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문제 정의
- 본 연구는 감귤 콤부차의 산업화를 위한 발효 균주 표준화를 위하여 콤부차에서 분리된 3가지 균주(Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter medellinensis, Gluconobacter oxydans)를 이용한 감귤 발효액(CK-MOX)의 기능적 특성을 탐색하고자 하였다. CK-MOX 제조 후 15일간 3일 마다 샘플링을 하였으며, 발효 기간에 따른 pH, 산도, 항산화 능력을 평가하였다.
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외부 자극으로 활성화된 rat sarcoma kinase(Ras)는 rapidly accelerated fibrosarcoma(Raf)를, Raf는 MAPK/ERK kinase(MEK)를, MEK은 extracellular signaling kinase(ERK)를 차례로 인산화한다(23). 본 연구에서는 MAPK의 일종인 ERK 활성을 확인하기 위하여 western blot을 실시하였다. 방광암 세포주 EJ에 CK-MOX 발효 전, 발효 후 시료를 처리한 뒤 24, 48시간 각각 p-ERK의 발현 정도를 측정한 결과 15일간 발효한 CK-MOX의 처리는 EJ 세포의 p-ERK level을 많이 증가시
- 그러나 콤부차의 품질 관리 및 산업적인 생산을 위해서는 규정된 발효 미생물의 사용 및 그 안전성이 확보되어야 한다. 우리는 리보솜 RNA 염기서열 분석을 통하여 콤부차의 미생물 분포를 조사하였으며(unpublished data), 본 연구에서는 발효 표준화를 위하여 전통 콤부차로부터 확인된 3가지 균주 Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter medellinensis, Gluconobacter oxydans를 이용하여 감귤 콤부차를 발효하였고, 감귤 발효액(CK-MOX)의 항산화 능력평가 및 방광암 세포주(EJ 세포)에 대한 항암성 확인 연구를 통하여 감귤 발효액의 기능성 음료로서의 개발 가능성을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 1× cold binding buffer를 이용하여 1×106 cells/mL의 농도로 희석한 후 5 μL PE Annexin V를 더하고, 25°C에서 15분 방치한 후 1× binding buffer 400 μL를 추가하여 75 μL를 cassette(ORFLO Co., Ketchum, ID, USA)에 넣고 FACS(ORFLO Co.)로 측정하였다.
- 96-black well plate에 50배로 희석된 시료 25 μL와 40 nM fluorescein(대정화금, Gyeonggi, Korea) 120 μL를 혼합하고 측정 직전 150 mM 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)(AAPH, Sigma Aldrich Co.) 55 μL를 첨가하였다.
- 본 연구는 감귤 콤부차의 산업화를 위한 발효 균주 표준화를 위하여 콤부차에서 분리된 3가지 균주(Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter medellinensis, Gluconobacter oxydans)를 이용한 감귤 발효액(CK-MOX)의 기능적 특성을 탐색하고자 하였다. CK-MOX 제조 후 15일간 3일 마다 샘플링을 하였으며, 발효 기간에 따른 pH, 산도, 항산화 능력을 평가하였다. 발효에 따라 pH는 감소하였고, 산도는 증가하였다.
- CK-MOX의 처리군에서 많이 증가한 ERK의 활성화가 EJ 세포 사멸의 원인인지 결과인지 확인하기 위하여 MEK1/2 inhibitor인 U0126을 CK-MOX와 함께 처리하여 관찰하였다. U0126의 처리는 예비 실험 결과(data not shown) EJ 세포의 ERK 활성을 현저하게 감소시켰던 10 μM의 농도로 사용하였다.
- EJ 세포에 대한 성장 억제능의 확인을 위해 96-well plate 방광암 세포를 3,000 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. MEK inhibitor에 의한 세포 사멸의 억제 확인을 위한 실험에서는 1× RPMI에 녹인 U0126을 10 μM 농도로 처리한 후 각 조건에 따라 CK-MOX를 처리하여 24~48시간 배양하였다.
- MEK inhibitor에 의한 세포 사멸의 억제 확인을 위한 실험에서는 1× RPMI에 녹인 U0126을 10 μM 농도로 처리한 후 각 조건에 따라 CK-MOX를 처리하여 24~48시간 배양하였다.
- pH 측정은 pH meter(FEP20, Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 산도는 중화 적정법(13)을 이용하여 측정하였다.
- 감귤 콤부차는 녹차(Dongsuh Co. Inc., Seoul, Korea) 추출액 750 mL에 설탕 75 g과 감귤액(Jeju Province Development Co., Jeju, Korea) 30 g을 교반한 후 3가지 균주를 접종하여 30°C 배양기에서 15일간 발효하였다.
- 그 뒤 thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich Co.) 시약을 0.5 mg/mL의 농도로 100 μL씩 처리하여 2시간 반응시키고 상층액을 제거한 뒤 DMSO(Bio Basic, Ontario, Canada)로 각 well에 생성된 MTT formazan을 1시간 동안 용해하여 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 단백질 정량은 BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하였으며, 30 μg의 단백질을 포함한 시료를 SDS page gel로 세분하고 Nitrocellulose blotting membrane(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에 transfer 하였고, 5% skim-milk로 blocking 하였다.
- cells/well의 농도로 6-well plate에 분주한 다음 24시간 후 10 mg/mL의 농도로 시료를 처리하고, 48시간 후 배지를 포함한 세포 모두를 tube에 옮겨 200×g에서 2분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 다음 세포 pellet을 차가운 phosphate-buffered saline을 이용하여 1회 세척한 후, PE Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 1× cold binding buffer를 이용하여 1×106 cells/mL의 농도로 희석한 후 5 μL PE Annexin V를 더하고, 25°C에서 15분 방치한 후 1× binding buffer 400 μL를 추가하여 75 μL를 cassette(ORFLO Co.
- 세포를 6-well plate에 1×105 cells/well 농도로 분주, 24시간 배양 후 200 μL 피펫 끝으로 긁어 스크래치를 낸 뒤 상층의 배지를 제거하고, 시료를 처리하여 도립현미경으로 2일간 세포의 이동성을 관찰하였다.
- 산도는 중화 적정법(13)을 이용하여 측정하였다. 시료 1 mL를 10배 희석한 후 1% phenolphthalein 지시약을 2~3방울을 가하고, 0.1 N NaOH로 pH 8.3에 도달할 때까지 중화 적정하여 소비된 0.1 N NaOH의 양(mL)을 측정한 후 다음 식에 따라 초산으로 산도를 계산하였다.
- 실험에는 발효액을 18,000×g로 10분간 원심분리 후 상등액을 필터(0.45 μm, EMD Millipore Inc., Billerica, MA, USA)로 여과한 후 동결건조기(FDB-5502, Operon Co., Gyeonggi, Korea)를 이용하여 24시간 건조한 후 실험에 사용하였다.
- 특정 단백질의 발현 확인을 위해 western immunoblot을 실시하였으며, 방광암세포 EJ 세포에 시료 처리 후 RIPAlysis buffer(Biosesang, Gyeonggi, Korea)와 protease inhibitor 혼합액을 이용하여 균질화한 다음 최대 속도에서 10분간 원심분리(Micro 17R, Hanil, Gyeonggi, Korea) 하여 상층액을 분리하였다. 단백질 정량은 BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하였으며, 30 μg의 단백질을 포함한 시료를 SDS page gel로 세분하고 Nitrocellulose blotting membrane(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에 transfer 하였고, 5% skim-milk로 blocking 하였다.
대상 데이터
- RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.) 배지에 10% fetal bovine serum(Sigma-Aldrich Co.)과 1% penicillin-streptomycin(Capricorn, Ebsdorfergrund, Germany)을 추가하여 사용하였으며, 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 3가지 균주는 G. xylinus, G. medellinensis, G. oxydans로 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 균주는 single colony를 mannitol 배지(yeast extract 5 g, peptone 3 g, mannitol 25 g in 1 L) 30 mL에 48시간 배양한 후 원심분리기(Aventi J-E, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용하여 배양액을 제거(18,000×g, 10 min)하였다.
- 실험에 사용된 인간 방광암 EJ 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.
데이터처리
- Different letters (a,b) above the bars indicate significant differences among samples determined by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
- Different letters (a-c) above the bars indicate significant differences determined by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
- Different letters (a-d) above the bars indicate significant differences determined by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
- Different letters (a-d) indicate significant differences among samples determined by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
- Different letters (a-f) indicate significant differences among samples determined by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
- 본 연구의 실험은 3번 이상 반복하여 통계 프로그램 SPSS Version 18.0(IBM, New York, NY, USA)을 이용하여 평균과 표준편차를 계산하고 scratch wound healing assay 결과는 t-test, 그 외의 모든 실험 결과는 one-way ANOVA 분석 후 P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test로 각 실험군의 유의적 차이를 검증하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거능 측정은 Choi 등(14)의 방법을 응용하여 측정하였다. 10배 희석한 시료 200 μL와 에탄올에 녹여 제조한 0.
- pH 측정은 pH meter(FEP20, Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 산도는 중화 적정법(13)을 이용하여 측정하였다. 시료 1 mL를 10배 희석한 후 1% phenolphthalein 지시약을 2~3방울을 가하고, 0.
성능/효과
- 5에 나타내었다. 48시간 처리 시 대조군과 비교하여 발효 전 시료 처리군의 세포 생존율은 80.6%였고, 15일간 발효한 CK-MOX 처리군은 6.5%로 앞선 실험 결과와 같은 경향으로 CK-MOX 발효 후 시료의 처리는 EJ 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. U0126과 발효 전 CK-MOX 시료를 동시 처리한 결과 세포 생존율은 유의적인 차이를 보이지 않았고, U0126과 발효 후 CK-MOX를 동시 처리하였을 때 세포 생존율은 37.
- CK-MOX는 발효 전과 비교하여 발효 후 DPPH 라디칼 소거능은 125 μg ascorbic acid/mL에서 280 μg ascorbic acid/mL로 유의적으로 증가하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 발효 3일째 599 μg ascorbic acid/mL로 발효 전과 비교하여 약 6.5배 증가하여 이후의 발효기간 동안 꾸준하게 증가하는 것으로 나타났다.
- ORAC assay는 비색 측정을 하는 다른 항산화 측정법과 달리 형광 값을 분석하여 나타내기 때문에 색을 갖는 시료의 항산화력을 더욱 더 객관적으로 측정 할 수 있다는 장점을 갖고 있다(19). CK-MOX의 ORAC 측정 결과 발효 전 5.93 mM Trolox와 비교하여 발효 후 7.51 mM Trolox로 유의적으로 증가하였으나 12일간 발효한 CK-MOX의 ORAC 측정값이 8.35 mM Trolox로 가장 높은 것으로 나타났다.
- CK-MOX의 항산화 능력은 총 3가지 방법으로 측정하였으며 Table 2에 나타낸 바와 같이 K-MOX의 발효 전과 비교하여 발효 후 항산화 능력이 많이 증가하는 것으로 나타났다. CK-MOX는 발효 전과 비교하여 발효 후 DPPH 라디칼 소거능은 125 μg ascorbic acid/mL에서 280 μg ascorbic acid/mL로 유의적으로 증가하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 발효 3일째 599 μg ascorbic acid/mL로 발효 전과 비교하여 약 6.
- 발효에 따라 pH는 감소하였고, 산도는 증가하였다. DPPH, ABTS 라디칼 소거능, ORAC assay를 통한 항산화 능력 측정 결과 발효에 따라 항산화 능력이 향상하는 것으로 나타났으며, 방광암 세포주(EJ 세포)의 생존 억제 및 이동 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 특히 CKMOX로 유도된 EJ 세포의 사멸에 MAPK pathway의 중추적인 역할을 하는 것으로 알려진 ERK의 발현이 깊이 관여하는 것으로 나타났다.
- 5%로 앞선 실험 결과와 같은 경향으로 CK-MOX 발효 후 시료의 처리는 EJ 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. U0126과 발효 전 CK-MOX 시료를 동시 처리한 결과 세포 생존율은 유의적인 차이를 보이지 않았고, U0126과 발효 후 CK-MOX를 동시 처리하였을 때 세포 생존율은 37.8%로 CK-MOX에 의한 세포 사멸이 회복되는 것으로 나타났다. Western blot을 통한 단백질 발현 측정 결과(Fig.
- 6)에서 U0126의 처리가 p-ERK level을 감소시키며, 15일간 발효한 CK-MOX와 U0126을 동시 처리하였을 때 미량 감소하는 것으로 나타났다. 결과적으로 콤부차 대표 균주 3종을 이용한 감귤 발효액(CK-MOX)으로 유도된 EJ 방광암 세포 사멸에 p-ERK가 깊이 관여함을 확인할 수 있다.
- 3에 나타내었다. 대조군, 발효 전 CK-MOX 처리군, 발효 후 CK-MOX 처리군에서 각각 5.6, 4.9, 7.4%의 ap-optosis에 의한 세포 사멸률을 보였으나, 대조군과 발효 전 CK-MOX 처리군은 통계적으로 유의차가 없었고, 발효 후(Day15) 시료 처리군은 발효 전(Day0) 시료 처리군과 비교하여 apoptosis로 인한 세포의 사멸률이 유의적으로 높게 나타났다.
- 1에 무처리군에 대한 백분율로 나타내었다. 대조군과 비교하여 CK-MOX 처리군에서 유의적으로 세포 생존을 억제하는 것으로 나타났으며, 특히 발효 전 시료 처리군 77%, 발효 후 시료 처리군 57%로 발효 후 CK-MOX 처리군에서 유의적으로 방광암 세포주 EJ의 생존을 억제하는 것으로 나타났다.
- CK-MOX의 발효 기간에 따른 pH 및 산도 변화는 Table 1에 나타내었다. 발효의 진행에 따라 CK-MOX의 pH는 발효 전 3.79에서 발효 후 2.99로 유의적으로 감소하였고, 산도는 발효 전과 비교하여 1.34% 증가하였다. 콤부차는 발효 과정을 통해 acetic, gluconic, glucuronic, citric, L-lactic, malic, tartaric, malonic, oxalic, succinic, pyruvic acid 등의 유기산이 생성된다고 알려져 있으며(17), 본 연구에 사용된 3종의 균 모두 acetic acid bacteria로 pH의 저하는 유기산 농도 증가에 따른 결과물로 보인다.
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본 연구에서는 MAPK의 일종인 ERK 활성을 확인하기 위하여 western blot을 실시하였다. 방광암 세포주 EJ에 CK-MOX 발효 전, 발효 후 시료를 처리한 뒤 24, 48시간 각각 p-ERK의 발현 정도를 측정한 결과 15일간 발효한 CK-MOX의 처리는 EJ 세포의 p-ERK level을 많이 증가시
키는 것으로 나타났다(Fig. 4). - Srihari 등(21)의 연구에 따르면 전통적인 방법으로 배양된 콤부차는 인간 전립선암 세포주 PC-3의 세포이동(migration)을 억제하는 것으로 보고되었다. 본 연구에서 이동성 억제 효과는 초기 세포 간의 거리에 대해 처리 시간 후의 세포 간의 거리의 비율을 %로 표시하였으며, 24시간 처리 시 세포 이동성 억제 효과는 크지 않았으나, 48시간 처리 시는 대조군(51.7%)과 비교하여 CK-MOX의 처리군(69.4%)에서 EJ 세포의 이동성을 약 17% 억제하는 것으로 나타나 세포 이동성 억제가 효과적인 것으로 관찰되었다(Fig. 2).
- DPPH, ABTS 라디칼 소거능, ORAC assay를 통한 항산화 능력 측정 결과 발효에 따라 항산화 능력이 향상하는 것으로 나타났으며, 방광암 세포주(EJ 세포)의 생존 억제 및 이동 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 특히 CKMOX로 유도된 EJ 세포의 사멸에 MAPK pathway의 중추적인 역할을 하는 것으로 알려진 ERK의 발현이 깊이 관여하는 것으로 나타났다.
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