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문제 정의
- , 2000; Oh and Lee, 2008). 이에, 본 연구에서는 골대사의 활성이 저하되는 시점인 갱년기 이후에 골대사 뿐만 아니라 지질 및 당질대사에도 긍정적인 효과를 미치고 있는지의 여부를 확인함으로써 골쇄보를 갱년기 이후의 대사성 질환 예방 및 치료용 소재로의 활용을 위한 기본적인 연구 자료를 확보하고자 한다. 구체적으로는 12주령 흰쥐 암컷의 난소를 제거하여 갱년기를 유도한 이후, 골쇄보 열수추출물을 보충 급여함에 따른 지질, 지질 및 골대사 관련 바이오 마커를 분석함으로써 갱년기 이후 폐경에 따른 지질대사 개선효능 및 골다공증 예방 효능을 각각 조사하였다.
제안 방법
- , Seoul, Korea)로부터 구입하였고, 2주간 기본사료로 적응시킨 후 갱년기 유도를 위해 난소제거 수술을 시행하였다. 12시간 절식시킨 실험동물은 zoletile (Virbac, Carros, France, 25 ㎎/㎏)로 복강 마취하여 난소를 제거한 후 봉합하고, SHAM군은 난소제거를 제외한 수술과정을 동일하게 진행하였다. 2주의 회복기간을 거친 후 각각 모의대조군 (SHAM), 난소제거군 (OVX) 그리고 추출물을 첨가한 급여군 (OVX-DR)을 난괴법으로 군당 10마리씩 분류하였다.
- 12시간 절식시킨 실험동물은 zoletile (Virbac, Carros, France, 25 ㎎/㎏)로 복강 마취하여 난소를 제거한 후 봉합하고, SHAM군은 난소제거를 제외한 수술과정을 동일하게 진행하였다. 2주의 회복기간을 거친 후 각각 모의대조군 (SHAM), 난소제거군 (OVX) 그리고 추출물을 첨가한 급여군 (OVX-DR)을 난괴법으로 군당 10마리씩 분류하였다. 식이는 3군 모두 AIN-76 사료를 섭취하였고 실험군으로는 AIN-76 (Dyets Inc.
- Lipid profile의 분석은 아산제약 kit (Asan Pharamaceutical, Seoul, Korea)를 사용하여 총콜레스테롤 (TC), 중성지방 (TG), 고밀도 지단백 콜레스테롤 (HDL), 유리지방산 (FFA)을 측정하였다. 지질대사 관련 효소인 FAS (fatty acid synthase), ME(malic enzyme), CPT (carnitine palmitoyl-CoA transferase)는 각각 Gibson과 Hubbard (1960), Ochoa (1955), Bieber 등(1972)에 의한 방법으로 측정하였고, 골대사 관련 지표 측정을 위해 ELISA kit인 Cobas ALP (alkaline phosphatase liquid acc, Indianapolis, IN, USA), Cobas Ca2 (Calcium Gen.
- 갱년기 유도 및 시료공급 8주 후 사육을 종료하고, 실험동물을 12시간 절식시킨 뒤 zoletile을 이용하여 마취하였고, 복부 하대정맥에서 혈액을 채취하였으며, 장기조직 (간, 신장, 지방)을 적출하였다. 이후 혈액은 혈장과 분리하고 간, 신장 그리고 지방조직은 Hulcher와 Oleson (1973)의 방법을 수정하여 효소원을 분리 한 후 −70℃에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.
- 골쇄보 추출물을 급여한 흰쥐의 대퇴부 헤드 부분의 뼈밀도를 현미경으로 관찰하였다. 골격은 75%의 치밀골과 25%의 해면골로 이루어져 있는데, 해면골의 표면적이 넓으면 골격손실이 빨리 일어난다 (Choi et al.
- 이에, 본 연구에서는 골대사의 활성이 저하되는 시점인 갱년기 이후에 골대사 뿐만 아니라 지질 및 당질대사에도 긍정적인 효과를 미치고 있는지의 여부를 확인함으로써 골쇄보를 갱년기 이후의 대사성 질환 예방 및 치료용 소재로의 활용을 위한 기본적인 연구 자료를 확보하고자 한다. 구체적으로는 12주령 흰쥐 암컷의 난소를 제거하여 갱년기를 유도한 이후, 골쇄보 열수추출물을 보충 급여함에 따른 지질, 지질 및 골대사 관련 바이오 마커를 분석함으로써 갱년기 이후 폐경에 따른 지질대사 개선효능 및 골다공증 예방 효능을 각각 조사하였다.
- Moore ex Baker)의 식물학적 동정은 경북농업기술원 봉화 약초 시험장에서 이루어졌으며 이것의 확증표본 (표본번호: NIBRVP 0000035161)은 경북대학교 식품영양학과에 보관하였다. 시료는 증류수로 세척 한 후, 20배 부피의 증류수를 가한 뒤 약탕기 (OC-8300, OCOO Inc., Boryung, Korea)로 112℃에서 3시간 30분 동안 열수 추출하였으며, 추출물은 가아제를 이용하여 여과한 다음 농축하여 동결건조 분말을 만들었다.
- 이후 혈액은 혈장과 분리하고 간, 신장 그리고 지방조직은 Hulcher와 Oleson (1973)의 방법을 수정하여 효소원을 분리 한 후 −70℃에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.
- 이후 12시간에 걸쳐 저농도 알코올에서 고농도 알코올, xylene, paraffin 순으로 조직을 처리한 다음 샘플을 3 ㎛ 두께로 잘라 슬라이드에 고정시켰다. 제조된 슬라이드를 다시 xylene, 고농도 알코올, 저농도 알코올, 증류수 순으로 처리하여 hematoxylin으로 염색 후 다시 역순으로 xylene으로 치환한 다음 이를 광학현미경 Nikon Optiphot-2 light microscope (Nikon Instruments, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 골쇄보 (Davallia mariesii T. Moore ex Baker)의 식물학적 동정은 경북농업기술원 봉화 약초 시험장에서 이루어졌으며 이것의 확증표본 (표본번호: NIBRVP 0000035161)은 경북대학교 식품영양학과에 보관하였다. 시료는 증류수로 세척 한 후, 20배 부피의 증류수를 가한 뒤 약탕기 (OC-8300, OCOO Inc.
- 실험에 사용 된 동물은 평균 체중 245.30 ± 1.86 g인 10주령의 Sprague-Dawley 암컷 rat 30마리를 ㈜중앙동물실험 (Central Laboratory Animal Inc., Seoul, Korea)로부터 구입하였고, 2주간 기본사료로 적응시킨 후 갱년기 유도를 위해 난소제거 수술을 시행하였다.
데이터처리
- 다군간의 차이는 Tukey’s test에 의한 p < 0.05 수준에서 검정하였으며, 그 결과는 평균 ± 표준오차로 표시하였다.
- 본 연구의 모든 실험결과는 SPSS package program (statistical package for the social sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 각 실험군당 평균과 표준오차로 나타내었고, 각 군 간의 평균차이에 대한 유의성 검정은One-way analysis of variance (ANOVA)를 이용하였다. 다군간의 차이는 Tukey’s test에 의한 p < 0.
이론/모형
- 지질대사 관련 효소인 FAS (fatty acid synthase), ME(malic enzyme), CPT (carnitine palmitoyl-CoA transferase)는 각각 Gibson과 Hubbard (1960), Ochoa (1955), Bieber 등(1972)에 의한 방법으로 측정하였고, 골대사 관련 지표 측정을 위해 ELISA kit인 Cobas ALP (alkaline phosphatase liquid acc, Indianapolis, IN, USA), Cobas Ca2 (Calcium Gen.2, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), C-terminal telopeptide (Rat Laps™ EIA, Immunodiagnostic Systems, Fountain Hills, AZ, USA), osteocalcin (Rat Osteocalcin IRMA Kit, Immutopics, San Clemente, CA, USA)을 사용하였다.
성능/효과
- Moore ex Baker) 추출물을 급여했을 때 체중변화 및 식이 효율은 Table 1과 같다. 골쇄보 급여 시작 전의 그룹간의 체중은 유의적으로 차이가 없었으나 종료시점에는 OVX군이 SHAM군보다 상대적으로 체중이 더 많이 증가하였고, 식이섭취량과 식이섭취효율 역시 유의적으로 높은 것을 확인하였다. 폐경이 시작되면 에스트로겐 분비가 감소하고, 이 때 에너지조절 역할을 하는 시상하부에도 공급이 중단되면서 체중이 증가 하게 된다 (Mastorakos et al.
- 한편, 실험군인 골쇄보 추출물 급여군과 OVX군의 치밀골 두께는 유사한 것으로 나타났는데, 폐경기 이후 소장에서의 칼슘 흡수 부족으로 체내 혈중 칼슘 농도를 증가시키기 위해 부갑상선 호르몬 (parathyroid hormone, PTH) 분비가 촉진되어 결과적으로 뼈의 칼슘을 용해를 증가시켜 골다공증을 유발하는 원인이 될 수 있다 (Rivero and Bethea, 2016). 그러나 본 실험 결과 해면골의 면적은 골쇄보 추출물군이 OVX군보다 약 20% 증가한 것으로 관찰되어 골쇄보 추출물 급여는 골다공증 예방 효능에 긍정적인 영향이 있는 것으로 판단된다 (Fig. 1).
- 또한 본 실험 결과 골쇄보 추출물은 총콜레스테롤 농도 (152.65 ± 2.32 ㎎/㎗)를 OVX군 (162.68 ± 4.68 ㎎/㎗)보다 유의적으로 낮추었으며, HDL-콜레스테롤 역시 난소 제거 대조군에 비해 증가 한 것으로 나타났다.
- Ca 농도는 실험군들과 유의적인 차이를 보이지 않았는데 이는 혈중 칼슘 항상성을 유지하기 위함으로 보인다. 또한, 뼈형성 관련 효소인 ALP와 osteocalcin은 조골세포의 활동이 증가 되어, 빨라진 골대사 회전에 의해 높은 혈중농도를 나타내는데, 실험결과 OVX-DR보다 OVX군에서 현저히 증가하여 골쇄보 추출물 보충이 다른 군들 보다 상대적으로 적은양의 뼈교체가 일어나고 있음을 알 수 있다. 뼈교체율은 폐경이 시작된 후 조골세포에 의한 형성 작용보다 파골세포에 의한 뼈흡수작용이 상대적으로 증가하게 되어 뼈손실로 이어질 수 있다 (Bone et al.
- , 2001). 본 실험 결과, OVX군은 SHAM군에 비해 해면골의 면적의 넓고, 치밀골과 골조직내 골수세포가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있는데, 폐경 이후 체중이 증가함에 따라 뼈의 장력 강도를 주는 해면골의 밀도 감소로 인해 골다공증 및 골절의 위험이 높아진다. 한편, 실험군인 골쇄보 추출물 급여군과 OVX군의 치밀골 두께는 유사한 것으로 나타났는데, 폐경기 이후 소장에서의 칼슘 흡수 부족으로 체내 혈중 칼슘 농도를 증가시키기 위해 부갑상선 호르몬 (parathyroid hormone, PTH) 분비가 촉진되어 결과적으로 뼈의 칼슘을 용해를 증가시켜 골다공증을 유발하는 원인이 될 수 있다 (Rivero and Bethea, 2016).
- , 2010). 본 연구 결과에서도 실험기간 동안 체중증가량은 난소제거군이 유의적으로 높았으며, 골쇄보 보충군은 55.86 g으로 난소제거군 (94.72 g)보다 체중이 감소한 것으로 나타나 에스트로겐 분비의 급격한 감소를 지연시킬 수 있을 것으로 보인다.
- 그 중 지방산 합성 관련 효소인 FAS (fatty acid synthase), ME (malic enzyme), 그리고 지방산 산화 과련 효소인 CPT (carnitine palmitoyl-CoA transferase)가 있다. 본 연구에서 간 조직의 FAS와 ME 활성도는 OVX-DR군이 OVX군보다 유의적으로 낮았고 특히, ME 활성도는 현저한 저하를 보였다. 간 조직의 지방산 산화 활성도는 SHAM군과 OVX-DR군이 유사한 수치를 나타내었다.
- 간 조직의 지방산 산화 활성도는 SHAM군과 OVX-DR군이 유사한 수치를 나타내었다. 한편, 지방조직의 FAS 활성도는 OVXDR군에서 유의적으로 감소시키는 경향을 보였으며, ME 활성도는 유의적으로 차이가 없었다. 따라서 골쇄보 추출물의 급여는 지질 및 지방산 합성을 억제하고, 지방산 산화 경로를 활성화 시키는 것으로 사료된다.
- , 2006). 혈장 중성지방 농도는 골쇄보 보충군이 OVX군에 비해 약 2배정도 감소하였으며, SHAM군에 비해서도 낮은 수준을 보였다. 또한 본 실험 결과 골쇄보 추출물은 총콜레스테롤 농도 (152.
- 혈장 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율인 HTR은 OVX-DR군이 45.39 ± 1.03%, OVX군이 38.26 ± 0.85%로 보다 증가하는 경향을 보여 골쇄보 추출물의 보충이 간에서 콜레스테롤이 합성 될 때 VLDL과 HDL 생성에 직접적인 역할을 해 혈장 지질 저하뿐만 아니라 동맥경화의 위험도 어느 정도 감소시킬 수 있는 것으로 보인다.
후속연구
- 한편, 유리지방산 농도는 OVX-DR군이 OVX군에 비해 약 20% 감소하였다. 이로서 골쇄보 추출물의 급여가 중성지방 및 총 콜레스테롤 수준의 유의적인 감소와 HDL-콜레스테롤 증가시켜 동맥경화, 고지혈증을 예방 할 수 있을 것으로 평가된다.
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