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문제 정의
- 본 연구에서는 그간에 수집해온 저항성 유전자원의 세균성점무늬병 저항성 정도와 육종 소재로서의 원예적 가치를 검토하기 위해 X. euvesicatoria균에 대한 저항성을 검정하고, 오이모자이크바이러스(CMV)와 잠두시들음바이러스(BBWV)가 복합적으로 발생하는 포장에서의 바이러스병 발병도와 과실의 함유성분 등의 주요 원예적 특성을 조사 분석하였다.
제안 방법
- 2014년 9월 중순에 No.1 상토(㈜참그로)를 채운 200구 트레이에 각 자원 25립씩 파종하고, 약 30일이 지난 후 다시 No.1 상토(㈜참그로)를 채운 50구 트레이에 각 계통 10주씩 이식하되 발아묘의 수가 적은 것은 있는 그대로 이식하였다.
- 제1분기점이 발생하는 시점인 5월 말경에 각 계통에서 6주씩 선발하여 경북대학교 군위 실습포장에 정식하였다. 8월 말경에 숙과를 수확하여 원예적 특성을 조사하고, 실험식물의 바이러스병 발병도를 조사하였다. 발병기준은 0=바이러스 병징이 보이지 않는 것; 1=0과 2 사이의 약간의 병징이 보이는 것; 2=중간 정도 되는 것; 3=2과 4 사이의 많은 병징이 보이는 것; 4=바이러스 병징이 심한 것과 같이 5단계로 조사하였다.
- , 2004). ASTA color value는 미국 및 국제사회에서 고춧가루의 색을 평가하는 객관적 단위로 사용되고 있으며 현재 국내 고추 색소함량의 지표가 되고 있으므로 적색소의 평가는 ASTA 값을 구하여 확인하였다(Table 3). 공시한 30계통의 ASTA 값은 평균 109.
- 과민반응형(HR) 저항성을 판별하기 위한 병원균의 접종은 파종 후 46일이 지난 때, 유묘의 3–4번째 잎의 뒷면에 바늘이 없는 5ml 주사기를 이용하여 균을 침투시키는 방법을 이용하였다(Fig. 1A).
- 이어서 선발한 저항성 소재들의 활용도를 높이기 위하여 주요 특성을 조사하였다(Table 2 and 3). 과실의 형태적 품질 특성은 chile형인 신미종과 bell형의 감미종으로 구분하여 비교하였다(Table 2). Chile형 23계통의 과장은 5.
- 그 방법은 수집한 시료 잎의 감염부를 전자현미경으로 검경하고, 전체 RNA를 분리한 후 주로 노지 고추에서 발생되는 6종의 바이러스, 즉 Broad bean wilt virus(BBWV), Cucumber mosaic virus(CMV), Pepper mottle virus(PepMoV), Pepper mild mottle virus(PMMoV), Tobacco mild green mosaic virus(TMGMV), Tomato spotted wilt virus(TSWV)에 대한 종 특이적 프라이머를 이용하여 RT–PCR을 통해 특정 부분을 증폭한 후 전기영동을 하였다.
- 당 함량은 근적외 분광분석법(NIRSystem 1,600– waters)으로 분석하였으며, ASTA 값은 250mm 삼각플라스크에 고춧가루 0.1g을 넣고 acetone 100mL로 채운후 16시간 암실에 방치한 다음 원심분리해서 UV/VIS Spectrophotometer(V–530, Jasco)을 이용하여 460nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 발병기준은 0=바이러스 병징이 보이지 않는 것; 1=0과 2 사이의 약간의 병징이 보이는 것; 2=중간 정도 되는 것; 3=2과 4 사이의 많은 병징이 보이는 것; 4=바이러스 병징이 심한 것과 같이 5단계로 조사하였다. 동시에 바이러스에 감염된 잎을 채집하여 PCR에 의한 바이러스 동정을 하였다. 그 방법은 수집한 시료 잎의 감염부를 전자현미경으로 검경하고, 전체 RNA를 분리한 후 주로 노지 고추에서 발생되는 6종의 바이러스, 즉 Broad bean wilt virus(BBWV), Cucumber mosaic virus(CMV), Pepper mottle virus(PepMoV), Pepper mild mottle virus(PMMoV), Tobacco mild green mosaic virus(TMGMV), Tomato spotted wilt virus(TSWV)에 대한 종 특이적 프라이머를 이용하여 RT–PCR을 통해 특정 부분을 증폭한 후 전기영동을 하였다.
- 먼저 부직포를 바닥에 깔고 활대를 설치한 터널에 고추 묘를 넣고 접종 전 터널 바닥에 물을 충분히 채워 습실을 만든 후 침투법에서와 같이 준비한 세균현탁액을 압축식 분무기를 사용하여 잎의 앞 뒷면이 골고루 젖도록 분무한 후 터널의 비닐과 보온덮개를 덮어 48시간 습실 처리를 해주고 7일–10일 이후에 개체별 발병도를 조사하였다.
- 8월 말경에 숙과를 수확하여 원예적 특성을 조사하고, 실험식물의 바이러스병 발병도를 조사하였다. 발병기준은 0=바이러스 병징이 보이지 않는 것; 1=0과 2 사이의 약간의 병징이 보이는 것; 2=중간 정도 되는 것; 3=2과 4 사이의 많은 병징이 보이는 것; 4=바이러스 병징이 심한 것과 같이 5단계로 조사하였다. 동시에 바이러스에 감염된 잎을 채집하여 PCR에 의한 바이러스 동정을 하였다.
- 먼저 부직포를 바닥에 깔고 활대를 설치한 터널에 고추 묘를 넣고 접종 전 터널 바닥에 물을 충분히 채워 습실을 만든 후 침투법에서와 같이 준비한 세균현탁액을 압축식 분무기를 사용하여 잎의 앞 뒷면이 골고루 젖도록 분무한 후 터널의 비닐과 보온덮개를 덮어 48시간 습실 처리를 해주고 7일–10일 이후에 개체별 발병도를 조사하였다. 발병기준은 0=병징이 보이지 않는것; 1=연필자국 모양의 병반이 형성되나 매우 제한된 것; 2=수침 혹은 유침상의 병반이 형성되나 병반면적이 25% 이내; 3=수침상의 병반이 다수 형성되었으며 병반면적 50% 내외; 4=수침상의 병반이 서로 엉기거나 낙엽한 것으로 5단계로 조사하였다. 통계분석은 SAS 프로그램(SAS 9.
- 발병조사는 접종 후 24시간부터 72시간 사이에 침투부위 조직의 괴사 유무에 따라 HR(hypersensitive reaction)과 NHR(non–hyperseneitive reaction)로 감별하였다(Fig. 1B and C).
- 원예적 특성은 각 계통에서 숙과의 과장, 과폭, 과경장, 과중, 심실수를 조사하고 과피를 모아 55℃ 로 조정한 열풍건조기에서 충분히 건조하여 capsaicinoids 함량, 당 함량, ASTA(American Spice Trade Association) 값을 분석하였다.
- 이어서 선발한 저항성 소재들의 활용도를 높이기 위하여 주요 특성을 조사하였다(Table 2 and 3). 과실의 형태적 품질 특성은 chile형인 신미종과 bell형의 감미종으로 구분하여 비교하였다(Table 2).
- 이와 같이 계통별로 고춧가루의 색소함량에 큰 차이를 나타내어 비교 기준이 필요하였으나 현재까지 국내에서 색소함량에 대한규격과 색상 품질에 대한 기준이 없어, 대비품종 ‘빅스타’와 ‘다복’이 각각 148.0과 142.2인 것을 기준으로 비교하였고, 영양고추시험장에서 건고추의 ASTA 값을 90미만, 91–110, 111–130, 131–150, 151이상과 같이 5등급으로 구분하여 151이상을 특상으로 제시한 표준규격을 참고하였다(YPES, 2005).
- 일반 저항성을 검정하기 위한 접종은 병원균 Xcv015를 사용하여 육묘의 5–6번째 새 잎이 나오는 시점에 시행하였다.
- 저항성 검정 결과를 토대로 선발한 계통 및 대비품종인 ‘빅스타’, ‘다복’을 포함한 총 30점을 2014년도와 같은 방법으로 2월 초에 파종하여 약 1개월 후 10주씩 50구 트레이에 이식하였다.
- 저항성 검정 결과를 토대로 선발한 계통 및 대비품종인 ‘빅스타’, ‘다복’을 포함한 총 30점을 2014년도와 같은 방법으로 2월 초에 파종하여 약 1개월 후 10주씩 50구 트레이에 이식하였다. 제1분기점이 발생하는 시점인 5월 말경에 각 계통에서 6주씩 선발하여 경북대학교 군위 실습포장에 정식하였다. 8월 말경에 숙과를 수확하여 원예적 특성을 조사하고, 실험식물의 바이러스병 발병도를 조사하였다.
- 조사 후 각 계통별로 저항성이 강한 개체를 3주씩 선발하여 직경 13cm의 플라스틱분에 이식하여 주기적으로 시비를 하며 재배하여 숙과를 수확, 채종하였다.
- 현재까지 본 연구실에서 수집한 자원 중에서 선발한 세균성점무늬병 저항성 유전자원, race 판별을 위한 Early California Wonder(ECW) NILs, PI235047과 국내 시판품종인 ‘배로따’, ‘청양’, ‘슈퍼금탑’, ‘역강홍장군’을 포함한 총 33점을 사용하여 세균성점무늬병 저항성을 검정하였다.
대상 데이터
- 고추 세균성점무늬병원균(X. euvesicatoria)은 2011년부터 전국 각지에서 수집하여 본 연구실에 보관중인 race가 판별된 병원균 중 각각 race 1, 3, 7, 8에 해당하는 Xcv072, Xcv015, Xcv046, Xcv076를 사용하였다. 각 병원균의 race는 미국 플로리다의 병원형 분류체계(Sahin and Miller, 1998; Stall et al.
- 이 중 KC01617, KC01760, KC01779, KC01137, KC01704, KC01777는 아직까지 저항성으로 보고된 바가 없는 자원들로서 세균성점무늬병 저항성 자원으로 새로 추가되었다. 이들 중에서 KC01617, KC01760, KC01779, KC01704, KC01777은 2011년도에 국립농업유전자원센터에서 분양받아 증식한 자원들 중에서 선발된 것들이며, KC01137은 본 연구실 자체 수집 자원 중에서 함께 선발된 계통이다. ECW NILs와 같이 HR 저항성 유전자만 도입된 계통들은 병원균을 살포접종할 경우 미세한 과민형 점무늬가 다수 형성되는 특징이 있으나 KC00939은 공시한 저항성 소재중 유일하게 침투접종시 과민형 반응을 나타낼 뿐만아니라 살포접종 후에 미세 과민형 점무늬도 형성되지 않아 Bs2의 강력한 수직 저항성에 양적 저항성을 겸비한 매우 이상적인 세균성점무늬병 저항성 소재로 평가되었다.
데이터처리
- 발병기준은 0=병징이 보이지 않는것; 1=연필자국 모양의 병반이 형성되나 매우 제한된 것; 2=수침 혹은 유침상의 병반이 형성되나 병반면적이 25% 이내; 3=수침상의 병반이 다수 형성되었으며 병반면적 50% 내외; 4=수침상의 병반이 서로 엉기거나 낙엽한 것으로 5단계로 조사하였다. 통계분석은 SAS 프로그램(SAS 9.3, SAS Institute Inc., USA)을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- Capsaicinoids 함량은 Attuquayefio and Buckle(1987)의 방법에 준하여 고춧가루 1g에 acetonitrile 10mL를 가하여 5분간 혼합한 후 상층액 1mL를 취하여 10배 희석 후 Sep–pak Plus C18 Cartridges(Waters–short body), acetonitrile 등을 이용하여 capsaicinoids가 탈착되어 흘러나온 여액을 HPLC(LC–900, Jasco)로 분석하였다.
- euvesicatoria)은 2011년부터 전국 각지에서 수집하여 본 연구실에 보관중인 race가 판별된 병원균 중 각각 race 1, 3, 7, 8에 해당하는 Xcv072, Xcv015, Xcv046, Xcv076를 사용하였다. 각 병원균의 race는 미국 플로리다의 병원형 분류체계(Sahin and Miller, 1998; Stall et al., 2009)에 따라 판별하였다.
성능/효과
- ‘빅스타’가 세균성점무늬병 저항성이 없는 대신 바이러스 저항성은 높은 것에 반해 ‘칠성초’는 바이러스 저항성이 현저히 낮아 재래종들이 병해충에 취약함을 확인할 수 있었다.
- 3으로 일반적인 중도 저항성을 보였지만(Table 1), 포장의 CMV와 BBWV에 의한 바이러스 병징이 전혀 발견되지 않아 상당히 강한 바이러스 저항성을 보유하고 있는 것으로 확인되었다. Bell형의 7계통에서 KC00144(Keystone Resistant Giant)와 감미종에 세균성점무늬병 저항성 유전자를 도입하여 육성한 ECW계통들의 평균 과장, 과폭, 과중은 각각 6.9cm, 5.9cm, 74.0g이었으며, 서로 큰 차이 없이 비슷한 품질을 보여주었고, 모두 포장의 바이러스에 매우 약하였다. Bs4 유전자를 보유한 PI235047은 Capsicum pubescens로서 과장, 과폭, 과중이 각각 2.
- 그리고 포장에서 KC00939와 유사한 바이러스 저항성도 보여주었다. KC00897은 세균성점무늬병 저항성은 평균 2.3으로 일반적인 중도 저항성을 보였지만(Table 1), 포장의 CMV와 BBWV에 의한 바이러스 병징이 전혀 발견되지 않아 상당히 강한 바이러스 저항성을 보유하고 있는 것으로 확인되었다. Bell형의 7계통에서 KC00144(Keystone Resistant Giant)와 감미종에 세균성점무늬병 저항성 유전자를 도입하여 육성한 ECW계통들의 평균 과장, 과폭, 과중은 각각 6.
- KC01006은 앞의 두 계통보다는 세균성점무늬병 저항성이 낮지만 육종소재로서는 충분히 강하며, 과장, 과폭, 과중이 각각 12.0cm, 1.7cm, 11.8g으로 ‘칠성초’ 다음으로 과형이 가장 좋았으며, 이는 저항성 소재중 과실 품질이 가장 우수한 것이다.
- KC01327은 병징이 거의 나타나지 않아 일반저항성 부분에서 가장 강한 저항성을 보였다. KC01617(IT136637)은 침투접종에 의해 HR은 아니지만, 수침상 반응 또한 전혀 나타나지 않음으로써 고도의 일반 저항성을 보였으며, 이 외 KC00939, KC01015, KC01760(K004031), KC01779(K159826), KC01137도 같은 수준의 일반 저항성을 보였다. 또한 KC01328, KC01006, KC00127, KC01704(801319), KC00995,KC00131, KC01777(K150028)도 높은 일반 저항성 소재로서 가치가 있다고 판단되었다.
- 고도의 세균성점무늬병 저항성 소재 중 KC01137과 KC01779는 각각 177.2mg∙100g-1과 164.1mg∙100g-1으로서 KS의 5단계에 해당하며, ‘청양’보다 상당히 매울 것으로 예상되고, 그 외 KC01328(131.1mg∙100g-1), KC01760(117.3mg∙100g-1), KC01617(105.1mg∙ 100g-1)순으로 capsaicinoids 함량이 많았으며, 모두 KS의 5단계로 매우 매운 고추에 해당한다.
- 과민반응형 세균성점무늬병 저항성 유전자 Bs2와 Bs3를 각각 도입한 대표적 품종인 ‘Chilbok No.2’와 ‘Chilbok No.3’도 각각 10.0%와 10.8%의 높은 당 함량을 기록하였으며, 이는 ‘칠성초’가 당 함량이 7.6%로 평균값 8.8%에도 못미치는 낮은 함량을 보유한 것에 비해 매우 바람직한 방향으로 육성된 것을 알 수 있고, 이는 저항성 계통들 간의 육종 과정에서 함유성분 또한 충분히 보강 가능하다는 것을 시사한다.
- 먼저 과민반응형 저항성을 보면, KC00939, ECW20R, ECW12346, 그리고 본 연구실에서 영양지역 재래종 ‘칠성초’(Chilseong)에 Bs2 유전자를 도입하여 육성한 Chilbok No.2가 전 개체 모두 균일하게 4종의 race(1, 3, 7, 8)에 HR을 보임으로서 안정적으로 Bs2 유전자가 고정되었음을 알수 있었다.
- 반면에 고도의 세균성점무늬병 저항성을 가진 개체들은 주로 소과가 많았으나, KC00939는 과폭과 과경장은 평균치에 머물렀지만 과장과 과중이 각각 11.9cm와 9.2g으로 대비품종 ‘다복’보다 우수한 품질을 갖추었고, 심지어 포장에서 발생한 CMV와 BBWV에 대해서 병징이 미미하여 바이러스에 강한 저항성을 보여주었다.
- 본 연구에서 capsaicinoids 함량은 2.2mg∙100g-1부터 388.6mg∙100g-1까지 그 범위가 매우 광범위하였으며, 과형과 색택이 우수했던 ‘빅스타’는 25.7mg∙100g-1으로 KS에 의하면 2단계, 영양고추시험장에 의하면 순한맛으로 평가되고, ‘다복’은 48.6mg∙100g-1으로 ‘빅스타’보다 한단계 더 높은 3단계, 중간맛으로 평가됬다.
- 7mg∙100g-1으로 고신미 육종 소재로서의 가능성도 확인하였다. 세균성점무늬병 저항성 검정 결과 2.2의 중도 저항성을 보여준 KC00043은 388.6mg∙100g-1로서 capsaicinoids 함량이 다른 계통들에 비해 월등히 높았으며(Table 1 and 3), 이는 고추의 capsaicinoids에 대한 다양한 약리 및 생리학적 효과가 밝혀지고 있음에 따라(Luo et al., 2011) 고기능성 육종소재로서 관심을 끌었다. 고추의 주요 당은 fructose 및 glucose이고 sucrose는 소량 존재하며(Son et al, 1995), 당 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같이 fructose 및 glucose가 주요 당으로 검출되었고 sucrose는 미량 검출되거나 검출되지 않았다.
- 실제로 시판품종 중 ㈜농우바이오에서 프리미엄 품종으로 선보인 ‘빅스타’가 과장, 과폭, 과중이 각각 16.4cm, 2.4cm, 28.2g으로 모두 가장 높은 값을 보여 다른 계통 대비 과형이 가장 우수하였다.
- 고추의 주요 당은 fructose 및 glucose이고 sucrose는 소량 존재하며(Son et al, 1995), 당 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같이 fructose 및 glucose가 주요 당으로 검출되었고 sucrose는 미량 검출되거나 검출되지 않았다. 총당 함량은 3.7%부터 22.3%까지 다양한 분포를 나타냈고, 주로 감미종 계통에서 높은 당 함량을 보였다. 평균값은 8.
- 평균값은 8.8%로 저항성 계통들이 높지 않은 당 함량 수치를 보였지만, 맛이 좋다고 평가되는 ‘빅스타’와 ‘다복’의 당 함량이 각각 10.5%와 10.6%인것과 비교하여 고도의 세균성점무늬병 저항성 소재 중 KC01327과 KC01328이 각각 12.0%와 10.2%의 높은 당 함량을 보유하였다.
- 한편 대비로 공시한 시판교배종들은 모두 높은 발병도를 보여 세균성점무늬병 저항성이 아직 시판 품종에 도입되어 있지 않은 상태임을 알 수 있었다(Table 1). 농가 포장에서는 우선 고추에서 가장 문제가 되는 역병, 탄저병, 바이러스에 대한 저항성이 중요하겠으나, 태풍 등의 영향으로 대발생하는 경우를 대비하여 세균성점무늬병에 대한 저항성 품종의 개발이 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
- 따라서 다양한 육종소재를 확보하여 원예적 특성까지 분석한 이번 연구자료는 고추에서 앞으로의 세균성점무늬병저항성 육종에 도움이 될 것으로 기대되며, 선발된 세균성점무늬병 저항성 유전자원들 중 노지의 바이러스에 복합저항성을 지닌 KC00939, KC01015, KC01006은 고온다습한 기후로 인한 병해가 많은 인도, 중국, 동남아시아와 같은 국외에도 활용 가능성이 높아 한국 고추 품종의 종자 수출 시장 확대에 기여할 것으로 기대된다. 국내에서는 저항성 품종이 육성 보급될 경우 생산성의 안정과 세균성점무늬병 방제 노력을 줄여 농가생산비 절감에 큰 도움을 줄 수 있을 것이며, 세균성점무늬병과 바이러스에 고도의 복합저항성을 갖추면서 탁월한 색도를 나타낸 KC00939는 국내 김치용 고춧가루의 품질을 높여줄 재료로 육종에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 농가 포장에서는 우선 고추에서 가장 문제가 되는 역병, 탄저병, 바이러스에 대한 저항성이 중요하겠으나, 태풍 등의 영향으로 대발생하는 경우를 대비하여 세균성점무늬병에 대한 저항성 품종의 개발이 필요할 것으로 생각된다. 따라서 다양한 육종소재를 확보하여 원예적 특성까지 분석한 이번 연구자료는 고추에서 앞으로의 세균성점무늬병저항성 육종에 도움이 될 것으로 기대되며, 선발된 세균성점무늬병 저항성 유전자원들 중 노지의 바이러스에 복합저항성을 지닌 KC00939, KC01015, KC01006은 고온다습한 기후로 인한 병해가 많은 인도, 중국, 동남아시아와 같은 국외에도 활용 가능성이 높아 한국 고추 품종의 종자 수출 시장 확대에 기여할 것으로 기대된다. 국내에서는 저항성 품종이 육성 보급될 경우 생산성의 안정과 세균성점무늬병 방제 노력을 줄여 농가생산비 절감에 큰 도움을 줄 수 있을 것이며, 세균성점무늬병과 바이러스에 고도의 복합저항성을 갖추면서 탁월한 색도를 나타낸 KC00939는 국내 김치용 고춧가루의 품질을 높여줄 재료로 육종에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이는 과민반응형 저항성이 병원균 변이에 취약한 문제점을 보완할 수 있기 때문에 매우 중요하다고 생각된다. 따라서 보다 지속적이고 안정한 저항성 품종을 육성하기 위해서는 과민반응형 저항성 뿐만 아니라 일반 저항성을 품종 육성에 활용하는 것이 필요하다. 이를 위해 다양한 저항성 유전자원의 확보는 다양한 육종 수요와 병원균의 변이에 대처하기 위해서 매우 중요한 일이 될 것이다.
- ECW NILs와 같이 HR 저항성 유전자만 도입된 계통들은 병원균을 살포접종할 경우 미세한 과민형 점무늬가 다수 형성되는 특징이 있으나 KC00939은 공시한 저항성 소재중 유일하게 침투접종시 과민형 반응을 나타낼 뿐만아니라 살포접종 후에 미세 과민형 점무늬도 형성되지 않아 Bs2의 강력한 수직 저항성에 양적 저항성을 겸비한 매우 이상적인 세균성점무늬병 저항성 소재로 평가되었다. 이들은 과민반응형 저항성 유전자가 새로운 race의 출현에 쉽게 무력화되는 문제를 해결 할 강한 일반저항성 유전자를 보유한 육종 소재로서 그 활용 가치가 클 것으로 예상되며, 식물 병 저항성에 관한 연구소재로서의 활용 또한 기대된다.
- 따라서 보다 지속적이고 안정한 저항성 품종을 육성하기 위해서는 과민반응형 저항성 뿐만 아니라 일반 저항성을 품종 육성에 활용하는 것이 필요하다. 이를 위해 다양한 저항성 유전자원의 확보는 다양한 육종 수요와 병원균의 변이에 대처하기 위해서 매우 중요한 일이 될 것이다. 과민반응형 저항성 유전자가 발견된 PI163192, PI260435, PI271322에도 일반 저항성 유전성분이 함께 들어있는 것으로 관찰되었으며(Kim and Hartmanm, 1985; Kim et al.
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