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문제 정의
- 이에 따라 본 연구에서는 버섯 재배사 내 실내공기, 버섯 배양배지용 재료, 식물병반(동백나무, 줄딸기, 은방울꽃, 생강나무)과 오염된 가구에서 분리하여 동정된 진균 중 국내 미기록 18종에 대한 정보를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 28S rDNA는 94°C에서 5분간 predenaturation한 후, denaturation 94°C 30초, annealing 58°C 30초, elongation 72°C 30초 조건에서 총 30 cycle 진행하고 마지막으로 72°C에서 10분간 final extension하여 수행하였다.
- ITS rDNA region, β-tubulin gene, 18S rDNA는 94°C에서 5분간 predenaturation한 후, denaturation 94°C 30초, annealing 56°C 30초, elongation 72°C 30초 조건에서 총 30 cycle 진행하고 마지막으로 72°C에서 10분간 final extension하여 수행하였다.
- 또한 분자적 특징을 알아보기 위해 drilling 방법에 따라 genomic DNA를 추출하고 1차 동정을 위하여 internal transcribed spacer (ITS) rDNA region을 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3') / ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [13] 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭하였다. ITS rDNA region을 1차적으로 동정 후 상동성이 낮은 균주는 논문 검색을 통하여 그 종이 속한 속을 동정할 때 사용하는 특이적 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 이용한 특이적 프라이머는 28S rDNA를 증폭하는 프라이머 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')/NS8 (5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3') [13], β-tubulin gene을 증폭하는 프라이머 BT12 (5'-GTTGTCAATGCAGAAGGTCTC-3') / T10(5'-ACGATAGGTTCACCTCCAGAC-3') [15], translation elongation factor (TEF) 1-alpha gene을 증폭하는 프라이머 TEF728 (5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3')/ TEF1(5'-GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3') [14], Calmodulin gene을 증폭하는 프라이머 cmd5(5'-CCGAGTACAAGGAGGCCTTC-3') / cmd6 (5'-CCGATAGAGGTCATA ACGTGG-3')[16]를 이용하였다.
- TEF gene과 calmodulin gene은 94°C에서 5분간 predenaturation한 후, denaturation 94°C 30초, annealing 52°C 30초, elongation 72°C 30초 조건에서 총 30 cycle 진행하고 마지막으로 72°C에서 10분간 final extension하여 수행하였다. PCR 증폭된 DNA 산물은 1% 아가로스겔에서 전기영동을 수행하여 확인한 후 High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 정제하고 마크로젠사(Macrogen, Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.
- TEF gene과 calmodulin gene은 94°C에서 5분간 predenaturation한 후, denaturation 94°C 30초, annealing 52°C 30초, elongation 72°C 30초 조건에서 총 30 cycle 진행하고 마지막으로 72°C에서 10분간 final extension하여 수행하였다.
- 3 L/min 유량으로 1분 간 포집하였다. 공기 채집은 표고버섯 재배사의 가운데 지점에서 진행하였고 높이는 1.3 m 높이에서 수평을 맞추어 수행하였다. 배양배지로서는 세균 증식 억제를 위해 암피실린(ampicillin)을 100 µg/mL 농도로 첨가한 malt-extract agar (MEA; Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하였다[7, 10, 11].
- 동백나무(Camellia japonica)의 잎, 한국의 산에서 자생하는 식물인 줄딸기(Rubus oldhamii), 은방울꽃(Convallaria keiskei), 생강나무(Lindera obtusiloba)의 잎에서 식물병반을 채집하여 진균을 분리 · 동정하였다.
- 동정된 진균은 버섯 재배사 내 실내공기에서 6종, 식물병반에서 6종, 버섯 배양배지 재료에서 5종, 오염된 가구에서 1종이 각각 분리되었다 이들 동정된 균주에 대한 형태학적 특성과 ITS rDNA, 18S rDNA, 28S rDNA, calmodulin gene, translation elongation factor gene, β-tubulin gene 등의 염기서열에 기반한 분자계통학적 관계에 대하여 기술하였다.
- 또한 분자적 특징을 알아보기 위해 drilling 방법에 따라 genomic DNA를 추출하고 1차 동정을 위하여 internal transcribed spacer (ITS) rDNA region을 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3') / ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [13] 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭하였다.
- 본 연구팀은 2016년 버섯 재배사 내 실내공기, 버섯 배양배지용 재료, 식물병반, 오염된 가구 등으로부터 미기록 진균 발굴 작업을 수행하였다. 그 결과로서 버섯 재배사 내 실내공기와 버섯 배양배지용 재료에서 분리 · 동정한 진균에 대하여 보고가 되었으며, 2017년 버섯 배양배지용 재료에서는 Penicillium simplicissimum, Eurotium amstelodami, Penicillium crustosum, Aspergillus niger 등을 분리 · 동정하였다[6].
- 시료의 상처 부위를 해부현미경 (SZ61 stereo microscope; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 후 부위의 일부를 생물안전 작업대에서 멸균된 수술용 칼을 이용하여 1 × 1 cm로 잘랐다.
- 시료의 상처 부위를 해부현미경 (SZ61 stereo microscope; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 후 부위의 일부를 생물안전 작업대에서 멸균된 수술용 칼을 이용하여 1 × 1 cm로 잘랐다. 자른 절편시료를 2% 차아염소산나트륨 용액에 1분, 100% 에탄올에 1분, 멸균된 증류수에 1분씩 처리 하였다가 물기를 제거하고 나서 potato dextrose agar (PDA; Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하였다[12].
- 형태학적 동정을 위하여서는 순수 분리하여 고체 배지에 형성된 균사체의 균총 형태와 특성을 육안으로 관찰하였고, 미세구조는 광학현미경(Axioskop40; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 분생자경, 분생포자 등을 관찰하였다. 또한 분자적 특징을 알아보기 위해 drilling 방법에 따라 genomic DNA를 추출하고 1차 동정을 위하여 internal transcribed spacer (ITS) rDNA region을 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3') / ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [13] 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭하였다.
대상 데이터
- 2015년 11월에 경상남도 거창군, 경기도 여주군, 전라남도 장흥군, 익산시, 충청남도 청양군에 위치한 표고 농장들의 실내공기를 포집한 후 분리하였다(Fig. 1B, 1C). 공기 채취는 ISO 16000-18에 기반한 충돌법[9]에 따라 Andersen sampler (Single Stage Ambient Viable Sampler Model 10-880; Tisch Environmental, Cleves, OH, USA)를 사용하여 28.
- 2015년 5월 충청남도 부여군에 위치한 버섯 재배 농장에서 사용하는 버섯 배양배지의 재료(Fig. 1G)에서 시료를 채집하였다. 멸균된 증류수 20 mL에 버섯 배양배지 재료 1 g을 넣고 20분간 vortexing을 하여 고르게 섞어준 후 혼탁된 시료액을 암피실린이 첨가된 PDA에 100 µL씩평판도말 후 25°C에서 3일간 배양하였다.
- 2016년 10월 경상남도 고성에 위치한 신축 아파트의 붙박이 가구의 벽면에 발생한 진균을 멸균된 거즈에 증류수를 묻혀 진균 발생 부위를 문질러 시료를 채집하였다(Fig. 1H). 채집한 시료를 증류수 20 mL에 넣어 10 분간 vortexing한 후, PDA 배지에 100 µL씩 평판도말 후 25°C에서 3일간 배양하였다.
- 2016년 3월 천안의 동백나무(Camellia japonica)의 잎에 생겨난 병증처럼 보이는 부위에서 시료를 채집하였다(Fig. 1A). 또한 2015년 9월 강원도 홍천에 있는 매화산에서 자생하는 식물인 줄딸기(Rubus oldhamii)(Fig.
- 1A). 또한 2015년 9월 강원도 홍천에 있는 매화산에서 자생하는 식물인 줄딸기(Rubus oldhamii)(Fig. 1D), 은방울꽃(Convallaria keiskei)(Fig. 1F), 생강나무(Lindera obtusiloba)(Fig.1E)의 잎의 병증부위를 채집하였다. 시료의 상처 부위를 해부현미경 (SZ61 stereo microscope; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 후 부위의 일부를 생물안전 작업대에서 멸균된 수술용 칼을 이용하여 1 × 1 cm로 잘랐다.
- 다양한 시료에서 진균을 분리하였으며, 분리한 진균 중 균총을 형태적으로 구분하였을 때 버섯 재배사 내 실내공기에서 6균주, 식물병반에서 6균주, 버섯 배양배지 재료에서 5균주, 오염된 가구에서 1균주가 형태적으로 차이를 보였다. 버섯 재배사 내 실내공기에서 분리한 균주는 DK11-3, DK11-4, DK11-6, DK11-8, DK11-9, DK11-14, 식물병반에서 분리한 균주DK11-1, DK11-2, DK11-5, DK11-10, DK11-11, DK11-13, 버섯 배양배지 재료에서 분리한 균주인 DK11-12, DK11-15, DK11-16, DK11-17, DK11-18, 오염된 가구에서 분리한 균주인 DK11-169를 선택하여 동정하였다. PDA에서 7일간 배양한 균총을 관찰하였을 때, 버섯재배사 내 실내공기에서 분리한 DK11-3은 흰색 또는 아이보리색의 균사가 환을 이루며 생장하며 가운데 부분이 부유하는 특성이 있으며(Fig.
- 순수 분리버섯 재배사 내 실내 공기에서 채집한 배지는 5일 동안 25°C 배양기에서 배양하였고, 자라난진균은 단포자 분리를 통해 순수 분리하였다.
- 동정된 진균들을 문헌 검색한 결과 국내에 미기록 종이었다. 이에 균주의 생체시료는 국립생물자원관에 기탁하여 DK11-1은 NIBRFG0000499201, DK11-2는 NIBRFG0000499202, DK11-3은 NIBRFG0000499203, DK11-4는 NIBRFG0000499204, DK11-5는 NIBRFG0000499205, DK11-6은 NIBRFG0000499206, DK11-8은 NIBRFG 0000499208, DK11-9는 NIBRFG0000499330, DK11-10은 NIBRFG0000499209, DK11-11은 NIBRFG0000499210, DK11-12는 NIBRFG0000499211, DK11-13은 NIBRFG0000499212, DK11-14는 NIBRFG0000499213, DK11-15는 NIBRFG0000499214, DK11-16은 NIBRFG0000499215, DK11-17은 NIBRFG0000499216, DK11-18은 NIBRFG0000499217, DK11- 169는 NIBRFG0000499331으로 기탁번호를 각각 부여 받았다.
- 이용한 특이적 프라이머는 28S rDNA를 증폭하는 프라이머 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')/NS8 (5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3') [13], β-tubulin gene을 증폭하는 프라이머 BT12 (5'-GTTGTCAATGCAGAAGGTCTC-3') / T10(5'-ACGATAGGTTCACCTCCAGAC-3') [15], translation elongation factor (TEF) 1-alpha gene을 증폭하는 프라이머 TEF728 (5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3')/ TEF1(5'-GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3') [14], Calmodulin gene을 증폭하는 프라이머 cmd5(5'-CCGAGTACAAGGAGGCCTTC-3') / cmd6 (5'-CCGATAGAGGTCATA ACGTGG-3')[16]를 이용하였다.
데이터처리
- gov)의 웹에 있는 BLAST 프로그램을 사용하여 DNA 데이터베이스에 등록되어 있는 진균들과 상동성을 비교하였다. 계통분석을 위해서는 분리 균주와 관련된 taxon 염기서열을 NCBI의 GenBank에서 다운받았고 MEGA 6 프로그램[17]을 이용하여 염기서열의 유사도 및phylogenetic analysis를 수행하였다. 계통도는 neighbor-joining 방법[18]으로 분석하였고 계통도 가지의 clade 신뢰도는 1,000번의 bootstrap resampling을 수행하여 평가하였다.
- 분석된 염기서열은 분자동정을 위해 우선 진균의 바코드로 사용되는 염기서열을 미국 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 웹에 있는 BLAST 프로그램을 사용하여 DNA 데이터베이스에 등록되어 있는 진균들과 상동성을 비교하였다. 계통분석을 위해서는 분리 균주와 관련된 taxon 염기서열을 NCBI의 GenBank에서 다운받았고 MEGA 6 프로그램[17]을 이용하여 염기서열의 유사도 및phylogenetic analysis를 수행하였다.
이론/모형
- 계통분석을 위해서는 분리 균주와 관련된 taxon 염기서열을 NCBI의 GenBank에서 다운받았고 MEGA 6 프로그램[17]을 이용하여 염기서열의 유사도 및phylogenetic analysis를 수행하였다. 계통도는 neighbor-joining 방법[18]으로 분석하였고 계통도 가지의 clade 신뢰도는 1,000번의 bootstrap resampling을 수행하여 평가하였다.
- 1B, 1C). 공기 채취는 ISO 16000-18에 기반한 충돌법[9]에 따라 Andersen sampler (Single Stage Ambient Viable Sampler Model 10-880; Tisch Environmental, Cleves, OH, USA)를 사용하여 28.3 L/min 유량으로 1분 간 포집하였다. 공기 채집은 표고버섯 재배사의 가운데 지점에서 진행하였고 높이는 1.
성능/효과
- β-tubulin을 기반하여 동정한 결과 DK11-2는 Pestalotiopsis portugalica KM199422와 100% 상동하였으며(Fig. 4F), 18S rDNA 염기서열을 기반하여 동정한 결과 DK11-9는 Coniochaeta velutina KF971839와 100% 상동하였다(Fig. 4D).
- 4D). 28S rDNA 염기서열을 기반으로 동정한 결과 DK11-1는 Rachicladosporium pini JF951165, DK11-3은 Coprinellus xanthothrix AY207193, DK11-5는 Paraconiothyrium fuckelii GU237960, DK11-8은 Leptosphaeria rubefaciens JF740311, DK11-10은 Colletotrichum spaethianum JN940810, DK11-11은 Umbelopsis nana KM017699, DK11-13은 Pilidiella castaneicola AF408378과 100% 상동하였다(Fig. 4C). 분리된 균주들은 각각의 균주들이 동정된 균들과 같은 그룹을 형성하는 것을 계통수(Fig.
- 4B). Caldmoulin 염기서열을 기반하여 동정한 결과, DK11-12는 Penicillium pulvillorum KC346336, DK11-15는 Penicillium erubescens HQ646577, DK11-16는 Penicillium turbatum AB567659, DK11-17는 Penicillium melinii KP016793, DK11-18는 Penicillium sabulosum KP016805, DK11-169는 Aspergillus creber KJ766991과 100% 상동하였다(Fig. 4A). TEF 염기서열을 기반하여 동정한 결과 DK11-6은 Ceratocystis paradoxa JX518320과 100% 상동하였다(Fig.
- 4에 나타냈다. ITS rDNA 염기서열을 기반하여 동정한 결과 DK11-4는 Myrothecium gramineum HQ608010과 100% 상동하였으며, DK11-14는 Epicoccum sorghinum KU856638과 100% 상동하였다(Fig. 4B). Caldmoulin 염기서열을 기반하여 동정한 결과, DK11-12는 Penicillium pulvillorum KC346336, DK11-15는 Penicillium erubescens HQ646577, DK11-16는 Penicillium turbatum AB567659, DK11-17는 Penicillium melinii KP016793, DK11-18는 Penicillium sabulosum KP016805, DK11-169는 Aspergillus creber KJ766991과 100% 상동하였다(Fig.
- 4A). TEF 염기서열을 기반하여 동정한 결과 DK11-6은 Ceratocystis paradoxa JX518320과 100% 상동하였다(Fig. 4E). β-tubulin을 기반하여 동정한 결과 DK11-2는 Pestalotiopsis portugalica KM199422와 100% 상동하였으며(Fig.
- 다양한 시료에서 진균을 분리하였으며, 분리한 진균 중 균총을 형태적으로 구분하였을 때 버섯 재배사 내 실내공기에서 6균주, 식물병반에서 6균주, 버섯 배양배지 재료에서 5균주, 오염된 가구에서 1균주가 형태적으로 차이를 보였다. 버섯 재배사 내 실내공기에서 분리한 균주는 DK11-3, DK11-4, DK11-6, DK11-8, DK11-9, DK11-14, 식물병반에서 분리한 균주DK11-1, DK11-2, DK11-5, DK11-10, DK11-11, DK11-13, 버섯 배양배지 재료에서 분리한 균주인 DK11-12, DK11-15, DK11-16, DK11-17, DK11-18, 오염된 가구에서 분리한 균주인 DK11-169를 선택하여 동정하였다.
- 2016년 버섯 재배사 내 실내공기, 식물병반(동백나무의 잎, 줄딸기, 은방울꽃, 생강나무), 버섯 배양배지 재료, 오염된 가구 등에서 진균을 분리 · 동정하였다. 동정된 진균 중 18종이 국내 미기록임을 확인하였다. 동정된 진균은 버섯 재배사 내 실내공기에서 6종, 식물병반에서 6종, 버섯 배양배지 재료에서 5종, 오염된 가구에서 1종이 각각 분리되었다 이들 동정된 균주에 대한 형태학적 특성과 ITS rDNA, 18S rDNA, 28S rDNA, calmodulin gene, translation elongation factor gene, β-tubulin gene 등의 염기서열에 기반한 분자계통학적 관계에 대하여 기술하였다.
- 본 연구에서 분리 · 동정된 진균에 대한 문헌 자료를 조사한 결과 각 종에 대한 정보는 균학적으로 분류 특성 이외에는 다른 특성 관련 과학적 사실이 잘 알려져 있지 않았다.
- 4C). 분리된 균주들은 각각의 균주들이 동정된 균들과 같은 그룹을 형성하는 것을 계통수(Fig. 4)에서 확인하였으며 이에 따라 형태적(Figs. 2, 3)과 분자생물학적 분석 결과(Table 1, Fig. 4)를 종합하여 동정하였다. 동정된 진균들을 문헌 검색한 결과 국내에 미기록 종이었다.
- 2M). 식물병반 시료에서 분리한 진균 중 동백나무 잎의 병반에서 분리한 DK11-1은 올리브색 또는 짙은 녹색이며, 불규칙한 모양을 나타냈고(Fig. 2A), DK11-2는 옅은 회색의 균사로 촘촘하게 생장하며 중앙에는 올리브색 또는 녹회색의 균사로 생장하였다(Fig. 2B). 국내 산에 자생하는 식물인 줄딸기에서 분리한 DK11-5는 아이보리색의 균사가 조밀하게 생장하며 가운데에 노란색의 환을 이루었다(Fig.
- Colletotrichum spaethianum의 경우는 브라질에서 파(Allium fistulosum)와 원추리(Hemerocallis flava)에 탄저병을 일으키는 진균으로 보고되었다[22-23]. 이 같은 문헌 보고에 따라 본 연구에서 분리된 균류 중 일부는 식물병원균으로 알려진 균류임을 시사하였다. 이 중 파와 원추리를 제외한 기주는 국내 분포가 없는 경우이다.
후속연구
- 이 중 파와 원추리를 제외한 기주는 국내 분포가 없는 경우이다. 그리고 본 연구에서 분리된 균주는 해외 기주와 원천이 다르기 때문에 향후 이들 균류가 실제로 보고된 기주 식물 또는 다른 식물에도 병을 유발할 수 있는지에 관해서는 병원성 시험이 이루어져야 할 것이다.
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