멸구과 8종의 ITS2 DNA 염기서열 비교 분석과 고리매개등온증폭법(LAMP)을 이용한 벼멸구 특이 진단법 ITS2 DNA Sequence Analysis for Eight Species of Delphacid Planthoppers and a Loop-mediated Isothermal Amplification Method for the Brown Planthopper-specific Detection원문보기
멸구과(Delphacidae) 8종의 internal transcribed spacer 2 (ITS2) DNA 염기서열로 종간 차이 추정값을 비교하고 분자계통수를 추론하였다. ITS2 DNA 염기서열 길이는 종(species)마다 550 bp (흰등멸구)에서 699 bp (겨풀멸구)까지 차이를 보였다. 같은 Nilaparvata 속의 겨풀멸구와 벼멸구붙이 사이의 염기서열 차이 추정값($d{\pm}S.E.$)은 $0.001{\pm}0.001$로 가장 낮았으며, 사슴멸구와 일본멸구 사이는 $0.579{\pm}0.021$로 가장 높았다. 벼멸구와 다른 멸구류들과의 종간 염기서열 차이 추정값은 $0.056{\pm}0.008$ (겨풀멸구)에서부터 $0.548{\pm}0.021$ (일본멸구)로 구분되었다. 반면, Neighbor-joining 방법으로 추론된 분자계통수에서는 겨풀멸구와 벼멸구붙이를 제외하고 나머지 멸구류들은 독립된 다른 그룹으로 분지되었다. 벼멸구의 ITS2 염기서열을 참고하여 벼멸구 특이 고리매개등온증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 4 세트(BPH-38, BPH-38-1, BPH-207 및 BPH-92)를 제작하였다. 이들 각각을 벼멸구, 흰등멸구 및 애멸구의 게놈 DNA와 $65^{\circ}C$에서 60분간 반응시켰을 때, 벼멸구 시료에서만 증폭 산물들이 관찰되었다. BPH-92 LAMP 프라이머 세트로 $65^{\circ}C$에서 벼멸구 DNA의 양(0.1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng)과 반응시간(20분, 30분, 40분, 60분)을 달리하여 형광반응을 관찰하였을 때, 20분과 30분 반응에서는 100 ng 까지에서도 발광여부 구별이 어려웠다. 그러나 40분 반응에서는 10 ng 이상에서, 60분 반응에서는 0.1 ng 이상에서 발광여부가 명확히 구별되었다.
멸구과(Delphacidae) 8종의 internal transcribed spacer 2 (ITS2) DNA 염기서열로 종간 차이 추정값을 비교하고 분자계통수를 추론하였다. ITS2 DNA 염기서열 길이는 종(species)마다 550 bp (흰등멸구)에서 699 bp (겨풀멸구)까지 차이를 보였다. 같은 Nilaparvata 속의 겨풀멸구와 벼멸구붙이 사이의 염기서열 차이 추정값($d{\pm}S.E.$)은 $0.001{\pm}0.001$로 가장 낮았으며, 사슴멸구와 일본멸구 사이는 $0.579{\pm}0.021$로 가장 높았다. 벼멸구와 다른 멸구류들과의 종간 염기서열 차이 추정값은 $0.056{\pm}0.008$ (겨풀멸구)에서부터 $0.548{\pm}0.021$ (일본멸구)로 구분되었다. 반면, Neighbor-joining 방법으로 추론된 분자계통수에서는 겨풀멸구와 벼멸구붙이를 제외하고 나머지 멸구류들은 독립된 다른 그룹으로 분지되었다. 벼멸구의 ITS2 염기서열을 참고하여 벼멸구 특이 고리매개등온증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 4 세트(BPH-38, BPH-38-1, BPH-207 및 BPH-92)를 제작하였다. 이들 각각을 벼멸구, 흰등멸구 및 애멸구의 게놈 DNA와 $65^{\circ}C$에서 60분간 반응시켰을 때, 벼멸구 시료에서만 증폭 산물들이 관찰되었다. BPH-92 LAMP 프라이머 세트로 $65^{\circ}C$에서 벼멸구 DNA의 양(0.1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng)과 반응시간(20분, 30분, 40분, 60분)을 달리하여 형광반응을 관찰하였을 때, 20분과 30분 반응에서는 100 ng 까지에서도 발광여부 구별이 어려웠다. 그러나 40분 반응에서는 10 ng 이상에서, 60분 반응에서는 0.1 ng 이상에서 발광여부가 명확히 구별되었다.
Estimates of evolutionary sequence divergence and inference of a phylogenetic tree for eight delphacid planthopper species were based on the full-length nucleotide sequence of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) region. Size of the ITS2 DNA sequence varied from 550 bp in Sogatella furcifera to ...
Estimates of evolutionary sequence divergence and inference of a phylogenetic tree for eight delphacid planthopper species were based on the full-length nucleotide sequence of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) region. Size of the ITS2 DNA sequence varied from 550 bp in Sogatella furcifera to 699 bp in Nilaparvata muiri. Nucleotide sequence distance ($d{\pm}S.E.$) was lowest between N. muiri and N. bakeri ($0.001{\pm}0.001$), and highest between Ecdelphax cervina and Stenocranus matsumurai ($0.579{\pm}0.021$). Sequence distance between N. lugens and other planthoppers ranged from $0.056{\pm}0.008$ (N. muiri) to $0.548{\pm}0.021$ (S. matsumurai). In the neighbor-joining phylogenetic tree, all planthoppers were clustered separately into a species group, except N. muiri and N. bakeri. The ITS2 nucleotide sequence of N. lugens was used to design four loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets (BPH-38, BPH-38-1, BPH-207, and BPH-92) for N. lugens species-specific detection. After the LAMP reaction of three rice planthoppers, N. lugens, S. furcifera, and Laodelphax striatellus, with the four LAMP primer sets for 60 min at $65^{\circ}C$, LAMP products were observed in the genomic DNA of N. lugens only. In the BPH-92 LAMP primer set, the fluorescence relative to that of the negative control differed according to the amount of DNA (0.1 ng, 10 ng, and 100 ng) and incubation duration (20 min, 30 min, 40 min, and 60 min). At $65^{\circ}C$ incubation, the difference was clearly observed after 40 min with 10 ng and100 ng, but with a 60-min incubation period, the minimum DNA needed was 0.1 ng. However, there was little difference in fluorescence among all DNA amounts tested with 20 or 30 min incubations.
Estimates of evolutionary sequence divergence and inference of a phylogenetic tree for eight delphacid planthopper species were based on the full-length nucleotide sequence of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) region. Size of the ITS2 DNA sequence varied from 550 bp in Sogatella furcifera to 699 bp in Nilaparvata muiri. Nucleotide sequence distance ($d{\pm}S.E.$) was lowest between N. muiri and N. bakeri ($0.001{\pm}0.001$), and highest between Ecdelphax cervina and Stenocranus matsumurai ($0.579{\pm}0.021$). Sequence distance between N. lugens and other planthoppers ranged from $0.056{\pm}0.008$ (N. muiri) to $0.548{\pm}0.021$ (S. matsumurai). In the neighbor-joining phylogenetic tree, all planthoppers were clustered separately into a species group, except N. muiri and N. bakeri. The ITS2 nucleotide sequence of N. lugens was used to design four loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets (BPH-38, BPH-38-1, BPH-207, and BPH-92) for N. lugens species-specific detection. After the LAMP reaction of three rice planthoppers, N. lugens, S. furcifera, and Laodelphax striatellus, with the four LAMP primer sets for 60 min at $65^{\circ}C$, LAMP products were observed in the genomic DNA of N. lugens only. In the BPH-92 LAMP primer set, the fluorescence relative to that of the negative control differed according to the amount of DNA (0.1 ng, 10 ng, and 100 ng) and incubation duration (20 min, 30 min, 40 min, and 60 min). At $65^{\circ}C$ incubation, the difference was clearly observed after 40 min with 10 ng and100 ng, but with a 60-min incubation period, the minimum DNA needed was 0.1 ng. However, there was little difference in fluorescence among all DNA amounts tested with 20 or 30 min incubations.
본 연구에서는 벼멸구(N. lugens), 겨풀멸구(N. muiri), 벼멸구붙이(N. bakeri), 북방멸구(Changeondelphax velitchkovskyi), 흰등멸구(Sogatella furcifera), 애멸구(Laodelphax striatellus), 사슴멸구(Ecdelphax cervina) 및 일본멸구(Stenocranus matsumurai) 로부터 핵내 리보솜 RNA 영역 ITS2 (Internal transcribed spacer 2)의 시퀀스를 해독하고 군외군(outgroup)으로 미국선녀벌레 (Metcalfa pruinosa) (Hemiptera: Flatidae)와 톱다리개미허리노린재(Riptortus pedestris) (Hemiptera: Alydidae)의 ITS2 DNA 시퀀스를 함께 비교하였으며, 종(species) 간 뉴클레오티드 차이와 고리매개등온증폭(LAMP) 기술을 통해 흰등멸구와 애멸구로부터 벼멸구를 특이적으로 구별할 수 있는 방법을 보고한다.
제안 방법
ITS2 염기서열을 참고하여 벼멸구 게놈 DNA에서만 특이적으로 증폭하도록 설계된 LAMP 프라이머 세트 4종(BPH-38, BPH-38-1, BPH-207 및 BPH-92)을 제작하고(Table 2) 실제 벼멸구 게놈 DNA에서 특이적으로 증폭효과가 있는지를 확인하였다. 먼저 Loop primer (LF, BF)가 없는 3종의 LAMP 프라이머 세트(BPH-38, BPH-38-1 및 BPH-207)에 대한 증폭여부를 검토하였다.
LAMP 프라이머 세트에 Loop primer가 포함되어 있는 경우 증폭속도가 약1/2 빨라질 수 있어 BPH-92 LAMP 프라이머 세트에서 벼멸구 게놈 DNA 0 ng, 0.1 ng, 10 ng, 및 100 ng을 각각 65℃ 조건에서 20분, 30분, 40분, 및 60분간 반응시킨 후 증폭된 결과를 형광 밝기로 비교하였다. 그 결과 반응시간을 20분과 30분만 처리한 경우는 벼멸구 게놈 DNA 0~100 ng 모두 청색광(470 nm) 조건에서 형광 빛이 육안으로 뚜렷하게 관찰되지 않았고 각각의 밝기 차이를 판단하기 어려웠다(Fig.
대상 데이터
본 연구에 사용된 멸구과(겨풀멸구, 벼멸구붙이, 북방멸구, 사슴멸구 및 일본멸구) 5종은 벼 예찰포에 설치된 유인등에 채집되어 국립농업과학원에서 형태 동정을 하였다(채집지역과 채집연도 미상). 벼멸구, 애멸구 및 흰등멸구 3종은 논에서 흡충기로 채집하여 국립농업과학원 곤충사육실에서 벼의 어린모를 먹이로 공급하면서 누대사육 중인 것을 사용하였다. 미국 선녀벌레(M.
본 연구에 사용된 멸구과(겨풀멸구, 벼멸구붙이, 북방멸구, 사슴멸구 및 일본멸구) 5종은 벼 예찰포에 설치된 유인등에 채집되어 국립농업과학원에서 형태 동정을 하였다(채집지역과 채집연도 미상). 벼멸구, 애멸구 및 흰등멸구 3종은 논에서 흡충기로 채집하여 국립농업과학원 곤충사육실에서 벼의 어린모를 먹이로 공급하면서 누대사육 중인 것을 사용하였다.
데이터처리
, 2013)에 내장된 CLUSTAL W 알고리즘의 기본설정 조건으로 multiple sequence alignment를 수행하였다. 이 결과는 MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013)을 통해 각 종(species) 간 또는 종(species) 내 염기서열차이분석 (Mean distance)과 Neighbor-Joining 방법으로 분자계통수 분석(Phylogeny)을 수행하였다. 미국선녀벌레와 톱다리개미허리노린재는 군외군(outgroup)으로 사용하였다.
이론/모형
LAMP 반응은 DNA Amplification Kit (Eiken Chemical Co., LTD., Japan)를 구입하여 제조사의 사용방법에 따라 수행하였다. PCR tube(200 µl)에 2 × Reaction Mix 12.
멸구류 8종(species)과 미국선녀벌레로부터 게놈 DNA 추출을 위해 Seo et al. (2014)의 방법을 사용하였다. 1.
성능/효과
2) 벼멸구의 ITS2 염기서열을 토대로 다른 멸구류들과 차이가 나는 부분을 포함하여 벼멸구 특이 LAMP 프라이머 세트 4개 후보를 설계하였다. 3) 벼멸구, 애멸구 및 흰등멸구의 게놈 DNA를 이용하여 벼멸구 특이 LAMP 프라이머 세트 후보의 증폭 효과를 검정하였는데, 4개 모두 벼멸구 특이성을 보였으나 증폭 효율은 BPH-92가 가장 좋았다.4) BPH-92 LAMP 프라이머 세트의 성공적인 증폭 효과 확인을 위해서는 65℃에서 최소한 벼멸구 게놈 DNA 10 ng으로 40분간 또는 0.
3) 벼멸구, 애멸구 및 흰등멸구의 게놈 DNA를 이용하여 벼멸구 특이 LAMP 프라이머 세트 후보의 증폭 효과를 검정하였는데, 4개 모두 벼멸구 특이성을 보였으나 증폭 효율은 BPH-92가 가장 좋았다.4) BPH-92 LAMP 프라이머 세트의 성공적인 증폭 효과 확인을 위해서는 65℃에서 최소한 벼멸구 게놈 DNA 10 ng으로 40분간 또는 0.1 ng으로 60분간 LAMP 반응이 요구된다.
지금까지의 결과를 정리하면, 1) 벼멸구의 ITS2 영역 DNA 염기서열 정보는 다른 멸구과(Delphacidae) 멸구류들과 염기서열 차이가 유의하게 구별되었다. 2) 벼멸구의 ITS2 염기서열을 토대로 다른 멸구류들과 차이가 나는 부분을 포함하여 벼멸구 특이 LAMP 프라이머 세트 4개 후보를 설계하였다.
후속연구
bakeri) 게놈 DNA에서의 증폭여부가 추가로 검토되어야 한다. 본 연구에서 설계한 LAMP 프라이머 세트 BPH-92가 겨풀멸구와 벼멸구붙이의 게놈 DNA에서 증폭반응을 일으키지 않는다면 멸구과(Delphacidae)의 다른 멸구류에서도 증폭반응이 일어날 가능성이 훨씬 낮기 때문에 현장에서 벼멸구를 특이적으로 구별하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
앞으로 본 연구에서 제작된 ITS2 영역 기반 LAMP 프라이머 세트 BPH-92가 논에 설치된 유인등 트랩에 포획된 멸구류 중에서 벼멸구를 특이적으로 검출하는데 현장에서 활용되기 위해서는 벼멸구와 염기서열이 가장 유사한 같은 속(Genus)의 겨풀멸구(N. muiri)와 벼멸구붙이(N. bakeri) 게놈 DNA에서의 증폭여부가 추가로 검토되어야 한다. 본 연구에서 설계한 LAMP 프라이머 세트 BPH-92가 겨풀멸구와 벼멸구붙이의 게놈 DNA에서 증폭반응을 일으키지 않는다면 멸구과(Delphacidae)의 다른 멸구류에서도 증폭반응이 일어날 가능성이 훨씬 낮기 때문에 현장에서 벼멸구를 특이적으로 구별하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
벼멸구란?
벼멸구 [Nilaparvata lugens (Stål)]는 노린재목 멸구과(Hemiptera: Delphacidae)에 속하는 몸 길이 5 mm 이하의 소형 곤충으로 주로 벼(Oryza sativa)가 재배되는 아시아와 오세아니아 지역에 분포한다(Wilson and Claridge, 1991). 우리나라에서 벼멸구가 월동하지 못하고 해마다 6월 중순부터 7월 하순 사이에 장시형 성충이 기류를 타고 비래 해와 생육중인 벼에 피해를 주고 있다(Uhm et al.
벼멸구는 어떤 지역에 분포하는가?
벼멸구 [Nilaparvata lugens (Stål)]는 노린재목 멸구과(Hemiptera: Delphacidae)에 속하는 몸 길이 5 mm 이하의 소형 곤충으로 주로 벼(Oryza sativa)가 재배되는 아시아와 오세아니아 지역에 분포한다(Wilson and Claridge, 1991). 우리나라에서 벼멸구가 월동하지 못하고 해마다 6월 중순부터 7월 하순 사이에 장시형 성충이 기류를 타고 비래 해와 생육중인 벼에 피해를 주고 있다(Uhm et al.
LF, BF가 없는 3종의 LAMP 프라이머 세트는 소량의 벼멸구 게놈 DNA에서 활용하기 어려운 이유는?
먼저 Loop primer (LF, BF)가 없는 3종의 LAMP 프라이머 세트(BPH-38, BPH-38-1 및 BPH-207)에 대한 증폭여부를검토하였다. 벼멸구, 흰등멸구 및 애멸구 3종의 게놈 DNA를 각각의 LAMP 프라이머 세트와 65℃ 조건에서 60분간 반응시킨 후 아가로스겔에 전기영동 한 결과, 벼멸구 샘플에서만 특이적으로 사다리처럼 다양한 길이의 밴드들이 관찰되었으며 밴드의 밝기로 보아 LAMP 프라이머 세트별 증폭 정도는 BPH-207 > BPH-38-1 > BPH-38 순이었다(Fig. 3). 이때 각 LAMP 프라이머 세트별 사용된 벼멸구, 애멸구 및 흰등멸구 게놈 DNA 양은 각각 360 ng, 390 ng, 및 400 ng이었다. 그러나 벼멸구 DNA 양을 200 ng부터 0.2 ng까지 희석하여 위와 동일한 방법으로 LAMP 프라이머 세트 BPH-207에 적용하였을 때 아가로스겔에서 확인할 수 있을 정도로 증폭되지 않았다(data not shown). 따라서 Loop primer (LF, BF)가 없는 3종의 LAMP 프라이머 세트(BPH-38, BPH-38-1 및 BPH-207)는 소량의 벼멸구 게놈 DNA (e.
참고문헌 (17)
Bonizzoni, M., Afrane, Y., Yan, G., 2009. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid identification of Anopheles gambiae and Anopheles arabiensis mosquitoes. Am. J. Trop. Med. Hyg. 81, 1030-1034.
Cabauatan, P.Q., Cabunagan, R.C., Choi, I.R., 2009. Rice viruses transmitted by the brown planthopper Nilaparvata lugens Stal, in: Heong, K.L., Hardy, B. (Eds.), Planthoppers: new threats to the sustainability of intensive rice production systems in Asia. International Rice Research Institute, Los Banos, pp. 357-368.
Dickey, A.M., Osborne, L.S., Shatters, Jr., R.G., Mckenzie, C.L., 2013. Identification of the Meam1 cryptic species of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) by loop-mediated isothermal amplification. Fla. Entomol. 96, 756-764.
Kim, H.Y., Park, C.G., Han, M.W., Uhm, K.B., Woo, K.S., 2002. Development of a hypertext-based polychotomous key for the identification of planthoppers caught by light trap in paddy fields. Korean J. Appl. Entomol. 41, 75-83.
Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T., 2013. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): recent progress in research and development. J. Infect. Chemother. 19, 404-411.
Njiru, Z.K., 2012. Loop-mediated isothermal amplification technology: towards point of care diagnostics. PLoS Negl. Trop. Dis. 6(6): e1572, doi:10.1371/journal.pntd.0001572.
Seo, B.Y., Jung, J.K., Park, K.J., Cho, J.R., Lee, G.S., Jung, C.R., 2014. Molecular identification of Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) egg parasitoids of the Asian corn borer Ostrinia furnacalis, based on ITS2 rDNA sequence analysis. Korean J. Appl. Entomol. 53, 247-260.
Seo, B.Y., Kwon, Y.-H., Jung, J.K., Kim, G.-H., 2009. Electrical penetration graphic waveforms in relation to the actual positions of the stylet tips of Nilaparvata lugens in rice tissue. J. Asia-Pac. Entomol. 12, 89-95.
Uhm, K.B., Park, J.S., Lee, Y.I., Choi, K.M., Lee, M.H., Lee, J.O., 1988. Relationship between some weather conditions and immigration of the brown planthopper, Nilaparvata lugens Stal. Korean J. Appl. Entomol. 27, 200-210.
White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal genes for phylogenetics, in: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. (Eds.), PCR protocols, a guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, California, pp. 315-322.
Wilson, M.R., Claridge, M.F., 1991. Handbook for the identification of leafhoppers and planthoppers of rice. CAB International, Wallingford, UK.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.