cDifferent letters show a significantly difference at p <0.05 as determined by one-way ANOVA followed by Tukey multiple comparison test.
- ) :(B) in serum. Normal rat; Nor; reflux esophagitis rat; Con, reflux esophagitis rat treated with brown rice; BR, reflux esophagitis rat treated with treated with 24h germinated brown rice; 24h, reflux esophagitis rat treated with treated with 30h germinated brown rice; 30h, reflux esophagitis rat treated with treated with 36h germinated brown rice; 36h, reflux esophagitis rat treated with treated with 48h germinated brown rice; 48h, a~dDifferent letters show a significantly difference at p <0.05 as determined by one- way ANOVA followed by Tukey multiple comparison test.
- 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 5% 수준에서 검증하였다. Student's paired t-test을 사용하여 미발아 현미를 투여한 군과 발아 현미를 투여한 군간의 통계적 유의성을 측정하였다 (p<0.05).
- 05 as determined by one-way ANOVA followed by Tukey multiple comparison test. The Student's paired t-test was carried out to compare with the reflux esophagitis rats (*p <0.05).
- ND: Not detected. a~cDifferent letters show a significantly difference at p <0.05 as determined by one way ANOVA followed by Tukey multiple comparison test.
- 0, IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 Tukey Multiple Comparison test로 사후검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다. 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 5% 수준에서 검증하였다. Student's paired t-test을 사용하여 미발아 현미를 투여한 군과 발아 현미를 투여한 군간의 통계적 유의성을 측정하였다 (p<0.
- 모든 수치는 평균과 표준오차로 표시하였으며, SPSS (Version 22.0, IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 Tukey Multiple Comparison test로 사후검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다. 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 5% 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 9% NaCl로 세척한 후 깨끗한 부직포 위에 전개했으며 이를 광학 디지털 카메라 (Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 식도점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co., 한국) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적을 측정하였다.
성능/효과
- 1. 발아 현미의 경구투여는 급성 위염 마우스모델에서 위 조직의 육안적인 손상을 유의하게 감소시켰다.
- 2. 발아 현미의 경구투여는 역류성 식도염 유발 동물 모델에서 식도 조직의 육안적인 손상을 유의하게 감소시켰다.
- 3. 발아 현미의 경구투여는 역류성 식도염 유발 동물 모델에서 위 분비물의 pH 변화에 영향을 주지 않았다.
- 4. 발아 현미의 경구투여는 역류성 식도염 유발 동물 모델에서 혈청의 산화스트레스 바이오마커인 ROS 및 ONOO- 를 유의하게 감소시켰다.
- 5. 발아 현미의 경구투여는 역류성 식도염 유발 동물 모델에서 식도 조직 내에서 NFκB의 발현을 유의하게 감소시켰다.
- 6. 발아 현미의 경구투여는 역류성 식도염 유발 동물 모델에서 식도 조직 내 염증성 사이토카인인 COX-2와 iNOS, TNF-ɑ, IL-6의 발현을 유의하게 감소시켰다.
- iNOS의 경우 정상군 (1.00 ± 0.32)에 비해 대조군 (1.40 ± 0.23 (p<0.05)) 은 증가하였으며 미발아 현미투여군은 1.3 1 ± 0.32으로 감소하는 경향을 보였고, 발아현미 투여군은 발현이 감소되었으며 48시간 발아 현미 투여군의 경우 1.18 ± 0.13으로 유의한 감소를 보였다(Fig. 8B).
- 급성위염 동물모델에서 부검 후 적출한 위를 촬영하고 이미지 분석 프로그램을 통해 위의 전체 면적 및 염증, 발적, 출혈 부위를 측정한 결과 정상군에서는 손상 부위가 없었으며 대조군에서는 위 점막 손상도가 매우 높게 나타났다. 미 발아 현미 투여군에서는 위 점막 손상도가 감소하였고, 48시간 발아 현미 투여군은 유의한 개선 효과를 나타내었다.
- 따라서 발아 현미의 경구투여는 급성 위염 보호 효능이 있고, 발아시간에 비례하게 산화스트레스를 억제하여 식도를 보호함으로서 역류성 식도염의 개선에 효과를 보인다.
- 또한 ONOO- 측정 결과, 정상군 (267.33 ± 38.31 fluore scence/min/mL) 보다 대조군 (398.20 ± 28.76 (p<0.00 1))은 크게 증가하였으며 BR군에서는 388.33 ± 47.91로 나타나 감소하는 모습을 보였으며, 발아 시간이 증가할수록 ON OO-의 발현이 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 6B).
- 또한 역류성 식도염 동물모델에서 유발 전 미발아 현미와 발아 시간을 달리한 현미를 미세하게 분쇄하여 경구 투여한 결과, 발아시간에 비례하게 식도 손상도가 감소한 모습을 나타냈다. 식도 손상 억제 기전을 밝히기 위하여 수집한 위 내용물의 pH를 측정한 결과 정상군에 비하여 대조군의 pH가 유의하게 감소하였지만 미 발아 현미 및 발아현미 투여군에서는 유의한 효과를 얻을 수 없었다.
- 또한 염증성 매개 인자인 COX-2, iNOS, TNF-α, IL-6 의 발현을 확인한 결과, COX-2의 발현은 정상군 (1.00 ± 0.22)에 비해 대조군 (1.49 ± 0.43 (p<0.05)) 은 유의성 있게 증가하였으며 미발아 현미 투여군(1.46 ± 0.25)은 대조군과 유사한데 비하여 발아 현미 투여군은 각각 1.30 ± 0.3 0, 1.27 ± 0.25, 1.22 ± 0.26, 1.00 ± 0.21 (p<0.05)로서 발아시간에 의존적으로 감소함을 보였다 (Fig. 8A).
- 이는 HCl/ethanol에 의한 위 손상이 정상적으로 이루어 졌음을 의미한다. 또한, 미발아 현미 투여군은 271.61 ± 58.66 (p<0. 001), 48시간 발아 현미 투여군은 116.22 ± 40.11 (p<0.00 1)의 위 손상을 보여 미발아 현미를 섭취하였을 때, 위 점막보호 효과를 있음을 확인하였을 뿐 아니라, 발아하였을 때 더 높은 보호효과를 보이는 것으로 나타났다 (Fig. 3).
- 위 점막 손상도가 매우 높게 나타났다. 미 발아 현미 투여군에서는 위 점막 손상도가 감소하였고, 48시간 발아 현미 투여군은 유의한 개선 효과를 나타내었다.
- 부검 후 정상군의 위 분비물의 pH를 측정한 결과, 4.95 ± 0.10 으로 측정되었고, 대조군은 2.15 ± 0.42 (p<0.001)으로 감소된 모습을 보였다. 그러나 미발아 현미 및 발아 현미에서는 pH의 유의한 변화를 관찰할 수 없었다 (Fig.
- 분리한 혈청에서 항산화 관련 바이오 마커인 ROS 및 ONOO-를 측정한 결과 대조군에서는 높은 산화 스트레스를 보였고 발아 현미 투여군에서는 유의하게 감소하였다.
- 역류성 식도염 동물 모델에서 미발아 현미와 발아 현미의 경구 투여가 미치는 영향을 연구하였을 때, 염증성 사이토카인의 발현 감소로 유의하게 염증을 억제함을 확인하였으나, 위산의 pH에는 영향을 미치지 않으며 산화적 스트레스를 억제함으로서 식도 점막 보호효과를 보이는 것으로 확인하였다. 이상의 결과들로 현미는 발아시간에 비례하게 상부 위장관 보호 효능이 있는 것으로 판단되며 급성 위염 및 역류성 식도염 치료제로서의 개발 가능성을 보여준다.
- 01)의 손상도를 보였다. 역류성 식도염 유발 전 발아시간을 달리한 현미를 경구투여한 24h, 30h, 36h, 48h 군의 경우 각각 187.91 ± 45.01 (p<0.001), 155.86 ± 73.85 (p<0.001), 149.55 ± 19.56 (p<0.001) , 98.84 ± 45.13 (p<0.01)로 나타나, 발아 시간에 비례하게 식도 보호 효과를 보이는 것으로 나타났다 (Fig. 4).
- 염증성 사이토카인의 발현을 분석한 결과 COX-2, iNOS, TNF-α, IL-6의 발현이 현저히 감소되었고 이로 인하여 NF κB의 발현 또한 억제하여 염증이 감소됨을 확인하였다. 이러한 염증성 관련 바이오마커의 유의성 있는 감소는 발아 현미의 경구투여가 발아시간에 비례하게 역류성 식도염 보호 효과가 있음을 의미한다.
- 정상군에 비하여 역류성 식도염을 유발한 대조군의 경우 3 51.28 ± 76.59 (p<0.001)AU의 높은 식도 점막 손상도를 보였고, 미발아 현미를 경구투여한 후 역류성 식도염을 유발한 BR군의 경우 218.63 ± 68.29 (p<0.01)의 손상도를 보였다. 역류성 식도염 유발 전 발아시간을 달리한 현미를 경구투여한 24h, 30h, 36h, 48h 군의 경우 각각 187.
- 혈청을 이용하여 산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS를 측정한 결과, 정상군 (111 ± 9.26 fluorescence/min/mL) 에 비하여 대조군 (225 ± 24.00 (p<0.001))은 유의하게 증가하였고, BR군 (163.20 ± 39.76 (p<0.01)) 및 24h군 (14 9.00 ± 14.43 (p<0.0001)) 은 발현이 감소하였다. 30h군은 144.
후속연구
- 급성 위염 동물 모델에서 미발아 현미 및 발아현미의 경구투여가 육안적으로 위 점막 손상을 개선하는 것을 확인하였으나, 그 기전에 관한 추후 연구가 필요하다고 판단된다. 역류성 식도염 동물 모델에서 미발아 현미와 발아 현미의 경구 투여가 미치는 영향을 연구하였을 때, 염증성 사이토카인의 발현 감소로 유의하게 염증을 억제함을 확인하였으나, 위산의 pH에는 영향을 미치지 않으며 산화적 스트레스를 억제함으로서 식도 점막 보호효과를 보이는 것으로 확인하였다.
- 역류성 식도염 동물 모델에서 미발아 현미와 발아 현미의 경구 투여가 미치는 영향을 연구하였을 때, 염증성 사이토카인의 발현 감소로 유의하게 염증을 억제함을 확인하였으나, 위산의 pH에는 영향을 미치지 않으며 산화적 스트레스를 억제함으로서 식도 점막 보호효과를 보이는 것으로 확인하였다. 이상의 결과들로 현미는 발아시간에 비례하게 상부 위장관 보호 효능이 있는 것으로 판단되며 급성 위염 및 역류성 식도염 치료제로서의 개발 가능성을 보여준다.
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