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문제 정의
- 본 연구에서는 Klebsiella pneumonia 균주를 선택하여 암모니아 제거 효율에 대한 연구를 진행하였다. 이 균주는 그람 음성균으로서 선별적 호기성 균주로 알려져 있으며, 특히 토양에서 질소를 고정화 및 암모니아를 흡수하는데 관여하는 균주로 알려져 있다[20].
- 이 균주는 그람 음성균으로서 선별적 호기성 균주로 알려져 있으며, 특히 토양에서 질소를 고정화 및 암모니아를 흡수하는데 관여하는 균주로 알려져 있다[20]. 이러한 특성을 바탕으로 본 논문에서는 제올라이트의 흡착능과 미생물의 생물 학적 메커니즘을 이용한 폐수 내의 암모늄이온 제거효율을 비교하고 이 두 가지의 시너지 효과를 이용한 화학-생물학적 공정인 제올라이트 미생물 고정화 반응을 통하여 최종적인 암모니아 제거 효율에 대하여 연구하였다.
제안 방법
- pneumoniae를 앞서 서술한 방법으로 각각 제올라이트 흡착제에 고정화 시킨 후 암모늄 이온의 제거효율을 측정하였다. K. pneumonia 고정화를 통한 실험의 경우 세포 활성 및 제올라이트 활성 조건을 고려하여 37, 25 ℃의 두 가지 온도 조건에서 그 효율을 측정하였다.
- K. pneumoniae를 앞서 서술한 방법으로 각각 제올라이트 흡착제에 고정화 시킨 후 암모늄 이온의 제거효율을 측정하였다. K.
- K. pneumoniae의 제거 효율을 상대적으로 알아보기 위해 대조군으로 대장균인 Escherichia coli BL21 (DE3) 및 Escherichia coli DH5α 와 비교하였다(Figure 1).
- 제올라이트는 사용 전 증류수에 3번 씻어 110 ℃에서 24 h 동안 말린후 300 ℃에서 4 h 동안 가열해 내부의 가스를 제거하였다. 각 흡착제의 흡착능을 비교하기 위해 250 mL 플라스크에 암모늄이온 100ppm이 포함된 기본 배양액 100 mL과 각 흡착제를 10g씩 넣고 200 rpm 에서 제거효율을 비교하였다.
- 6 g의 glucose 농도(6 g/L) 고정하고 암모늄 이온을 각각 100, 150, 200, 250 ppm으로 변화하여 준비하였다. 그 다음 LB 복합배지에서 배양한 K. pneumoniae를 1 mL (1%) 접종한 후 암모늄 이온의 제거 효율을 비교하였다(Figure 3). 그 흡수된 암모니아의 절대량을 계산해 보면 각기 다른 네 경우에 공통 적으로 약 90 mg-N/L (0.
- 말린 제올라 이트를 250 mL 플라스크에 각각 넣고 LB 복합배지 100 mL와 배양한 미생물 1 mL (1%)를 접종하여 200 rpm, 37 ℃에서 24 h 동안 고정시켰다. 그 다음 미생물 고정화 제올라이트를 증류수에 3회 씻고 암모늄 이온이 포함된 기본 배양액(100 ppm at 100 mL)을 넣고 그 제거효율을 비교하였다[22].
- 기본 배양액의 농도에 변화를 주어 실험을 진행해보았다. 암모늄이온 100 ppm을 포함한 0, 0.
- 대조군인 Escherichia coli DH5α 균주의 경우 상대적으로 암모니아 흡수 효율이 상당히 낮게 측정되었는데 이는 균주의 질소 에너지원 대사과정이 활성화되지 않았기 때문으로 생각된다[24,25]. 다음으로 K. pneumoniae의 효율적인 흡수 및 제거 특성을 알아보기 위하여 탄소원으로 사용한 Glucose의 농도, 암모늄이온의 농도, 그리고 기본 배양액의 농도을 조절하며 실험을 진행하였다.
- 동일한 농도의 기본 배양액 100 mL에 0.6 g의 glucose 농도(6 g/L) 고정하고 암모늄 이온을 각각 100, 150, 200, 250 ppm으로 변화하여 준비하였다. 그 다음 LB 복합배지에서 배양한 K.
- 동일한 농도의 기본배양액 100 mL (암모늄이온 100 ppm)에 glucose를 각각 0, 0.3, 0.6, 1.2 g씩 투입하고 LB 복합배지에서 배양한 K. pneumoniae를 1 mL (1%)만큼 접종한 후 암모늄 이온의 제거 효율을 비교하였다(Figure 2). Glucose를 넣지 않은 경우 세포의 생장은 이루어지지 않기 때문에 암모늄 이온의 흡수가 거의 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
- pneumoniae의 경우 항생제는 ampicillin을 사용하였다. 먼저 K. pneumoniae의 암모늄이온 제거 효율 측정은 배양된 미생물을 암모늄이온이 포함된 기본 배양액 100 mL에 1 mL (1%)만큼 접종하고 2 h 간격으로 샘플링 후 상등액을 분석하였다.
- 미생물을 고정화 하기 위하여 상용 제올라이트 흡착제의 암모늄 이온 제거 효율을 비교하였다. 물리적인 흡착능은 온도의 영향을 받기 때문에 각각 37 ℃ 및 25 ℃에서 암모늄 이온 제거 효율을 비교하였다(Figure 5). 그 결과 37 ℃에서 상용 제올라이트 A-3, A-4, 5A가 각각 66.
- 미생물을 고정화 하기 위하여 상용 제올라이트 흡착제의 암모늄 이온 제거 효율을 비교하였다. 물리적인 흡착능은 온도의 영향을 받기 때문에 각각 37 ℃ 및 25 ℃에서 암모늄 이온 제거 효율을 비교하였다(Figure 5).
- 미생물의 생육도는 600 nm의 파장에서 spectrophotometer (UV-VIS, Biotek epoch, USA)로 OD를 측정하여 미생물의 성장곡선을 얻었다.
- 기본 배양액의 농도에 변화를 주어 실험을 진행해보았다. 암모늄이온 100 ppm을 포함한 0, 0.5, 1, 2, 4배의 배율인 기본 배양액을 만들고 암모늄이온 제거실험을 진행하였다. 농도에 따라 생장속도와 제거 효율(Figure 4)에 다소 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- 제올라이트 및 고정화 제올라이트의 구성 성분과 표면 형태 분석은 energy-dispersive X-ray spectroscopy와 scanning electron microscopy 를 이용하였다(SEM-EDS, JEOL JSM-6700F, Japan).
- 폐수 중 독성 물질인 암모늄 이온을 효과적으로 제거하기 위해 미생물과 제올라이트를 이용한 공정을 설계하고 각 방법에 따른 성능을 테스트하였다. 제올라이트 중 가장 효율이 좋았던 것은 5A로, 25 ℃ 에서 1.
대상 데이터
- Chemical (Japan), Zeolite 5A (2.36-4.72 mm)는 지심테크(Korea), 활성탄 펠렛은 가야활성탄소(Korea)에서 구입한 제품을 사용하였다.
- 미생물은 KCTC 생물자원센터에서 분양한 Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae를 사용하였다.
- 폐수 중의 암모늄이온의 제거 효율을 측정하기 위해 다음과 같은 조성의 기본 배양액을 사용하였다. 증류수 100 mL 기준 성분은 NaCl 0.
- 합성 제올라이트의 경우 A-3, A-4, 5A 세 종류와 활성탄 펠렛을 추가로 이용하였다. 제올라이트 A-3, A-4 (1.
이론/모형
- 암모늄이온의 농도는 시간별로 샘플을 채취해 원심분리기로 상등 액을 분리한 후 salicylate method를 통해 650 nm의 파장에서 spectrophotometer (UV-VIS, Biotek epoch, USA)로 분석하였다[23]. 암모니아 제거효율은 다음 식으로 계산하였다(Eq.
성능/효과
- 특히 배양 과정에서 암모늄 이온이 미량(< 1%) 증가하는 것을 확인하였으나 이는 세포 사멸로 인하여 방출되는 암모늄 이온으로 판단된다. 결론적으로 0.3 g에서 90%, 0.6 g에서 97.2%, 1.2 g에서 93.1% 제거 효율을 측정할 수 있었으나 glucose 농도 변화와 상관없이 모든 경우 배양 후 10 h 이후 90~98% 수준으로 제거 효율이 포화되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 암모니아 형태의 질소원의 대사가 세포의 탄소원에 영향을 받기 때문이며, 이 경우 glucose 탄소원의 농도가 포화됨에 따라 암모니아 대사도 평형 상태에 도달한 것으로 판단된다[26,27].
- 물리적인 흡착능은 온도의 영향을 받기 때문에 각각 37 ℃ 및 25 ℃에서 암모늄 이온 제거 효율을 비교하였다(Figure 5). 그 결과 37 ℃에서 상용 제올라이트 A-3, A-4, 5A가 각각 66.2, 75.2, 74.0%의 제거율을 보였고(Figure 5-A), 25 ℃에서는 각각 65.8, 75.4, 81.4%의 제거율을 보였다. 5A의 경우 37 ℃보다 25 ℃ 에서 제거효율이 약 5~10% 증가하였으며, A-3와 A-4는 온도 변화에 따른 암모늄 이온 제거 효율을 관찰할 수 없었다.
- Mg2+ , Ca2+ 과 같은 금속 이온이 세포의 활성과 생장, 그리고 부착에 영향을 미친다고 보고되어 있다[28,29]. 또한 25 ℃에 서의 제거 효율이 높았던 제올라이트 5A의 특성과는 반대로 37 ℃에서 제거 효율이 높아진 것은 고정화 제올라이트가 제올라이트의 특성 보다 미생물의 제거 특성을 따른다는 것을 뒷받침해준다. 또한 절대적인 제거량을 보면 공통적으로 4 h까지는 제거가 거의 되지 않는 모습을 보이다가 4~6 h 사이에 급격히 제거되는 모습을 보인다.
- EDS로 분석한 제올라이트 5A와 미생물 고정화 제올라이트의 성분 비는 다음과 같으며 세포 고정화 이후 제올라이트의 원소 성분비는 크게 변화하지 않았음을 확인할 수 있었다(Table 2). 또한 미생물 고정화 제올라이트는 제올라이트의 특징인 빠른 흡착 성능을 잃는 대신 미생물의 특징인 높은 제거율을 보강할 수 있었다. 제올라이트는 미세 다공질의 구조를 갖추고 있지만, 미생물 고정화 제올라이트는 미생물의 부착으로 미세공이 많이 줄어들었기 때문인 것으로 보인다(Figure 7).
- 6%의 제거효율을 보였다. 세 균주의 경우 모두 암모니아 투입 후 4 h까지 암모니아 흡수 혹은 제거에 대한 효과가 미미하 나, 배양 후 6 h 이후 급격하게 증가하다 12 h에 포화되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 세포 생장이 포화상태 이후 질소원인 암모늄 이온이 흡수되지 않다가 이후 에너지 합성 경로 활성화로 인하여 급격하게 증가하는 것으로 해석하였다.
- 실험 결과 K. pneumoniae가 93.5%, DH5 α가 38%, BL21이 88.6%의 제거효율을 보였다.
- 또한 절대적인 제거량을 보면 공통적으로 4 h까지는 제거가 거의 되지 않는 모습을 보이다가 4~6 h 사이에 급격히 제거되는 모습을 보인다. 이는 비록 제올라이트의 빠른 제거 장점은 잃지만 생물학적 제거의 장점인 제거 량과 더불어 제거 시간도 다소 향상되었다는 것을 관찰할 수 있었다.
- pneumonia의 고정화 효율이 가장 높았기 때문인 것으로 보여진다. 제올라이트 5A의 구성 성분을 측정한 결과 제올라이트 5A에서는 다른 제올라이트와 달리 Mg2+ 및 Ca2+ 이 많이 포함되어 있는 것을 확인할수 있었다(Table 1). Mg2+ , Ca2+ 과 같은 금속 이온이 세포의 활성과 생장, 그리고 부착에 영향을 미친다고 보고되어 있다[28,29].
- 4%의 제거율을 보였다. 제올라이트의 경우 모든 경우에서 2 h 이내에 약 60%의 제거 효율을 나타내며 절대적인 제거량 보다 급속 제거에 효과적임을 알 수 있었다. 미생물의 경우 약 97%의 제거효율을 보이나 배양액의 성분비에 따라 그 속도에 차이를 보였다.
- 농도에 따라 생장속도와 제거 효율(Figure 4)에 다소 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 탄소 에너지원을 포함하는 기본 배양액이 없을 경우 암모늄이온의 제거는 전혀 이루어지지 않았으며, 다양한 희석 배수로 진행한 실험군들에서 배양 후 12 h 이후 95~97%의 효율을 확인할 수 있었다. 희석 배수별 실험군의 각 효율을 비교할 경우 1배율과 2배율의 기본배양액의 차이는 상당히 근소하게 측정되었으며 4배율로 고농축되었을 때 오히려 세포 생장 속도가 감소하고 암모니아 흡수 및 제거 속도가 현격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 탄소 에너지원을 포함하는 기본 배양액이 없을 경우 암모늄이온의 제거는 전혀 이루어지지 않았으며, 다양한 희석 배수로 진행한 실험군들에서 배양 후 12 h 이후 95~97%의 효율을 확인할 수 있었다. 희석 배수별 실험군의 각 효율을 비교할 경우 1배율과 2배율의 기본배양액의 차이는 상당히 근소하게 측정되었으며 4배율로 고농축되었을 때 오히려 세포 생장 속도가 감소하고 암모니아 흡수 및 제거 속도가 현격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 고농도 배양액의 경우 높은 염농도로 인하여 세포 삼투압 및 분자 확산 흡수 속도가 낮아지므로 낮아지는 세포 생작 속도로 인하여 암모니아 흡수 및 제거 속도 역시 감소하는 것으로 해석할 수 있다.
후속연구
- 이는 고농도 배양액의 경우 높은 염농도로 인하여 세포 삼투압 및 분자 확산 흡수 속도가 낮아지므로 낮아지는 세포 생작 속도로 인하여 암모니아 흡수 및 제거 속도 역시 감소하는 것으로 해석할 수 있다. 결론적으로 최적의 세포 생장 및 암모니아 제거 속도는 1배율의 기본 배양액을 사용할 때이며, 추후 세포 고정화 실험에서 이와 같은 조건으로 실험을 진행하였다.
- 5A의 경우 37 ℃보다 25 ℃ 에서 제거효율이 약 5~10% 증가하였으며, A-3와 A-4는 온도 변화에 따른 암모늄 이온 제거 효율을 관찰할 수 없었다. 대조군으로 측정한 활성탄 펠렛의 경우 200 rpm의 암모늄 이온 농도에서 약 25%의 낮은 제거 효율을 관찰하였으며 추후 활성탄에 의한 암모니아 제거 연구에서 제외하였다.
- 가장 좋은 조건에서 90% 이상의 제거율에 도달하기 위해서는 약 6 h이 소요되었다. 이상적으로는 양이온 치환 제올라이트 등을 이용, 미생물을 고정화하는데 최적화하고 미생물 부착량 대비 암모늄이온 제거 효율 비교 등의 연구가 가능할 것으로 보이며 암모늄 이온뿐 아니라 다양한 기질을 처리하는 공정에도 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
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