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문제 정의
- 본 연구에서는 U-373-MG 세포에 VEGF와 HGF의 단독또는 병용처리를 통하여 세포의 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과 VEGF 처리에 의해서 세포의 증식이 약 4.
- 본 연구에서는 악성신경교종 세포로부터 유래한 U-373- MG 세포주를 이용하여 VEGF와 HGF에 의해 유도된 세포의 증식, 이동 및 침윤에 미치는 MMPs 억제제와 플라스민 억제제의 효과를 관찰하였다. 연구 결과, MMPs 억제제와 플라스민 억제제 처리에 의해 VEGF와 HGF에 의해 유도된 U-373- MG 세포의 증식, 이동 및 침윤이 유의할만하게 억제되었다.
가설 설정
- Results were similar in three independent experiments. (B) Media were quantitatively assayed by enzyme immunoassay. Data are means ± SD from three independent experiments.
제안 방법
- U-373-MG 세포를 24-well plate에 세포밀도가 5×104 cell/ cm2이 되도록 접종한 다음, 20% FBS (v/v) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후 confluent한 U-373-MG 세포를 무-혈청및 무-phenol red 배지에서 12시간 배양하였다. 세포를 새로운배지로 세척한 다음 대조완충용액 혹은 지시된 시약을 지정된시간만큼 처리하였다.
- 특히 MMP-2와 MMP-9은 인간의 악성신경교종 세포의 발생과 전이에 연관되어 있다고 알려져 있다[22]. 본 연구에서는 세포외기질의 분해에 관련된 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 활성을 측정하기위해 zymography를 이용하였다. 이를 위해 U-373-MG 세포에 VEGF 또는 HGF를 처리한 다음 zymography를 행한 결과, MMP-2의 경우 VEGF에 의해 약 1.
- 세포를 새로운배지로 세척한 다음 대조완충용액 혹은 지시된 시약을 지정된시간만큼 처리하였다. 분비된 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의실제양은 제조회사의 지시에 따라 enzyme immunoassay 키트(Fuji Chemical Industries, Toyama, Japan)로 측정하였다.
- 세포의 이동은 U-373-MG 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 well 당 1×105 세포 밀도로 챔버의 위쪽 칸에 접종한다음, QCM™ 24-well 발색 세포이동 정량 키트(Chemicon, Temecula, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 침윤 효과를 조사하기 위해서 8-μm 공극을 갖는 여과막이 부착된 Matrigel- coated 챔버(Beckton Dickinson, Bedford, MA, USA)의 상단에 1×105 세포를 접종하였다.
- 접종하였다. 이후 1~3일 동안 세포를 배양한 다음 CellTiter96® aqueous 세포증식 정량 키트(Promega. Madison, WI,USA)를 이용하여 Emax® microplate reader (Molecular Devi- ces, Sunnyvale, CA, USA)로 490 nm에서 용액의 흡광도를 측정하여 세포증식 효과를 확인하였다.
- 이후 PBS로 세척한 다음 무-혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후 95% 이상 confluent하게 자란 세포를 팁으로 긁어 U-373-MG 세포의 단일 층에 스크래치 상처를 만들었다. 이후 2.5% FBS (v/v) 첨가 DMEM 배지에서 대조 완충용액 또는 지시된 시약을 처리하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 배양한 다음 스크래치 상처의 간격을 측정하였다.
- 이후 PBS로 세척한 다음 무-혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후 95% 이상 confluent하게 자란 세포를 팁으로 긁어 U-373-MG 세포의 단일 층에 스크래치 상처를 만들었다. 이후 2.
- 이를 위해 U-373-MG 세포를 24-well plate에 세포밀도가 5×104 cell/cm2이 되도록 접종한 다음, 10% FBS (v/v) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 이후, 새로운 배지로 세척한 다음 confluent한 U- 373-MG 세포를 무-혈청 및 무-phenol red 배지에서 대조 완충용액 혹은 VEGF (5 ng/ml)와 HGF (5 ng/ml)를 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 젤라틴 zymography는 MMP-2 및 MMP-9의 기질인 젤라틴을 SDS-PAGE의 running gel에 첨가한 후 환원 조건에서 전기영동한 다음 1% Triton X-100 완충용액에서 재변성시킨 후 배양 완충용액(0.
- 이후, 새로운 배지로 세척한 다음 confluent한 U- 373-MG 세포를 무-혈청 및 무-phenol red 배지에서 대조 완충용액 혹은 VEGF (5 ng/ml)와 HGF (5 ng/ml)를 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 젤라틴 zymography는 MMP-2 및 MMP-9의 기질인 젤라틴을 SDS-PAGE의 running gel에 첨가한 후 환원 조건에서 전기영동한 다음 1% Triton X-100 완충용액에서 재변성시킨 후 배양 완충용액(0.05M Tris-HCl, pH 7.5, 0.02M NaCl, 5mM CaCl2와 0.02% Brij-35, 37℃)에서 16시간 반응시켰다. 이후 0.
- CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 침윤 효과를 조사하기 위해서 8-μm 공극을 갖는 여과막이 부착된 Matrigel- coated 챔버(Beckton Dickinson, Bedford, MA, USA)의 상단에 1×105 세포를 접종하였다. 이후 여과막을 건조, 염색한 다음 200 μl의 추출 완충용액이 포함된 well로 옮긴 다음, Emax® microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 5% Coomassie brilliant blue R250으로 3시간 염색시킨 다음, 10% acetic acid, 30% 메탄올에서 투명한 밴드가 나타날 때까지 탈색시켰다. 플라스민 활성은 분해 기질로 피브린을 첨가하여 피브린 zymography를 행하여 확인하였다.
대상 데이터
- Then, the media was changed to serum-free DMEM that was amended with control buffer (Con), VEGF (5 ng/ml), HGF (5 ng/ml), BB-94 (4 nM), α2AP (200 nmol/L), VEGF plus HGF (V+H), 4 nM BB-94 for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (BB-94+V+H), and 200 nmol/L α2AP for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (α 2AP+V+H). All experiments were performed in triplicate. Data are means ± SD from three independent experiments.
- MMP-2와 MMP-9 스탠다드는 Cal-Biochem (La Jolla, CA, USA)으로부터 구입하였으며 MMP- 2와 MMP-9 enzyme immunoassay 키트는 Fuji Chemical Industries (Toyama, Japan)로부터 구입하였다. BB-94 (batimastat)는 British Biotech Pharmaceuticals Ltd. (Oxford, UK)로부터, α2-antiplasmin (α2AP)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 배지 및 혈청은 Life Technology Inc.
- USA) 으로부터 구입하였다. MMP-2와 MMP-9 스탠다드는 Cal-Biochem (La Jolla, CA, USA)으로부터 구입하였으며 MMP- 2와 MMP-9 enzyme immunoassay 키트는 Fuji Chemical Industries (Toyama, Japan)로부터 구입하였다. BB-94 (batimastat)는 British Biotech Pharmaceuticals Ltd.
- U-373-MG 세포주는 한국세포주 은행에서 구입하여 10% FBS (v/v) 첨가 Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) 에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 배지 및 혈청은 Life Technology Inc. (Gaitherburg, MD, USA)로부터, 그 외 특별히 적시하지 않은 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터구입하여 사용하였다.
- 재조합 hVEGF와 hHGF는 R & D System (Minneapolis, MN, USA) 으로부터 구입하였다. MMP-2와 MMP-9 스탠다드는 Cal-Biochem (La Jolla, CA, USA)으로부터 구입하였으며 MMP- 2와 MMP-9 enzyme immunoassay 키트는 Fuji Chemical Industries (Toyama, Japan)로부터 구입하였다.
데이터처리
- 위에서 확인한 VEGF 및 HGF에 의한 U-373-MG 세포의 이동에 미치는 효과를 스크래치 상처회복 분석방법으로 확인하였다. 스크래치 상처를 만든 직후의 간격을 임의의 단위인 1로 설정하여 배양 24시간 및 48시간 후 스크래치 상처의 간격을 비교한 결과, 배양 24시간 후에 대조군의 간격이 14% 채워진 것과 비교하여 VEGF는 10%를 채워 세포의 이동증가를 확인하였다(Fig.
- 자료는 means±SD로 나타냈으며, 유의성은 Student- Newman-Keuls test에 의한 one-way ANOVA를 이용하여 검사하였다. 통계적 유의성은 p<0.
성능/효과
- MMP-2와 MMP-9의 실제 분비량을 enzyme immunoassay 를 통하여 확인한 결과, MMP-2는 VEGF 처리에 의해 분비량이 약 2.1배 증가되었으며, HGF에 의해서는 약 1.8배 증가되었고 VEGF와 HGF의 병용처리에 의해서는 약 4.6배 증가되었다 (Fig. 2B). MMP-9의 경우에는 VEGF 처리에 약 2.
- U- 373-MG 세포에서 플라스민의 분비에 미치는 VEGF와 HGF의효과를 피브린 zymography를 행하여 확인한 결과, VEGF 처리에 의해 플라스민의 분비량이 약 4.6배 증가되었고 HGF 처리에 의해서는 약 3.5배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리에 의해서는 약 6.2배 증가되었다(Fig. 3A). 플라스민의 실제분비량을 enzyme immunoassay를 통해 측정한 결과, VEGF 처리에 의해 플라스민의 분비량이 약 2.
- 4). U-373-MG 세포에 VEGF를 처리한 결과 세포의 이동이 약 4.9배, HGF 처리에 의해서는 약 3.7배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 6.2배 증가되었다(Fig. 4). 즉 VEHG와 HGF에 의한 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비 증가(Fig.
- U-373-MG 세포의 침윤에 미치는 VEGF와 HGF의 효과를 조사한 결과 대조군에 비해 VEGF는 약 3.6배, HGF는 약 2.8배 침윤을 증가시켰으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 침윤이 약 4.2배 증가되었다(Fig. 6). 한편 Lu 등[21]은 항-VEGF/VEGFR 제제 처리 후 증가된 침윤 표현형에 HGF/ MET가 관여한다고 보고하였다.
- 5). VEGF와 HGF를 병용처리한 군과 비교해볼 때 MMPs 억제제인 BB-94와 플라스민 억제제인 α2 AP에 의해서도 11%가 채워져 유의할만한 세포이동 억제효과를 나타냈다(Fig. 5).
- 이러한 결과는 인간의 악성신경교종 세포에 VEGF와 HGF를 포함한 다양한 수용체가 존재한다는 것을 의미한다[6]. VEGF와 HGF에 의한 U-373-MG 세포의 이동 증가가 단백질분해효소의 분비증가와 연관이 있는지를 확인하고자 광범위 MMPs 억제제인 BB-94를 처리(3일째)한 결과, 최대 이동 효과를 나타낸 HGF와 VEGF의 병용처리군 보다 세포의 이동이 약 32% 억제되었다(Fig. 4). 또한 플라스민 억제제인 α2AP에 의해서도 세포의 이동이 약 29% 억제되었다(Fig.
- 본 연구에서는 U-373-MG 세포에 VEGF와 HGF의 단독또는 병용처리를 통하여 세포의 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과 VEGF 처리에 의해서 세포의 증식이 약 4.1배증가되었고(3일째) HGF에 의해서는 약 3.7배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 4.7배 증가되었다(Fig. 1). 한편 VEGF와 HGF에 처리에 의한 U-373-MG 세포의 증식 효과가 MMPs와 플라스민의 분비 증가에 의한 것인지를 조사한 결과, 최대 증식 효과를 나타낸 VEGF와 HGF의 병용처리 군보다 MMPs의 광범위 억제제인 BB-94 처리(3일째)에 의해 약 12%, 플라스민 억제제인 α2AP의 처리(3일째)에 의해 약 10% 증식이 억제되었다(Fig.
- 4). 또한 플라스민 억제제인 α2AP에 의해서도 세포의 이동이 약 29% 억제되었다(Fig. 4). 이러한 결과는 VEGF 와 HGF에 의한 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비증가가직접적 또는 간접적으로 U-373-MG 세포의 이동을 촉진시킬것이라 여겨진다.
- 한다. 본 연구 결과, VEGF와 HGF 처리에 U-373- MG 세포의 증식 증가, MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비증가와 유사하게 세포의 이동이 증가되었다(Fig. 4). U-373-MG 세포에 VEGF를 처리한 결과 세포의 이동이 약 4.
- 또한 Guo 등[15]은 Angiopoietin-2가 MMP-2의 활성화를 통해 U-38-MG 세포의 침윤을 증가시킨다고 보고하였으며 Choe 등 [10]도 악성신경교종 세포의 침윤 증가와 혈관신생을 유도하는 핵심 분자들을 활성화시키는데 MMP-2가 관여한다고 보고한 바 있다. 본 연구결과 MMPs 억제제인 BB-94와 플라스민 억제제인 α2AP 처리에 의해 U-373-MG 세포의 침윤이 유의할만하게 억제되었다.
- 스크래치 상처를 만든 직후의 간격을 임의의 단위인 1로 설정하여 배양 24시간 및 48시간 후 스크래치 상처의 간격을 비교한 결과, 배양 24시간 후에 대조군의 간격이 14% 채워진 것과 비교하여 VEGF는 10%를 채워 세포의 이동증가를 확인하였다(Fig. 5). VEGF와 HGF를 병용처리한 군과 비교해볼 때 MMPs 억제제인 BB-94와 플라스민 억제제인 α2 AP에 의해서도 11%가 채워져 유의할만한 세포이동 억제효과를 나타냈다(Fig.
- 효과를 관찰하였다. 연구 결과, MMPs 억제제와 플라스민 억제제 처리에 의해 VEGF와 HGF에 의해 유도된 U-373- MG 세포의 증식, 이동 및 침윤이 유의할만하게 억제되었다.
- 본 연구에서는 세포외기질의 분해에 관련된 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 활성을 측정하기위해 zymography를 이용하였다. 이를 위해 U-373-MG 세포에 VEGF 또는 HGF를 처리한 다음 zymography를 행한 결과, MMP-2의 경우 VEGF에 의해 약 1.6배, HGF에 의해 약 1.4배분비가 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 3.8배증가되었다(Fig. 2A). MMP-9의 경우 VEGF에 의해서 약 4.
- 이상의 연구결과를 요약하면, 인간의 악성신경교종 유래 U-373-MG 세포에서 VEGF와 HGF 처리에 의한 세포의 증식, 이동 및 침윤의 증가는 VEGF와 HGF의 직접적인 신호전달경로와 함께 부분적으로는 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비증가에 의한 것이라 여겨진다.
- 이러한 결과는 VEGF 와 HGF에 의한 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비증가가직접적 또는 간접적으로 U-373-MG 세포의 이동을 촉진시킬것이라 여겨진다. 즉 MMPs 억제제와 플라스민 억제제는 VEGF와 HGF의 up-regulation을 차단함으로써 U-373-MG 세포의 이동을 억제하는 것으로 사료된다.
- 4). 즉 VEHG와 HGF에 의한 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비 증가(Fig. 2~Fig. 3)와 U-373- MG 세포의 이동은 비례적으로 증가하였다(Fig. 4). 이러한 결과는 인간의 악성신경교종 세포에 VEGF와 HGF를 포함한 다양한 수용체가 존재한다는 것을 의미한다[6].
- 3A). 플라스민의 실제분비량을 enzyme immunoassay를 통해 측정한 결과, VEGF 처리에 의해 플라스민의 분비량이 약 2.2배 증가되었고 HGF 처리에 의해서는 약 1.7배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 3.3배 증가되었다(Fig. 3B).
- 1). 한편 VEGF와 HGF에 처리에 의한 U-373-MG 세포의 증식 효과가 MMPs와 플라스민의 분비 증가에 의한 것인지를 조사한 결과, 최대 증식 효과를 나타낸 VEGF와 HGF의 병용처리 군보다 MMPs의 광범위 억제제인 BB-94 처리(3일째)에 의해 약 12%, 플라스민 억제제인 α2AP의 처리(3일째)에 의해 약 10% 증식이 억제되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 MMPs 및 플라스민이 종양 미세환경에서 성장신호 및 항-성장신호 사이의 균형을 파괴하여 성장을 조절하는 인자로 작용할 가능성을 시사해준다.
후속연구
- 1). 이러한 결과는 MMPs 및 플라스민이 종양 미세환경에서 성장신호 및 항-성장신호 사이의 균형을 파괴하여 성장을 조절하는 인자로 작용할 가능성을 시사해준다.
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