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문제 정의
- Enteritidis의 성장예측모델 개발18) 등으로 Salmonella 오염이 가장 문제가 되는 계란에서의 위해평가를 위한 연구는 매우 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 보관온도가 액란의 난백과 난황에서 Salmonella Enteritidis와 Salmonella Typhimurium 수 변화에 미치는 영향을 비교 분석하고 액란에서 두 Salmonella 균주의 위험성을 비교하여 관리방안을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 10, 15, 25, 35°C의 난황에서 S. Enteritidis와 S. Typhimurium 두 혈청 형의 증식패턴은 Modified Gompertz equation에 잘 적용되었으며(R2> 0.98), Modified Gompertz model을 이용하여 S. Enteritidis와 S. Typhimurium의 유도기(LT), 최대증식속도(SGR) 및 최대개체군밀도(MPD)값을 구해내었다.
- 24시간 동안 전 배양된 S. Enteritidis와 S. Typhimurium을 멸균된 0.1% peptone water (Difco) 9 ml에 십진희석법을 통하여 단계별로 희석한 후, 난황, 난백 시료 10 ml에 100 µl를 각각 접종하였다.
- Modified Gompertz equation에서 산출된 LT, SGR 및 MPD값을 Davey model과 Square-root model 및 Polynomial second order model에 각각 대입하여 보관온도의 영향을 보기 위한 2차 성장예측 모델을 개발 하였다(Fig. 3). 모든 온도에서 S.
- S. Enteritidis와 S. Typhimurium 이 각각 접종된 시료를 8, 10, 15, 25, 35°C에서 호기상태로 저장하여 균의 보관온도에 따른 수의변화를 분석하였다.
- 각 온도에서 S. Enteritidis와 S. Typhimurium의 1차 성장예측모델 개발을 위해 Graph Pad Prism V4.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) 프로그램을 사용하여 Modified Gompertz 식을 이용하여19) 1차 성장예측 모델을 개발하고 유도기(Lag Time, LT)와 최대 증식 속도(Maximum specific growth rate, SGR), 및 최대개체군밀도(Maximum population density, MPD)를 도출하였다.
- 각 온도에서 개발된 1차 모델 변수인 유도기(LT), 최대 증식 속도(SGR) 및 최대개체군밀도(MPD)는 Davey model20) 과 Square-root model21) 및 Polynomial second order model22) 식을 이용하고, Graph Pad Prism V4.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA)프로그램에 적용하여 1차 모델에서 얻어진 유도기, 최대증식속도 및 최대개체군밀도에 관한 2차 성장예측 모델을 각각 개발하였다.
- 각각의 분주된 배지는 36°C incubator (ELELA, Vision, Korea)에서 24시간 배양한 후 균체 개수를 세어 log CFU/ml로 계수하였다.
- 1% peptone water를 시료가 들어있는 test tube에 넣어 vortexer (Type 37600 Mixer, Thermolyne, USA)를 사용하여 30초간 균질화하였다. 균질화된 시료 1 ml를 취하여 멸균된 0.1% peptone water 9 ml로 십진희석법을 통하여 각 농도 단계별로 희석하여 선택배지인 Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD Agar, MB cell, Kisan Bio, Korea)에 균일하게 분주하였다. 각각의 분주된 배지는 36°C incubator (ELELA, Vision, Korea)에서 24시간 배양한 후 균체 개수를 세어 log CFU/ml로 계수하였다.
- 반면 10, 15, 25, 35℃ 난황에서는 두 혈청 형 모두 성장하였으나 8℃에서는 감소하여 유통·판매 시 난황으로 준비된 액란을 냉장온도로 철저하게 관리해야할 것으로 판단된다. 난황에서 증식한 S. Enteritidis와 S. Typhimurium의 성장곡선을 Modified Gompertz model에 적용하여 산출된 유도기(LT)와 최대증식속도(SGR) 및 최대개체군밀도(MPD) 값을 Davey model과 Square-root model 및 Polynomial second order model을 이용하여 각각 온도의 영향을 나타내는 2차 모델을 개발하였다. 모든 온도에서 S.
- Enteritidis 위해 요소 평가를 시작하고 통제 프로그램을 개발하여 실행하였다9). 또한 미국과 유럽국가들은 S. Enteritidis와 같은 생물학적 위해요소의 위험성을 효율적으로 평가하고 제어하기 위해서 계란과 난 제품 내에서 S. Enteritidis의 성장예측 모델11), 전란액에서 S. Enteritidis type4와 type13을 포함한 총 5개의 Salmonella종의 성장예측 모델12) 등을 개발하였다. 그러나 대부분의 계란관련 연구가 S.
- 본 연구는 계란을 난백과 난황으로 분리하여, 액란 상태에서 8, 10, 15, 25, 35℃의 보관온도가 S. Enteritidis와 S. Typhimurium 두 혈청 형의 증식 또는 사멸패턴에 미치는 영향을 비교 분석하였다. 난백에서는 8, 10, 15, 35℃에서두 혈청 형 모두 감소하였으나 25℃에서는 두 혈청 형 모두 증식하여 상온에서의 관리에 대한 주의가 필요한 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 S. Enteritidis 2차 성장예측 모델의 S. Typhimurium 에 대한 적용가능성 평가를 위해 S. Enteritidis 의 2차 모델을 통해 얻은 예측값과 S. Typhimurium 실험값을 이용하여 bias factors (Bf)23,24)와 accuracy factors (Af)23,25)를 각각 구하였다.
- 본 연구에서는 난백에 S. Enteritidis와 S. Typhimurium을 각각 접종하고 8, 10, 15, 25, 35°C 온도에 저장하여 난백에서 두 혈청 형의 증식(사멸) 변화를 관찰하였다(Fig. 1).
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 액란시료는 서울시 동대문구의 인근 대형마트에서 판매되고 있는 HACCP 적용 및 항생제 무첨가 계란을 실험 당일에 구입하여 사용하였다. 상태가 양호한 계란을 선정하여 70% 알코올로 표면을 5분간 소독한 후 Clean Bench에서 5분간 건조하였다.
- 조사 대상균인 Salmonella Enteritidis (KCCM 12021)와 Salmonella Typhimurium (ATCC 13311)은 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms; KCCM)로 부터 구입하여 −80°C의 온도로 냉동 보관하였다.
데이터처리
- Duncan 의 다중 검정법을 이용한 일원분산분석과 T-test를 이용하여 샘플간의 유의적인 차이를 분석하였다(p < 0.05).
- Af는 실험값과 예측값의 차이의 절대값을 평가한 것으로, 1을 기준으로 Af값이 1에서 멀어질수록 개발된 모델의 부정확성을 나타내나 Af값은 안전한 모델인가, 위험한 모델인가에 대한 방향성을 제시하기에는 한계가 있다. 또한 예측 모델의 타당성을 나타내는 Median Relative Error (MRE)23,26)와 모델의 정밀도를 나타내는 Root Mean Square Error (RMSE)27,28)는 각각 다음 식을 이용하여 구하였으며 두 값 모두 0에 가까울수록 모델의 적합도가 높다.
- 연구결과는 SAS version 9.3 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA) 통계 프로그램을 이용하여 분석하였다. Duncan 의 다중 검정법을 이용한 일원분산분석과 T-test를 이용하여 샘플간의 유의적인 차이를 분석하였다(p < 0.
성능/효과
- 10°C에서 S. Enteritidis의 MPD값은 6.51 log CFU/ml 로 S. Typhimurium의 MPD값인 5.38 log CFU/ml 보다 높아, 전반적으로 10°C 이상의 온도에서는 S. Enteritidis의 증식이 빠른 것으로 나타났으나 두 혈청 형의 MPD값은 10°C와 15°C에서만 유의적 차이를 보였다(p < 0.05).
- LT값은 전반적으로 온도가 증가함에 따라 유의적으로 감소하였으며(p < 0.05), 모든 온도에서 S. Enteritidis의 LT가 짧은 것으로 나타났으나 25°C에서만 두 혈청 형이 유의적으로 차이가 있었다(P < 0.05).
- SGR의 경우 S. Enteritidis는 온도가 증가할수록 최대 증식 속도가 유의적으로 증가하였으나(P < 0.05), S. Typhimurium의 SGR 값은 10°C와 15°C에서는 유의적인 차이를 보이지 않았고, 25°C 이상에서 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(p < 0.05).
- Enteritidis 의 2차 모델을 검증한 결과는 Table 1과 같다. 개발된 2차 성장예측 모델을 통해 얻어진 예측값과 실제 실험에서 얻어 진 실험값을 이용한 Bf, Af, RMSE, MRE 값을 산출하여 개발된 S. Enteritidis의 2차모델이 S. Typhimurium 증식예측에 적합한지를 검증하였다. 검증 결과 S.
- 검증 결과 S. Enteritidis의 SGR모델은 Bf가 0.86으로 0.7~1.15 사이에 포함되고 Af (1.17)가 1과 가까우며 RMSE (0.07)와 MRE (−0.01)는 0과 비슷하여 S. Typhimurium의 SGR을 설명할 수 있을 것으로 사료된다.
- 15°C 이하의 온도에서 MPD값은 두 혈청 형이 차이를 보였으나 25°C 이상의 온도에서는 두 혈청 형 간의 차이가 보이지 않았다. 결론적으로 모든 온도에서 S. Enteritidis가 S. Typhimurium보다 유도기가 짧고 최대증식속도가 빠르게 나타나 액란 제품에서 S. Enteritidis의 위험성이 더 큰 것으로 나타났다. 따라서 최근 액란이 다양한 알 가공품에 사용되는 현황을 고려할 때, S.
- 그러나 8°C에서 두 혈청 형 모두 성장하지 않고 보관시간 100시간 이후로 점차 감소하는 양상을 나타내었고 360시간 경과하였을 때 S. Enteritidis은 1 log CFU/ml, S. Typhimurium은 0.7 log CFU/ml 이상 감소하여, S. Enteritidis의 감소가 더 빠르게 진행하는 것으로 나타났다.
- 난백에서 전반적으로 S. Enteritidis와 S. Typhimurium 모두 증식하지 못하는 것과는 달리 10°C 이상의 보관온도에서 난황에 오염된 두 혈청 형 모두 보관시간이 증가함에 따라 증식하였다(Fig. 2).
- 두 혈청 형의 SGR값은 15°C에서 유의적 차이를 보였으며(p < 0.05), S. Enteritidis가 빠르게 증식하는 것으로 나타났다.
- Typhimurium의 성장곡선을 Modified Gompertz model에 적용하여 산출된 유도기(LT)와 최대증식속도(SGR) 및 최대개체군밀도(MPD) 값을 Davey model과 Square-root model 및 Polynomial second order model을 이용하여 각각 온도의 영향을 나타내는 2차 모델을 개발하였다. 모든 온도에서 S. Enteritidis가 S. Typhimurium보다 유도기가 짧고 최대증식속도가 빠르게 나타나 액란 제품에서의 S. Enteritidis에 대한 위험성이 더 큰 것으로 나타났다.
- 3). 모든 온도에서 S. Enteritidis는 S. Typhimurium보다 LT가 짧았으나 온도가 증가함에 따라 두 혈청 형 사이에 LT값의 차이는 작아지는 것으로 나타났다. 반면 SGR값은 보관온도가 증가함에 따라 두 혈청 형의 차이가 커지는 것으로 나타났으며 전반적으로 모든 온도에서 S.
- Typhimurium보다 LT가 짧았으나 온도가 증가함에 따라 두 혈청 형 사이에 LT값의 차이는 작아지는 것으로 나타났다. 반면 SGR값은 보관온도가 증가함에 따라 두 혈청 형의 차이가 커지는 것으로 나타났으며 전반적으로 모든 온도에서 S. Enteritidis의 증식이 빠른 것으로 나타났다. 이는 10°C에서 저장한 계란 구이에서 S.
후속연구
- Typhimurium 의 위험성을 낮추기 위해 8°C 이하에서 액란을 판매 유통하는 것이 중요할 것으로 사료된다. 또한 액란 HACCP 공정과정에서 Salmonella의 오염관리에 대한 검증이 필요하며 특히 S. Enteritidis의 오염이 이루어 지지 않도록 농장, 식용란 수집판매업 등에서 교차오염 예방이 더욱 중요할 것으로 사료된다.
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