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문제 정의
- 본 연구에서는 천연물을 이용하여 AP-1 활성 억제제를 찾기 위하여 다양한 천연물의 지표성분을 대상으로 세포독성과 AP-1 전사인자 억제능 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 천연물 물질은행(NP BANK, Gyeongsan, Korea)으로부터 분양받은 천연추출물의 지표성분 38종의 분자량 및 농도를 Table 1에 정리하였다. 각 지표성분의 AP-1 전사 인자의 활성은 Firefly luciferase(Luciferase assay system, Promega korea Ltd., Seoul, Korea)을 사용하여 측정하였다.
- 천연물의 지표성분으로부터 연구 및 개발되고 있는 암 예방 및 치료제는 새로운 블루오션으로 대두되고 있으며 그에 따른 시장의 규모도 증가하고 있는 추세이다. 본 연구에서는 PMA 자극을 통해 암을 유발하는 표적 유전자인 신장세포의 AP-1 reporter gene을 이용하여 천연물 지표성분 38종의 세포 독성과 AP-1 luciferase 활성을 50% 억제하는 농도(Inhibitory concentration 50 : IC 50)를 측정하여 Table 2에 나타내었다. Bufonis Venenum(섬수), Saururus chinensis(삼백초), Arctium minus(우방자), Anthriscus sylvestris(전호), Angelica decursiva(아삼), Lnula helenium(토목향), Broussonetia papyrifera(꾸지나무) 추출물의 지표성분에서는 3 μM 이하에서 AP-1 활성 억제율을 보이고 있다.
- Louis, MO, USA)를 사용하였다. 세포 성장은 CellTiterGlo luminescent cell viability kit(Promega, WI, USA)을 이용하여 측정하였다[6]. 상기 방법은 세포 내 luciferase 반응을 통한 ATP 측정을 기반으로 하며 측정되는 ATP의 양은 생존 세포의 수와 비례한다.
- 그 후, HEK293 cell은 PMA 단독 또는 천연물 지표성분과 혼합하여 24시간 동안 노출시켰다. 세포 용해 후, 최종 Luciferase 활성은 Luminometer를 이용하여 측정하였다.
- 세포에 안전하면서 AP-1 활성억제 농도를 보인 지표 물질에 대하여 0.39 μM∼6.25 μM의 농도 구간에서 세부적인 실험을 진행하여 Fig. 1에 정리하였다.
대상 데이터
- HEK293 cell은 96-well plates(1×104 cells /well)에 접종하였다. 72시간 후, 세포들에 천연 지표물질을 농도의 존적으로 처리하였고 대조군으로는 Dimethyl Sulfoxide (DMSO, Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 세포 성장은 CellTiterGlo luminescent cell viability kit(Promega, WI, USA)을 이용하여 측정하였다[6].
- 본 실험에서 사용한 HEK293 cell(인간배아 신장세포) 은 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, HyClone, GE Healthcare Life Science, Utah, USA)에 1%의 penicillin /streptomycin(HyClone, GE Healthcare Life Science, Utah, USA)이 포함된 DMEM(Welgene Inc, Gyeongsan, Korea) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 HEK293 cell(인간배아 신장세포) 은 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, HyClone, GE Healthcare Life Science, Utah, USA)에 1%의 penicillin /streptomycin(HyClone, GE Healthcare Life Science, Utah, USA)이 포함된 DMEM(Welgene Inc, Gyeongsan, Korea) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- 천연물 물질은행(NP BANK, Gyeongsan, Korea)으로부터 분양받은 천연추출물의 지표성분 38종의 분자량 및 농도를 Table 1에 정리하였다. 각 지표성분의 AP-1 전사 인자의 활성은 Firefly luciferase(Luciferase assay system, Promega korea Ltd.
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS software package(Version 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석을 하고 Duncan의 다중범위검정(p<0.05) 방법으로 사후 검정하였다.
이론/모형
- 세포 생존능을 간접적으로 반영하는 발광 정도는 LuBi luminometer(Berthold TEC GmbH & Co., TN, USA)로 측정하였다.
성능/효과
- Bufonis Venenum(섬수), Saururus chinensis(삼백초), Arctium minus(우방자), Anthriscus sylvestris(전호), Angelica decursiva(아삼), Lnula helenium(토목향), Broussonetia papyrifera(꾸지나무) 추출물의 지표성분에서는 3 μM 이하에서 AP-1 활성 억제율을 보이고 있다.
- 세포독성 실험 결과에서는 천연물 지표성분 대부분은 50 μM이상의 안전성을 보이며 강한 항암효과가 있는 것으로 알려진 Saururus chinensis(삼백초)의 지표성분인 Manassantin A, B와 Arctium minus(우방자)의 지표성분인 Arctigenin는 AP-1 활성 억제농도보다 15배 높은 세포독성을 나타내어 활용가치가 높을 것으로 판단된다 [12].
- 실험을 진행한 네 종류의 지표물질(Arctiin, Arctigenin, Manassantin, Manassantin B)에서 모두 양성 대조군에 비교하여 농도가 증가함에 따라 유의적(p<0.05)으로 AP-1 luciferase 활성이 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 암 유발 물질인 PMA에 의해 활성화 되는 AP-1 유전자의 활성억제를 확인하기 위해 38종의 대표적인 천연물의 지표성분에 대한 AP-1 luciferase 활성억제와 세포독성 평가를 수행한 결과 삼백초, 우방자의 지표성분인 Arctiin, Arctigenin, Manassatin A, B는 세포독성은 적으면서도 낮은 농도에서 AP-1 Luciferase 활성 억제 효과를 나타내어 암 예방 연구 및 치료제로서의 사용가능성을 시사하였다.
- 지표성분인 Manassantin A, B의 AP-1 활성억제는 2 μM 이하의 농도에서 진행되어 세포독성과 비교하여 15배 이상의 선택성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
- 특히 두꺼비의 독선분비물인 두꺼비 피부표면의 혹과 귀밑샘에 분포하는 독성분인 Bufonis Venenum(섬수)의 지표성분인 Bufogenin과 Cinobufagin 은 2 μM 이하의 농도에서 AP-1 활성 억제율을 나타내고 있으나 세포독성이 있음을 알 수가 있다.
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