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문제 정의
- 또한 혈관염증 억제효과가 뛰어난 배합비로 혼합한 백수오, 우엉, 마추출혼합물이 혈관세포에서 얼마나 독성을 나타내는지 실험하였고, 백수오, 우엉, 마 추출혼합물이 혈관염증에 관여된 단백질 발현에 미치는 영향을 측정하였다. 본 연구를 통해 혈관염증 완화와 동맥경화 예방 및 치료에 효과적인 소재 개발에 필요한 기초자료를 제공하고자 하였다.
- , 2008). 이에 본 연구에서는 혈관염증을 완화시키고 동맥경화의 발생위험을 줄일 수 있는 소재를 개발하기 위하여, 혈관염증에 효능이 입증된 원료인 백수오, 우엉, 마 혼합물이 혈관염증을 가장 효과적으로 억제하는 배합비율을 찾아내고자 하였다. 또한 혈관염증 억제효과가 뛰어난 배합비로 혼합한 백수오, 우엉, 마추출혼합물이 혈관세포에서 얼마나 독성을 나타내는지 실험하였고, 백수오, 우엉, 마 추출혼합물이 혈관염증에 관여된 단백질 발현에 미치는 영향을 측정하였다.
제안 방법
- 배지를 제거하고, 최종 농도가 1 ㎎/㎖가 되도록 MTT를 첨가한 후, 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후 배지를 제거하고 DMSO를 150 ㎕를 첨가하여 formazan dye를 용해시키고 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과는 대조군의 흡광도 값으로 나누어 상대값으로 표시하였다.
- , and Dioscorea opposita on cell viability of human arterial smooth muscle cells(HASMC). Cells were treated with CADM5 (0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 ㎍/㎖) for 24 h. No significant difference between groups was found (n=3).
- HASMC 세포를 100 ㎜ dish에 1×106 cells로 분주하고 24 시간 배양한 후 TNF-α (10 ng/㎖)를 2시간동안 처리하여 염증을 유도한 후, 시료(32 ㎍/㎖)를 처리하여 12시간 동안 배양하였다. 배양한 HASMC 세포를 PBS로 두 번 wash 한 후 TRIzol reagent (Invitrogen Co.
- HASMC 세포를 100 ㎜ dish에 1×106 cells로 분주하고 24 시간 배양한 후 TNF-α(10 ng/㎖)를 2시간동안 처리하여 염증을 유도한 후, 시료를 16 또한 32 ㎍/㎖를 처리하여12시간 동안 배양하였다. 세포에Protein Extraction solution (iNtRON, Gyeonggi, Korea)을 첨가하고 얼음에서 1시간 방치한 후, 4℃, 12, 000rpm 에서 10분간 원심 분리하였다.
- , 2012a). HASMC 세포를 96 well plate에 5×103 cells/well로 분주하고 37℃에서 24시간 배양한 다음, 시료 용액 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 최종 농도가 1 ㎎/㎖가 되도록 MTT를 첨가한 후, 4시간 동안 배양하였다.
- Real-time PCRe cDNA, SYBR Green, VCAM-1 primer를 이용하여 진행되었다. PCR 조성은 cDNA를 증류수로 1/100으로 희석하여 8㎕를 사용하였고, 10 pM primer를 각각 0.5㎕, ROX plus 12.5㎕, 증류수 4㎕로 사용하여 total volume을 25㎕로 맞추었다. Real-time PCR cyclee 초기변성은 95℃ 10분, 변성은 95℃ 30초, annealinge 60℃ 1분, 신장반응은 95℃ 1분으로 하여 40 cycle을 진행하였고 융해곡선은 55℃로 시작하여 95℃를 끝으로 하여 0.
- 5㎕, 증류수 4㎕로 사용하여 total volume을 25㎕로 맞추었다. Real-time PCR cyclee 초기변성은 95℃ 10분, 변성은 95℃ 30초, annealinge 60℃ 1분, 신장반응은 95℃ 1분으로 하여 40 cycle을 진행하였고 융해곡선은 55℃로 시작하여 95℃를 끝으로 하여 0.5℃씩 상승시키며 80번을 반응하여 원하는 형광값을 검출하였다. 형광신호 정량은 MAX Pro program을 사용하였다.
- 여기에 1 ㎕의 RNase H를 각 시료에 첨가하고 37℃에서 20분간 반응하여 template mRNA를 제거하였다. Real-time PCRe cDNA, SYBR Green, VCAM-1 primer를 이용하여 진행되었다. PCR 조성은 cDNA를 증류수로 1/100으로 희석하여 8㎕를 사용하였고, 10 pM primer를 각각 0.
- VCAM-1 mRNA 발현억제효과가 가장 뛰어났던 CADM5의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. CADM5 (3.
- 형광신호 정량은 MAX Pro program을 사용하였다. 각각의 RT-PCR에서 동량의 RNA가 사용되었음을 확인하기 위하여 house keeping gene인 β-actin에 대한 RT-PCR 을 함께 진행하였다(Table 2).
- 세포에Protein Extraction solution (iNtRON, Gyeonggi, Korea)을 첨가하고 얼음에서 1시간 방치한 후, 4℃, 12, 000rpm 에서 10분간 원심 분리하였다. 단백질 정량은 Bicinchoninic acid assay (BCA) protein Assay kit (Bio-Rad, CA, U.S.A.)를 이용하였고 각각의 시료를 10% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동하고 Nitrocellulose membrane으로 전사하였다. 전사된 membrane을 5% nonfat milk/TBST (Tris-buffered saline and 0.
- 이에 본 연구에서는 혈관염증을 완화시키고 동맥경화의 발생위험을 줄일 수 있는 소재를 개발하기 위하여, 혈관염증에 효능이 입증된 원료인 백수오, 우엉, 마 혼합물이 혈관염증을 가장 효과적으로 억제하는 배합비율을 찾아내고자 하였다. 또한 혈관염증 억제효과가 뛰어난 배합비로 혼합한 백수오, 우엉, 마추출혼합물이 혈관세포에서 얼마나 독성을 나타내는지 실험하였고, 백수오, 우엉, 마 추출혼합물이 혈관염증에 관여된 단백질 발현에 미치는 영향을 측정하였다. 본 연구를 통해 혈관염증 완화와 동맥경화 예방 및 치료에 효과적인 소재 개발에 필요한 기초자료를 제공하고자 하였다.
- 배양하였다. 배양한 HASMC 세포를 PBS로 두 번 wash 한 후 TRIzol reagent (Invitrogen Co., CA, USA)를 이용하여 튜브에 모았다. 원심분리(12, 000rpm, 4℃, 5분)하여 분리한 상층액과 70% EtOH을 혼합하여 RNA를 침전시킨 후 EtOH로 2회 세척하여 total RNA를 분리하였다.
- 백수오, 우엉, 마 혼합물의 VCAM-1 mRNA expression 억제 효과 혈관 내 염증 완화 효과가 있다고 알려진 백수오, 우엉, 마를 혼합했을 때 효과를 극대화시킬 수 있는 혼합비율을 찾기 위해 Table 1과 같이 다양한 혼합비율로 혼합물을 제조하였다. 염증 완화 효과는 VCAM-1의 mRNA 발현을 real time qPCR으로 측정하여 이를 비교하였다.
- 표본번호는 백수오 (MPRBP00962), 우엉(NMR114), 마(NMR256)이다. 본 연구에 사용된 백수오의 동정을 위하여 식품의약품안전처 공고 제 2014-231호에 명시된 백수오와 이엽우피소 감별법에 따라 종특이 프라이머를 이용하여 백수오 시료의 유전자를 PCR로 증폭하였다. 분석결과 표준시료와 동일한 크기의 증폭 산물을 확인하였다.
- 본 연구에 사용된 백수오의 동정을 위하여 식품의약품안전처 공고 제 2014-231호에 명시된 백수오와 이엽우피소 감별법에 따라 종특이 프라이머를 이용하여 백수오 시료의 유전자를 PCR로 증폭하였다. 분석결과 표준시료와 동일한 크기의 증폭 산물을 확인하였다.
- , 2005). 세포에 TNF-α (10 ng/ ㎖)를 2시간동안 처리하여 염증을 유도한 후 CADM5의 처리가 세포부착인 자의 발현에 미치는 영향을 알아보았다. TNF-α는 대조군에 비해 VCAM-1과 ICAM-1의 발현을 유의적으로 증가시켰다.
- 시료의 세포독성은 3-4, 5-dimethylthiazol-2-yl-2, 5- diphenyltetrazoliumbromide (MTT)를 이용하여 측정하였다 (Kim et al., 2012a). HASMC 세포를 96 well plate에 5×103 cells/well로 분주하고 37℃에서 24시간 배양한 다음, 시료 용액 0, 3.
- 염증 완화 효과는 VCAM-1의 mRNA 발현을 real time qPCR으로 측정하여 이를 비교하였다. 그 결과 백수오 처리군, 마 처리군, 모든 혼합물 처리군에서 유의적인 억제효과가 관찰되었으며, 특히 백수오, 우엉, 마를 2:1:1 비율로 혼합제조한 CADM5 처리 군에서 VCAM-1 발현이 가장 크게 억제되었다(Fig.
대상 데이터
- Primary HASMC세포는 ScienCell Research Laboratories (San Diego, CA, USA)에서 구입하여 smooth muscle cell용 배지에 배양하였다. 이 배지는 필수아미노산, 비필수아미노산, 비타민, 유기질, 무기질, 호르몬, 성장인자, 미량무기질, 2% fetal bovine serum (FBS)를 포함하고 있다.
- 대한민국 제주에서 재배한 백수오 뿌리 25 ㎏을 70% 주정으로 82±2℃에서 24시간 추출 후, 여과하였으며, 85±2℃에서 14±1 Brix가 될 때까지 농축하였고, 동결건조하여 4.1 ㎏을 수득하였다. 제천 우엉 12.
- 의 뿌리이며, 마는 마과(Dioscoreaceae)에 속하는 Dioscorea opposita의 뿌리이다. 본 연구에 사용된 시료는 경희대학교, 한방재료공학과 강세찬 교수님의 식물학적 동정을 거쳤으며, 확증표본은 경희대학교 한방재료공학과에 보관되어 있다. 표본번호는 백수오 (MPRBP00962), 우엉(NMR114), 마(NMR256)이다.
- 2%)의 마 추출물을 획득하였다. 상기와 같은 방법으로 추출한 백수오, 우엉, 마를 중량비율로 혼합하여 실험에 사용하였다. Table 1은 혼합물의 이름과 배합비를 나타내었다.
- 1 ㎏을 수득하였다. 제천 우엉 12.5 ㎏을 70% 주정으로 추출/농축하고 동결건조한 결과 2.0 ㎏ (수율 15.8%)의 우엉추출물을 획득하였고, 마 12.5 ㎏을 70% 주정으로 추출/농축하고 동결건조한 결과 1.3 ㎏ (수율 10.2%)의 마 추출물을 획득하였다. 상기와 같은 방법으로 추출한 백수오, 우엉, 마를 중량비율로 혼합하여 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 시료는 경희대학교, 한방재료공학과 강세찬 교수님의 식물학적 동정을 거쳤으며, 확증표본은 경희대학교 한방재료공학과에 보관되어 있다. 표본번호는 백수오 (MPRBP00962), 우엉(NMR114), 마(NMR256)이다. 본 연구에 사용된 백수오의 동정을 위하여 식품의약품안전처 공고 제 2014-231호에 명시된 백수오와 이엽우피소 감별법에 따라 종특이 프라이머를 이용하여 백수오 시료의 유전자를 PCR로 증폭하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었다. 실험에서 얻어진 결과는 SPSS (version 22.
- 실험결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었다. 실험에서 얻어진 결과는 SPSS (version 22.0; IBM corp., NY, USA)를 이용하여 통계처리 하였으며 실험 결과의 유의성은 One-way ANOVA test, LSD 사후검정을 통하여 p가 0.05 이하인 경우 유의한 차이로 판정하였다.
이론/모형
- 5℃씩 상승시키며 80번을 반응하여 원하는 형광값을 검출하였다. 형광신호 정량은 MAX Pro program을 사용하였다. 각각의 RT-PCR에서 동량의 RNA가 사용되었음을 확인하기 위하여 house keeping gene인 β-actin에 대한 RT-PCR 을 함께 진행하였다(Table 2).
성능/효과
- , 2012). CADM5을 12시간 동안 처리한 결과 HO-1과 Nrf-2 단백질의 발현이 증가하였다(Fig. 3). 따라서 백수오, 우엉, 마 혼합추출물이 HO-1과 Nrf-2 단백질 발현을 증가시켜 혈관내피세포 염증 억제효능을 나타낼 것으로 사료된다.
- TNF-α는 대조군에 비해 VCAM-1과 ICAM-1의 발현을 유의적으로 증가시켰다. CADM5을 12시간 동안 처리한 결과 염증으로 인하여 증가하였던 ICAM-1과 VCAM-1 단백질의 발현이 감소하였다 (Fig. 3). 특히 CADM5는 농도의존적으로 VCAM-1 발현을 억제하였다.
- 염증 완화 효과는 VCAM-1의 mRNA 발현을 real time qPCR으로 측정하여 이를 비교하였다. 그 결과 백수오 처리군, 마 처리군, 모든 혼합물 처리군에서 유의적인 억제효과가 관찰되었으며, 특히 백수오, 우엉, 마를 2:1:1 비율로 혼합제조한 CADM5 처리 군에서 VCAM-1 발현이 가장 크게 억제되었다(Fig. 1).
- 특히 CADM5는 농도의존적으로 VCAM-1 발현을 억제하였다. 따라서 백수오, 우엉, 마 혼합추출물이 염증에 의해 유도된 ICAM-1 그리고 VCAM-1의 발현을 조절함으로써 동맥경화증을 유발하는 혈관 염증의 초기단계를 억제하여 항염증 작용에 효과가 있음을 기대할 수 있다.
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