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문제 정의
- 7 대식세포의 세포 생존율은 8 mg/mL까지 대조군 대비 100% 이상이었다(data not shown). 그러므로 세포의 사멸에 큰 영향을 주지 않는 농도인 0~8 mg/mL의 농도를 설정하여 방광암세포를 대상으로 하는 본 실험을 수행하였다. 방광암세포(T-24와 5637)에 K 와 CK를 0부터 8 mg/mL까지 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포 증식 억제 효과를 MTT assay를 통하여 측정하였다.
- 이에 콤부차 발효 공정에 녹차 추출물과 감귤액을 첨가하여 각 성분의 생리적 활성에 대한 콤부차로의 이행 효과를 유도하였으며, 감귤 콤부차(citrus Kombucha, CK) 발효액의 항산화 능력과 총페놀 함량을 확인하였고, 방광암세포 증식 억제 및 apoptosis에 미치는 영향을 조사함으로써 천연물 소재 유래 발효음료의 건강 기능성 소재로서의 가치를 확인하고자 본 연구를 진행하였다.
제안 방법
- 1% Cold Binding Buffer(Sigma-Aldrich Co.) 200 μL로 1×106 의 세포를 희석하여 여기에 5 μL PE Annexin V(Sigma-Aldrich Co.)를 넣고 약하게 vortex 한 후 25℃에서 15분간 방치한 다음, 1×Binding buffer 400 μL를 넣은 후 염색 정도를 flow cytometer(Moxi Flow Cytometry, ORPLO, Cambridge, MA, USA)로 측정하였다.
- 1차 항체는 4℃에서 18시간 반응 시켰고, 다음 날 2차 항체에 1시간 반응시킨 후 ECL+용액(Pierce Inc.)과 반응시켜 단백질 ECL 화상분석기(FusionFx7 Advance, Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, France) 시스템을 이용하여 측정하였다.
- T-24와 5637에 K 혹은 CK 처리 시 일어나는 성장 억제 및 세포의 형태학적 변화가 apoptosis에 의한 것인지를 확인하기 위해 방광암세포를 K 혹은 CK로 24시간 처리한 후 PE Annexin V kit을 이용하여 세포사멸의 정도를 정량적으로 확인하였다(Fig. 4). 방광암세포 T-24에 K를 처리하였을 때 apoptosis의 유발 정도가 0, 4, 6, 8 mg/mL의 농도에서 각각 4.
- 그 후 5 μg/mL MTT(thiazolyl blue tetrazolium bromide; Sigma Aldrich Co.) 시약을 10 μL씩 처리하여 1시간 반응시키고 배지를 제거한 후 DMSO를 100 μL씩 분주하여 생성된 formazan을 모두 녹인 다음 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 방광암세포 T-24, 5637에 K와 CK를 24시간 동안 처리한 후 세포의 형태학적 변화를 도립현미경으로 관찰하였다(Fig. 2). T-24 세포에 K를 8 mg/mL의 농도로 처리 시 생존 세포의 수가 감소한 것을 확인하였으나 형태학적인 변화는 보이지 않았다.
- 그러므로 세포의 사멸에 큰 영향을 주지 않는 농도인 0~8 mg/mL의 농도를 설정하여 방광암세포를 대상으로 하는 본 실험을 수행하였다. 방광암세포(T-24와 5637)에 K 와 CK를 0부터 8 mg/mL까지 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포 증식 억제 효과를 MTT assay를 통하여 측정하였다. 방광암세포 T-24에 K를 처리한 결과 1, 2, 4, 6, 8 mg/ mL의 농도에서 생존율은 각각 82.
- 방광암세포를 6-well plate에 각각 4×105씩 분주하여 배양한 후 K와 CK를 24시간 농도별로 처리하여 도립현미경(CK40-CPG30, Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)으로 확인하였으며, 세포이동성은 세포의 수가 plate 면적의 약 90% 정도로 자랐을 때 팁 끝으로 긁어 스크래치를 내어 세포를 제거한 시점을 0으로 하고, 상층의 배지를 제거하고 K와 CK를 배지에 희석한 후 방광암세포에 처리하여 24시간 후 세포이동성의 변화를 도립현미경(Olympus Optical Co.)으로 세포가 스크래치의 경계를 지나 자라는 정도를 관찰하였다.
- 본 실험은 독립적으로 3번 이상 반복실험을 시행하였다. 실험 결과는 통계분석용 프로그램 SPSS Version 18.
- 시료 1 mL와 10% Folin-Ciocalteu's(Sigma-Aldrich Co.) 용액 1 mL 및 2% sodium carbonate(Sigma-Aldrich Co.) 용액 1 mL를 각각 혼합하여 1시간 동안 방치 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포 이동(cell migration)은 동물의 성장과 생리활동에 있어서 매우 중요한 과정이며(25) 최근의 연구들에서는 세포의 집단 이동이 다종의 종양전이에 기여한다는 보고가 있다(26). 이에 T-24와 5637 방광암세포들을 K 혹은 CK에 24시간 노출시킨 후 scratch wound assay를 통해 세포들의 이동 정도를 관찰하였다. 그 결과 방광암세포 T-24의 비교군에서는 24시간 후에 세포의 이동이 현저하게 증가하였으나, K 혹은 CK 하에서는 농도가 높아짐에 따라 세포의 이동성이 점점 억제됨을 확인하였다(Fig.
- 총페놀 함량 분석은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로 함량을 계산한 후 페놀 함량은 시료 중량당 μg/mL로 나타내었다.
- 콤부차(K)와 감귤 콤부차(CK) 처리에 따른 세포증식 억제 정도를 측정하기 위해 96-well plate에 방광암세포를 분주하여 배양한 후 K와 CK의 농도를 달리하여 24시간 배양하였다. 그 후 5 μg/mL MTT(thiazolyl blue tetrazolium bromide; Sigma Aldrich Co.
- 콤부차는 녹차(동서녹차 티백, Seoul, Korea) 추출액 900 mL에 설탕 90 g을 교반한 후 전배양을 통해 얻은 배양액 100 mL와 pellicle 20 g을 넣어 전배양과 같은 조건인 30℃에서 10일간 배양하였고, 감귤 콤부차는 콤부차 배양과 동일한 과정에 전배양을 통해 얻은 배양액 100 mL에 녹차 추출액 700 mL, pellicle 20 g, 감귤농축액(60 brix, (주)일해, Jeju, Korea) 200 mL에 acetic acid 500 μL를 첨가하여 콤부차와 동일한 조건에서 배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 콤부차는 Local Domestic Kombucha이며, 민간에서 분양하여 판매하는 것을 인터넷(www.auction.co.kr)으로 구매하여 사용하였다.
- 실험에서 사용한 T-24와 5637 인체 방광암세포주는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하여 RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.) 배지에 10% FBS(Gibco Inc., San Francisco, CA, USA)와 1% Penicillin(Gibco Inc.)을 첨가한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 항산화 실험 및 페놀 함량 측정 시 콤부차(K)와 감귤 콤부차(CK)를 원심분리 한 후 상등액을 사용하였고, 세포실험에는 상등액을 주사기용 필터 유닛(pore size 0.45 μm, EMD Millipore Inc., Billerica, MA, USA)을 이용하여 여과한 후 RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- Statistically significant at * P<0.05 and **P<0.01 compared to K by Student's t-test.
- 실험 결과는 통계분석용 프로그램 SPSS Version 18.0 Package Program(IBM, New York, NY, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차를 계산하고 t-test 분석 후, P<0.05 수준에서 처리군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- The cells were treated with K or CK at concentrations as indicated for 24 h. Cellular survival rate was measured by MTT assay. The results are expressed as the mean±SD of three independent experiments.
- K와 CK의 처리에 의해 야기되는 apoptosis 관련 단백질의 발현 정도를 살펴보기 위하여 western blot을 실시하였다(Fig. 5). T-24와 5637에 K와 CK를 0부터 8 mg/mL까지 농도별로 처리한 후 단백질 시료를 제조하여 Bcl-2 관련 단백질들의 발현을 확인한 결과, T-24에서는 CK를 처리하였을 때 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현이 6 mg/mL 이상에서 현저히 감소하였고, pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현에는 차이가 없었다.
- )과 반응시켜 단백질 ECL 화상분석기(FusionFx7 Advance, Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, France) 시스템을 이용하여 측정하였다. Western band의 정량은 Fusion-Capt Advance Software 16.06(Vilber Lourmat)을 사용하여 상대 강도를 측정하였다.
성능/효과
- 1 mg/mL의 K와 CK에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성은 각각 87.9%, 91.2%였으며, ABTS 라디칼 소거 활성은 각각 78.78%와 94.59%로 CK가 유리 라디칼에 대한 소거 활성이 높은 것으로 나타났다. 이 결과는 콤부차의 발효에 의하여 free-radical scavenging activity가 일반적으로 증가하며 발효 시 첨가하는 재료에 따라 그 경향이 다르게 나타난 다는 Jayabalan 등(22)의 연구 결과와 일치하는 것으로 보인다.
- K 혹은 CK 자체의 세포 독성을 확인하기 위한 예비 실험 결과 유사 정상세포인 RAW 264.7 대식세포의 세포 생존율은 8 mg/mL까지 대조군 대비 100% 이상이었다(data not shown). 그러므로 세포의 사멸에 큰 영향을 주지 않는 농도인 0~8 mg/mL의 농도를 설정하여 방광암세포를 대상으로 하는 본 실험을 수행하였다.
- 44%의 생존율을 나타내었다. K와 CK의 T-24 세포의 증식에 대한 저해 효과는 농도에 의존적인 저해로 나타났으며, K 처리군보다 CK 처리군의 성장이 더욱 저해되는 경향을 나타내었다(Fig.1). 또한, 5637 방광암세포에 K를 처리한 결과는 1, 2, 4, 6, 8 mg/mL 농도에서 생존율이 각각 84.
- K와 CK의 총페놀 함량이 μg당 tannic acid의 등량값으로 나타낼 때 K는 17.82 μg/mL, CK는 28.62 μg/mL로 감귤액을 첨가한 CK가 K보다 높은 페놀 함량을 보였다.
- 5). T-24와 5637에 K와 CK를 0부터 8 mg/mL까지 농도별로 처리한 후 단백질 시료를 제조하여 Bcl-2 관련 단백질들의 발현을 확인한 결과, T-24에서는 CK를 처리하였을 때 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현이 6 mg/mL 이상에서 현저히 감소하였고, pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현에는 차이가 없었다. 또한, cleaved caspase-9, cleaved caspase-8, cleaved caspase-3의 경우 CK의 농도가 높아질수록 현저히 증가하였고, pro-caspase-9, pro-caspase-8, pro-caspase-3는 농도가 높아질수록 발현이 감소하였다.
- 이에 T-24와 5637 방광암세포들을 K 혹은 CK에 24시간 노출시킨 후 scratch wound assay를 통해 세포들의 이동 정도를 관찰하였다. 그 결과 방광암세포 T-24의 비교군에서는 24시간 후에 세포의 이동이 현저하게 증가하였으나, K 혹은 CK 하에서는 농도가 높아짐에 따라 세포의 이동성이 점점 억제됨을 확인하였다(Fig. 3). 이 이동성의 저해는 K보다 CK에서 특히 높게 나타났다.
- 1). 또한, 5637 방광암세포에 K를 처리한 결과는 1, 2, 4, 6, 8 mg/mL 농도에서 생존율이 각각 84.22%, 84.71%, 85.63%, 80.63%, 68.22%였고, CK를 처리한 실험군에서는 실험 농도에 대해 각각 82.5%, 74.24%, 76.03%, 65.71%, 35.87%의 생존율을 보였다(Fig. 1). 이 결과에서도 T-24에서와 마찬가지로 농도 의존적인 성장 억제 경향을 보였으며, K 처리군보다 CK 처리군에서 방광암세포의 생존율이 크게 저하됨을 확인하였다.
- T-24와 5637에 K와 CK를 0부터 8 mg/mL까지 농도별로 처리한 후 단백질 시료를 제조하여 Bcl-2 관련 단백질들의 발현을 확인한 결과, T-24에서는 CK를 처리하였을 때 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현이 6 mg/mL 이상에서 현저히 감소하였고, pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현에는 차이가 없었다. 또한, cleaved caspase-9, cleaved caspase-8, cleaved caspase-3의 경우 CK의 농도가 높아질수록 현저히 증가하였고, pro-caspase-9, pro-caspase-8, pro-caspase-3는 농도가 높아질수록 발현이 감소하였다. 특히 CK 처리 시 caspase의 활성화(cleave-dcaspase)로 인한 PARP의 분절이 현저히 증가함을 관찰하였다.
- 40%로 CK 8 mg/mL에서 apoptosis에 의한 세포사멸의 유발 정도가 가장 높게 확인되었다. 또한, 방광암세포 5637에 K를 처리하였을 때 apoptosis에 의한 세포사멸의 비율은 각각 3.87%, 5.57%, 6.73%, 7.83%로 확인되었고, CK를 처리하 였을 때는 각각 3.87%, 6.27%, 7.3%, 15.73%로 나타났다.
- 4). 방광암세포 T-24에 K를 처리하였을 때 apoptosis의 유발 정도가 0, 4, 6, 8 mg/mL의 농도에서 각각 4.47%, 4.07%, 6.4%, 11.1%로 나타났고, CK를 처리하였을 때는 각각 3.50%, 6.87%, 30.97%, 97.40%로 CK 8 mg/mL에서 apoptosis에 의한 세포사멸의 유발 정도가 가장 높게 확인되었다. 또한, 방광암세포 5637에 K를 처리하였을 때 apoptosis에 의한 세포사멸의 비율은 각각 3.
- 방광암세포(T-24와 5637)에 K 와 CK를 0부터 8 mg/mL까지 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포 증식 억제 효과를 MTT assay를 통하여 측정하였다. 방광암세포 T-24에 K를 처리한 결과 1, 2, 4, 6, 8 mg/ mL의 농도에서 생존율은 각각 82.57%, 69.01%, 50.12%, 33.47%, 26.06%로 나타났고, CK 처리군에서는 각 농도에 대해 81.96%, 72.77%, 50.36%, 19.49%, 13.44%의 생존율을 나타내었다. K와 CK의 T-24 세포의 증식에 대한 저해 효과는 농도에 의존적인 저해로 나타났으며, K 처리군보다 CK 처리군의 성장이 더욱 저해되는 경향을 나타내었다(Fig.
- 1). 이 결과에서도 T-24에서와 마찬가지로 농도 의존적인 성장 억제 경향을 보였으며, K 처리군보다 CK 처리군에서 방광암세포의 생존율이 크게 저하됨을 확인하였다. 특히 생존율에서 T-24는 5637 세포주에 비해 K 혹은 CK의 처리에 더 민감한 것으로 나타났다.
- 62 μg/mL로 감귤액을 첨가한 CK가 K보다 높은 페놀 함량을 보였다. 이상 라디칼 소거능 측정과 총페놀 함량 측정 결과에 의하면 감귤액을 첨가한 CK가 K보다 항산화 능력이 높게 확인되었으며 총페놀 함량도 CK가 K보다 높음을 확인하였다.
- 또한, cleaved caspase-9, cleaved caspase-8, cleaved caspase-3의 경우 CK의 농도가 높아질수록 현저히 증가하였고, pro-caspase-9, pro-caspase-8, pro-caspase-3는 농도가 높아질수록 발현이 감소하였다. 특히 CK 처리 시 caspase의 활성화(cleave-dcaspase)로 인한 PARP의 분절이 현저히 증가함을 관찰하였다. 반면 T-24 세포주에 K를 처리하였을 때는 농도별 발현의 차이를 보이지 않았으며, 5637 세포에서는 K와 CK간의 변화가 없었으며, 농도별로도 별다른 발현의 차이를 보이지 않았다.
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