[논문]대한민국 울진 연안 해양에서 분리한 해양 미생물 Ruegeria sp. 50C-3의 동정 및 내열성 효소 생산

지원재; 김종희; 박재선; 홍순광

doi:10.7845/kjm.2016.6049

대한민국 울진 연안 해양에서 분리한 해양 미생물 Ruegeria sp. 50C-3의 동정 및 내열성 효소 생산
Identification of a new marine bacterium Ruegeria sp. 50C-3 isolated from seawater of Uljin in Korea and production of thermostable enzymes 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.52 no.3, 2016년, pp.344 - 351

지원재 (국립생물자원관 유용자원분석과) , 김종희 (서일대학교 식품영양과) , 박재선 (명지대학교 생명과학정보학과) , 홍순광 (명지대학교 생명과학정보학과)

초록
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대한민국 동해안 울진 앞 바닷물로부터 50-C로 명명한 해양 미생물을 분리하였다. 50-C 균주는 그람-음성, 호기성 세균이며, 노란색 집락을 형성하고, 극성편모를 갖는 박테리아이다. 이 균주는 $20-50^{\circ}C$, pH 5.5-8.5 범위에서 자라며, 비교적 고온인 $40-50^{\circ}C$, pH 6.5-7.5, 2% (w/v) NaCl에서 최적 성장을 보인다. 16S rRNA 유전자 서열 분석결과 50C-3 균주는 Ruegeria 속에 속하는 R. intermedia CC-GIMAT-$2^T$, R. lacuscaerulensis ITI-$1157^T$의 16S rRNA 유전자 서열과 각각 99.4%, 96.98% 상동성을 보였다. 그러나 50C-3 균주는 운동성, 탄소이용능력, 효소생산능력 등의 생리학적 특성에서 두 균주와는 명확히 다른 특성을 보였다. 50C-3 균주의 DNA G+C content는 66.7 mol%이고, 주요한 respiratory quinone은 ubiquinone-10 (Q-10)이었다. 이와 같은 형태학적, 생리학적, 유전학적 특성을 비교하여, 50C-3 균주는 R. intermedia CC-GIMAT-$2^T$와 같은 종에 속하는 새로운 변종으로 판단되며 Ruegeria sp. 50C-3으로 명명하였다(KCTC23890 =DSM25519). 50C-3 균주는 cellulase, agarase 활성은 없었지만, alkaline phosphatase, ${\alpha}$-galactosidase, ${\beta}$-galactosidase를 생산하였고 이들 모두 $50^{\circ}C$ 에서도 활성이 좋은 내열성 효소일 것으로 판단되었다. 특히, ${\beta}$-galactosidase의 경우 $37^{\circ}C$에서 보다 $50^{\circ}C$에서의 활성이 1.9배 증가하여 산업적으로 활용성이 클 것으로 예상된다.

Abstract ▼ AI-Helper

A marine bacterium, designated as strain 50C-3, was isolated from a seawater sample collected from the East Sea of South Korea. The strain is a Gram-negative, aerobic, yellow colored polar-flagellated bacterium that grows at $20-50^{\circ}C$ and pH 5.5-8.5. Optimal growth occurred at $40-50^{\circ}C$, at pH 6.5-7.5, and in the presence of 2% (w/v) NaCl. Based on 16S rRNA gene sequence similarity, the isolate was considered to represent a member of the genus Ruegeria. The result of this analysis showed that strain 50C-3 shared 99.4% and 96.98% sequence similarity with Ruegeria intermedia CC-GIMAT-$2^T$ and Ruegeria lacuscaerulensis ITI-$1157^T$, respectively. Furthermore, strain 50C-3 showed clear differences from related strains in terms of several characteristics such as motility, carbon utilization, enzyme production, etc. The DNA G+C content was 66.7 mol%. Chemotaxonomic analysis indicated ubiquinone-10 (Q-10) as the predominant respiratory quinone. Based on phenotypic, chemotaxonomic, and phylogenetic characteristics, the isolate represents a novel variant of the Ruegeria intermedia CC-GIMAT-$2^T$, for which we named Ruegeria sp. 50C-3 (KCTC23890=DSM25519). Strain 50C-3 did not produce cellulase and agarase, but produced alkaline phosphatase, ${\alpha}$-galactosidase, and ${\beta}$-galactosidase. The three enzymes showed stable activities even at $50^{\circ}C$ and thus regarded as thermostable enzymes. Especially, the ${\beta}$-galactosidase activity enhanced by 1.9 times at $50^{\circ}C$ than that at $37^{\circ}C$, which may be very useful for industrial application.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 Ruegeria 속의 여러가지 생물학적 속성에 관한 연구는 전혀 보고 되어 있지 않다. 본 연구에서는, 대한민국 울진 해변에서 분리한 Ruegeria 속 미생물의 분류학적 특성과 이 균주가 생산하는 효소 생산의 특징에 관하여 기술하였다.

제안 방법

회수된 균체로부터 염색체 DNA를 Genomic DNA extraction kit (DyneBio)로 추출하여 PCR 주형으로 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하여 증폭하였으며(Stackebrandt and Goebel, 1994), 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T easy vector (Promega)에 클로닝 한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 서열은 GenBank에 Q237690으로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BlastN program(Altschul et al.
반응은 1 M Na₂CO₃ 용액 500 µl를 넣어 정지시키고, 420 nm에서의 흡광도(OD₄₂₀)로 기질로부터 유리된 p-nitrophenol의 양을 측정하였다. Alkaline phosphatase 활성은 galactosidase 활성 측정과 유사한 방법으로 측정하였다. 단, 기질은 p-nitrophenyl phosphate(pNPP), 반응완충액은 150 mM Tris-Cl (pH 8.
Galactosidase 활성은 인공발색용 기질인 p-nitrophenyl α-D-galactopyranoside와 p-nitrophenyl β-D-galactopyranoside을 각각 사용하여, α-D-galactosidase 및 β-D-galactosidase 활성을 측정하였다.
생화학적 특성 분석에는 균주 50C-3를 MB-gelrite 평판고체배지로 40℃에서 2일간 배양 후 회수된 균체를 사용하였다. Isoprenoid quinones은 추출 후 역상 고속 액체크로마토그래피(reverse phase High Performance Liquid Chromatography)로 분석하였다(Komagata and Suzuki, 1987). 균체의 지방산은 메틸-에스터화 시킨 fatty acid methyl esters (FAME) 혼합물을 Microbial Identification system (MIDI)의 지침에 따라 가스크로마토그래피(gas chromatography) 분석법으로 분석하였다(Sasser, 1990).
pH 변화에 따른 균주 50C-3의 성장은, pH 5.0–pH 10.0 (pH 0.5 간격)의 평판고체배지를 만들어 균주를 접종한 후 4일간 배양하여 성장을 관찰하였다.
2] 액체배지에 접종하고 28℃, 37℃, 50℃에서 7일 동안 진탕 배양하면서(180 rpm), 일정시간 간격으로 샘플을 채취하였다. 각 샘플의 흡광도를 600 nm에서 측정(OD₆₀₀)하여 샘플의 균체 성장 정도를 측정하였고, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 샘플 상등액 만을 취하여 효소 활성을 측정하였다. Agarase 효소활성은 0.
균주 50C-3은 Gram stain kit (BD)를 사용하여 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 균주 50C-3의 균체 크기 및 모양 그리고 편모의 유무는 2일간 평판고체배지에서 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid로 염색한 후 투과전자현미경(JEM1010, JEOL)으로 관찰하였다.
균주 50C-3을 ASW (Artificial Sea Water)-YP [6.1 g Tris base, 12.3 g MgSO₄, 0.74 g KCl, 0.13 g (NH₄)₂HPO₄, 17.5 g NaCl, 0.14 g CaCl₂, 1% yeast extract, 0.3% bacto peptone; per L; pH 7.2] 액체배지에 접종하고 28℃, 37℃, 50℃에서 7일 동안 진탕 배양하면서(180 rpm), 일정시간 간격으로 샘플을 채취하였다. 각 샘플의 흡광도를 600 nm에서 측정(OD₆₀₀)하여 샘플의 균체 성장 정도를 측정하였고, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 샘플 상등액 만을 취하여 효소 활성을 측정하였다.
균주 50C-3은 Gram stain kit (BD)를 사용하여 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 균주 50C-3의 균체 크기 및 모양 그리고 편모의 유무는 2일간 평판고체배지에서 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid로 염색한 후 투과전자현미경(JEM1010, JEOL)으로 관찰하였다. 탄소원 사용 및 발효, 효소생산 등의 생리적 특성은 API 20NE와 API ZYM kit (bioMérieux)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
균주 50C-3의 성장 특성은, NaCl을 최종농도 0–10% (w/v, 1% 간격)가 되도록 첨가한 MB-gelrite 평판고체배지에 균주를 접종한 후 4일간 배양하여 성장을 관찰하였다.
균주의 배양온도에 따른 성장곡선으로부터 최대 성장을 보인 28℃, 5일 배양액으로부터 세포를 완전히 제거한 효소의 조추출액(crude-extract)을 제조하였다. 조추출액에 존재하는 여러 분해효소(hydrolytic enzymes) 활성을 측정한 결과, skim milk나 casein 분해 능력은 전혀 나타나지 않았다.
단, 제공되는 배지에 NaCl을 최종농도 2%가 되도록 첨가하여 50°C에서 24시간 배양한 후 관찰하였다.
도말한 평판고체배지는 50°C에서 2일간 배양하였으며, 성장한 콜로니를 새로운 MB 평판고체배지에 연속적으로 계대배양하여 순수하게 미생물을 분리하였다.
, 1997)을 사용하여 GenBank database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다. 또한 EzTaxon database (http://www.eztaxon.org/)로부터 표준 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 확보하여 계통발생적 연관성을 분석하였다(Chun et al., 2007). 확보된 염기서열들 간의 Multi alignment는 ClustalW program (Thompson et al.
또한 배양온도에 따른 성장은 4, 10, 15, 20 28, 37, 40, 45, 50, 55°C에서 각각 4일간 배양하여 성장 정도를 관찰하였다.
반응은 1 M Na2CO3 용액 500 µl를 넣어 정지시키고, 420 nm에서의 흡광도(OD420)로 기질로부터 유리된 p-nitrophenol의 양을 측정하였다.
16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하여 증폭하였으며(Stackebrandt and Goebel, 1994), 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T easy vector (Promega)에 클로닝 한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 서열은 GenBank에 Q237690으로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BlastN program(Altschul et al., 1997)을 사용하여 GenBank database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다. 또한 EzTaxon database (http://www.
생화학적 특성 분석에는 균주 50C-3를 MB-gelrite 평판고체배지로 40℃에서 2일간 배양 후 회수된 균체를 사용하였다. Isoprenoid quinones은 추출 후 역상 고속 액체크로마토그래피(reverse phase High Performance Liquid Chromatography)로 분석하였다(Komagata and Suzuki, 1987).
진화적 거리(evolutionary distance matrix)는 Kimura’s two-parameter evolutionary model (Kimura, 1983)에 의해 계산하였고, Neighbour-joining (NJ) 법(Saitou and Nei, 1987)으로 계통수를 제작하였다. 신뢰도(bootstrap value)는 1,000회의 재구성된 자료로부터 새롭게 tree를 제작하여 계산하였다.
으로 희석한 후 Marine Broth 2216 (MB, Difco) 평판 고체배지에 도말 하였다. 평판고체배지제작은 agar 대신에 고온에 안정한 0.8% (w/v) gelrite (Duchefa)를 첨가하여 제작하였다. 도말한 평판고체배지는 50°C에서 2일간 배양하였으며, 성장한 콜로니를 새로운 MB 평판고체배지에 연속적으로 계대배양하여 순수하게 미생물을 분리하였다.
균주 50C-3을 MB 액체배지에 접종하고 50°C에서 2일간 진탕 배양 후 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체 만을 회수하였다. 회수된 균체로부터 염색체 DNA를 Genomic DNA extraction kit (DyneBio)로 추출하여 PCR 주형으로 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하여 증폭하였으며(Stackebrandt and Goebel, 1994), 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T easy vector (Promega)에 클로닝 한 후 염기서열을 분석하였다.

대상 데이터

The GenBank/EMBL/DDBJ accession number for the 16S rRNA gene sequence of strain 50C-3 is JQ237690. The strain 50C-3 was deposited in DSM (DSM25519) and KCTC(KCTC23890).
대한민국 경상북도 울진 근해의 해수를 채취하여 멸균수에 10-1–10-5으로 희석한 후 Marine Broth 2216 (MB, Difco) 평판 고체배지에 도말 하였다.
도말한 평판고체배지는 50°C에서 2일간 배양하였으며, 성장한 콜로니를 새로운 MB 평판고체배지에 연속적으로 계대배양하여 순수하게 미생물을 분리하였다. 이 중 하나의 콜로니를 50C-3으로 명명하고, 본 연구에 사용하였다.

이론/모형

Agarase 효소활성은 0.2% agarose를 기질로 하고 20 mM Tris-Cl (pH 7.0) 완충액을 사용하여 40°C에서 반응 시킨 후 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)법(Temuujin et al., 2012)으로 540 nm에서 흡광도(OD540)를 측정하였다.
균체의 지방산은 메틸-에스터화 시킨 fatty acid methyl esters (FAME) 혼합물을 Microbial Identification system (MIDI)의 지침에 따라 가스크로마토그래피(gas chromatography) 분석법으로 분석하였다(Sasser, 1990). Genomic DNA의 G+C 함량은 역상 고속 액체크로마토그래피를 이용하였다(Mesbah et al., 1989).
The evolutionary distances were computed using the Kimura’s 2-parameter method and are in the units of the number of base substitutions per site.
Isoprenoid quinones은 추출 후 역상 고속 액체크로마토그래피(reverse phase High Performance Liquid Chromatography)로 분석하였다(Komagata and Suzuki, 1987). 균체의 지방산은 메틸-에스터화 시킨 fatty acid methyl esters (FAME) 혼합물을 Microbial Identification system (MIDI)의 지침에 따라 가스크로마토그래피(gas chromatography) 분석법으로 분석하였다(Sasser, 1990). Genomic DNA의 G+C 함량은 역상 고속 액체크로마토그래피를 이용하였다(Mesbah et al.
진화적 거리(evolutionary distance matrix)는 Kimura’s two-parameter evolutionary model (Kimura, 1983)에 의해 계산하였고, Neighbour-joining (NJ) 법(Saitou and Nei, 1987)으로 계통수를 제작하였다.
탄소원 사용 및 발효, 효소생산 등의 생리적 특성은 API 20NE와 API ZYM kit (bioMérieux)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
확보된 염기서열들 간의 Multi alignment는 ClustalW program (Thompson et al., 1994)을 사용하였고 5′-과 3′-말단의 gap은 BioEdit program (Hall, 1999)으로 편집하였다.

성능/효과

α-Galactosidase 활성은 비교적 강하게 나타났으며, 효소활성은 역시 50℃ (OD420=0.759) 보다 37℃ (OD420=0.766)에서 반응시켰을 때 미세하게 증가하였다.
16S rRNA 유전자 서열을 기초로 작성한 NJ 계통수(phylogenetic tree)에서도 50C-3과 R. intermedia CC-GIMAT-2^T가 다른 Ruegeria 종들과는 확실히 구분되는 진화학적 위치를 보여주었다(Fig. 2). 이들 결과로부터 우리는 50C-3 균주가 R.
ASW-YP 배지에서 배양온도를 달리하여 배양했을 때, 28℃에서 가장 좋은 성장을 보였는데 접종 후 점차적으로 성장이 증가하여 5–6일째에 최대 성장(OD600=1.36)을 보였다.
Alkaline phosphatase와 αgalactosidase도 37℃와 50℃에서의 활성차이가 미미한 결과로부터, 이 두 효소도 내열성 효소일 가능성이 클 것으로 사료되었다.
Mesophile 보다는 고온성 미생물인 Ruegeria 종에 관한 연구가 거의 이루어지지 않은 점을 감안하면, 본 연구는 여러 가지 산업적으로 중요한 내열성 효소를 본 균주가 생산할 수 있는 가능성을 보여 주었다. 따라서, 50C-3 균주가 생산하는 내열성 효소의 특성을 규명하고 활용하는 연구가 필요하다.
균주 50C-3은 16S rRNA 유전자 서열분석 결과, R. intermedia CC-GIMAT-2^T와 가장 높은 상동성(99.4%)을 보였다. 비록 비교할 수 있는 R.
그 외 Ruegeria 종들의 16S rRNA 유전자 서열은 50-C와 비교했을 때 상동성이 97% 이하 – R. lacuscaerulensis ITI-1157T(96.9%), R. atlantica IAM 14463T(95.9%), R. pomeroyi DSS-3T(95.5%), R.halocynthia MA1-6T(95.2%) – 로 나타났다.
따라서 균주의 최대성장 온도는 28℃이지만, 배양시간을 고려한 경제적 효율성은 37°C에서 배양하는 것이 좋을 것으로 판단하였다.
7%이하이면 신종으로 인정하고 있다(Stackebrandt and Goebel, 1994; Stackebrandt and Ebers, 2006). 따라서, 균주 50C-3은 R. intermedia CC-GIMAT-2^T와 같은 종에 속하는 변종으로 예상되었다.
4%)을 보였다. 비록 비교할 수 있는 R. intermedia CC-GIMAT-2^T의 16S rRNA 유전자 서열은 총 1,334 염기로 97% 만 비교대상이 되었지만, 이 중 8개 만이 다른 염기서열을 갖고 있었다. 그 외 Ruegeria 종들의 16S rRNA 유전자 서열은 50-C와 비교했을 때 상동성이 97% 이하 – R.
평판고체배지상에서 배양했을 때, 50C-3 균주는 MB 배지, ASW-YP 배지에서는 성장하는 반면, LB (Luria Bertani), ASW 배지에서는 성장하지 못했다. 액체배양 시에는 MB 배지와 ASW-YP 배지에서 성장을 보였으며, MB 배지 보다는 ASW-YP 배지에서 더 좋은 성장을 나타냈다.
이들 결과로부터 우리는 50C-3 균주가 R.intermedia CC-GIMAT-2T 표준균주의 변이 아종(subspecies)일 것으로 예상하였다.
intermedia와 분명한 차이점을 보였다(Table 1). 이러한 유전학적, 형태학적, 생화학적 특성 분석 결과, 50C-3 균주는 표준 균주인 R. intermedia CC-GIMAT-2^T와는 다른 아종으로 결론지었다.
균주의 배양온도에 따른 성장곡선으로부터 최대 성장을 보인 28℃, 5일 배양액으로부터 세포를 완전히 제거한 효소의 조추출액(crude-extract)을 제조하였다. 조추출액에 존재하는 여러 분해효소(hydrolytic enzymes) 활성을 측정한 결과, skim milk나 casein 분해 능력은 전혀 나타나지 않았다. 이는 50C-3 균주가 단백질 성분으로 구성된 LB 배지에서 성장하지 않은 이유를 설명해 줄 수 있을 것으로 사료된다.
특이한 것은 아주 강한 β-galactosidase 활성이 관찰되었으며, 효소활성은 37℃(OD420=1.276) 보다 50℃(OD420=2.424)에서 현저히 증가(1.9배)하여, 이 효소는 50℃에서도 안정적으로 작용할 수 있는 내열성효소일 것으로 판단되었다.
, 2008). 특히 50C-3 균주는 16S rRNA 유전자 서열 상동성이 가장 높은 R. intermedia와 대부분의 형태학적 특징이 동일하였지만, 극성 편모에 의한 운동성을 갖는다는 점에서 확연한 차이를 보였다(Fig. 1B). 효소활성에서도 50C-3 균주는 α-galactosidase 및 β-galactosidase 활성을 보였고, 유일 탄소원으로 포도당을 이용하지 못한다는 점에서 R.
효소활성에서도 50C-3 균주는 α-galactosidase 및 β-galactosidase 활성을 보였고, 유일 탄소원으로 포도당을 이용하지 못한다는 점에서 R.intermedia와 분명한 차이점을 보였다(Table 1).

후속연구

Mesophile 보다는 고온성 미생물인 Ruegeria 종에 관한 연구가 거의 이루어지지 않은 점을 감안하면, 본 연구는 여러 가지 산업적으로 중요한 내열성 효소를 본 균주가 생산할 수 있는 가능성을 보여 주었다. 따라서, 50C-3 균주가 생산하는 내열성 효소의 특성을 규명하고 활용하는 연구가 필요하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Ruegeria 속이란?	, 2014)가 보고되었다. Ruegeria 속은 막대형(rod-shaped)의 호기성 그람-음성 비광합성 세균이며, catalase-양성, oxidase-양성, DNA G+C 함량은 55%–68% 범위에 속하는 것으로 알려져 있다(Yi et al., 2007).
	50-C 균주란?	대한민국 동해안 울진 앞 바닷물로부터 50-C로 명명한 해양 미생물을 분리하였다. 50-C 균주는 그람-음성, 호기성 세균이며, 노란색 집락을 형성하고, 극성편모를 갖는 박테리아이다. 이 균주는 $20-50^{\circ}C$, pH 5.
	Ruegeria 속에 속하는 세균은 어디서 분리되었는가?	, 2007). 고온성 호수에서 분리한 R. lacuscaerulensis를제외한 모든 Ruegeria 종은 해수 환경에서 분리되었다(Petursdottir and Kristjansson, 1997). 지금까지 Ruegeria 속에 관한 연구논문은 총 42편이 보고되었으며, 이 중의 절반은 미생물 분류에 대한 내용이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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