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문제 정의
- 본 연구는 몇 가지 생리활성을 지니고 있는 것으로 알려져 있는 어성초의 항알레르기 활성을 향상시켜 고부가가치를 가지는 기능성 식품의 원료로 활용하고자, 유산균인 Lactobacillus casei 383 및 Leuconostoc mesenteroides 4395를 이용하여 어성초를 발효하고, 5-Lipoxidase (5-LO), COX-2 및 hexosaminidase의 방출 감소량으로서 탈과립 억제효능을 측정하여 어성초의 항알러지 효능과 그 발효물의 효능 증대 여부를 조사하였다.
제안 방법
- 5 μg/ml)를 처리하여 5% CO2 incubator에서 37ºC로 12시간 배양 하였다. 각 well의 세포들을 PIPES buffer (25 mM PIPES, 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM glucose, 0.4 mM MgCl2, 0.1% BSA 그리고 1 mM CaCl2의 각 농도로 용해하여 pH 7.2로 조정)로 DNP-IgE를 제거하기 위해 2회 수세하였다. 그런 후 각 well에 PIPES buffer 500 μl와 각 추출물 10 μl 씩 로딩 후 5% CO2 incubator에서 37ºC로 60분간 반응시켰다.
- 건조 된 어성초를 분쇄기(HMF-3100S, Hanil Electric Co., Seoul, Korea)를 이용하여 마쇄하였고, 마쇄물 10 g을 취해 증류수 200 ml와 혼합하여 고온멸균기로 121ºC에서 15분간 멸균하여 4ºC에서 24시간 추출하였다.
- 그리고 RBL-2H3 세포를 열에 불활성화된 10% (v/v) Fetal Bovine Serum (FBS), 100 units/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 2 mM glutamine 그리고 1 mM sodium pyruvate 를 포함한 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 에 현탁 시켜 사용하였다.
- 멸균한 추출물에 배양된 Lactobacillus casei 383, Leuconostoc mesenteroides 4395를 각각 접종하여, 발효온도 25, 30, 35 및 40ºC에서 5일간 발효한 발효액을 각각 취하여 여과지(Whatman No.2)로 감압 여과한 후 rotary evaporator (EYELA, N-N series, Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 -25ºC에서 냉동 보관하면서 시료액으로 사용하였으며, 이 시료액을 농축한 건고물로서 각 균종, 발효온도 및 처리농도별 항알레르기활성의 측정에 사용하였다.
- 어성초(Houttuynia cordata Thunb)의 항알러지 효능을 더욱 증대시켜 고부가가치를 가지는 기능성 식품의 원료로 활용하고자, 유산균인 Leuconostoc mesenteroides 4395 및 Lactobacillus casei 383를 이용하여 어성초를 발효시키고, 5-LO, COX-2 및 RBL-2H3 cell의 탈과립 억제효능을 측정하여 발효에 의한 항알러지 효능 증대 여부를 조사하였다. 5-LO 억제 효능 측정 결과에서는 35ºC에서 Leuconostoc mesenteroides 4395에 의한 어성초 발효물의 억제율이 87.
- 추출물의 항알러지효과는 Dearman(2005)의 연구를 바탕으로 RBL-2H3 세포로부터 β-hexosaminidase의 방출량 감소율로서 탈과립 억제효능을 측정하였다.
- 탈과립(%)는 총 β-hexosaminidase activity에 대한 방출된 β-hexosaminidase 의 비율로 계산하였다.
대상 데이터
- Rat RBL-2H3 cell을 American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA )에서 분양 받았으며 5% CO2 incubator에서 37ºC에 배양하였다.
- 1 ml가 되도록 linoleic acid를 넣고 25ºC에서 3분간 20초 간격으로 235 nm에서 흡광도를 측정하여 초기 반응 속도를 구하였다. 대조군으로는 EGCG를 사용하였다.
- 어성초 추출물 발효에 사용된 균주는 부산대학교 식품 미생물 실험실에서 분리 되어 보관중인 Lactobacillus casei 383, Leuconostoc mesenteroides 4395 를 MRS broth (Difco, USA) 에서 30ºC, 6시간 종 배양 후에 30ºC, 6시간 주 배양하여 종균으로 사용하였다.
- 어성초는 경상남도 진주시에서 2014년 수확하여 건조한 것을 구입하여 4ºC에서 보관하며 사용하였다.
- 어성초의 항알레르기 활성 측정에 사용된 시약은 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Aldrich, USA), Folin-Ciocalteu Reagent (Junsei, Japan), sodium carbonate (Junsei, Japan), gallic acid (Aldrich, USA), quercetin (Aldrich, USA), 0.1N-hydrogen chloride (Junsei, Japan), pyrogallol (Aldrich, USA )를 사용하였다.
데이터처리
- Means with different letters are significantly different at p〈0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 모든 실험은 3회 반복하였으며, 분석결과의 통계처리는 mean±SD로 표시하였고, SPSS (IBM SPSS statistics ver. 21, SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)를 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA)로 분석하였고, Duncan’s multiple range test (p <0.05) 수준에서 유의차를 검정하였다.
이론/모형
- 시료의 항알러지효과를 알아보기 위해 Yoo and Jeong(2009)의 방법에 준하여 COX-2 억제 효능을 측정하였다. 즉, 각 추출물의 0.
성능/효과
- 5-LO 억제 효능 측정 결과에서는 35ºC에서 Leuconostoc mesenteroides 4395에 의한 어성초 발효물의 억제율이 87.93%, Lactobacillus sakei 383에서 87.91%로 발효하지 않은 대조군의 80.16%에 비해 더 높게 나타났고, COX-2 억제 효능에서도 대조군의 50.36%보다 Leuconostoc mesenteroides 4395, 57.10%, Lactobacillus sakei 383 발효물에서 57.69%로 더 높게 나타났다.
- 어성초 발효 추출물의 COX-2 억제 효능을 측정한 결과를 Table 3과 4에 나타내었다. L. mesenteroides 4395와 L. sakei 383로 발효한 추출물의 COX-2 억제효능을 비교한 결과, 두 균주간의 차이는 거의 없었으며, 5-LO의 결과와 동일하게 발효하지 않은 대조구보다 두 균주로 발효한 추출물의 저해효과가 다소 증가하여 발효가 기능성 증대에 조금 기여한 것으로 판단되었다. 또한, 0.
- Leuconostoc mesenteroides 4395로 발효한 추출물의 결과를 Fig. 2에서 보면, 10 μg/ml을 처리하였을 때 40ºC에서 87.38%로 가장 낮은 방출율을 나타낸 결과를 보였으나 대조군과 비교시 유의성에 차이가 없다는 결과로 나타났다.
- RBL-2H3 cell에서 IgE로 유도된 β-hexosaminidase 방출량을 100% 기준으로 한 방출율로 탈과립 억제효능을 측정한 결과에서는 Leuconostoc mesenteroides 4395로 30ºC, 35ºC 그리고 40ºC에서 발효한 추출물을 25 μg/ml을 접종 했을 경우, 각각에 대한 방출율은 88.69%, 90.23% 그리고 89.06%이었으며, 이 중에 알러지 억제에 가장 좋은 효과를 나타내는 것은 30ºC에서 발효한 추출물로 나타났다.
- 그리고 Lactobacillus sakei 383 발효 추출물을 25 μg/ml 농도로 처리했을 때에는 35ºC에서 89.86%로 방출율이 가장 낮은 것으로 나타났으나 이 역시 대조군과 비교시 유의성이 없는 것으로 나타났다.
- 그리고 발효하지 않은 대조구의 80.16%에 비해 발효물의 효능이 전반적으로 조금 높았으며 특히 35ºC에서 발효한 경우 87.93%으로 억제효능이 가장 좋은 것으로 나타났으나 양성대조구인 EGCG의 96.45%에는 미치지 못하였다.
- , 2007; Yoo and Jeong, 2009)에 비하면 어성초의 효능이 훨씬 우수한 것으로 판단되었다. 그리고 어성초를 L. sakei 383으로 발효한 추출물의 5-LO 억제 효능을 측정한 결과를 Table 2에서 보면, L. mesenteroides 4395로 발효한 결과와 거의 대동소이하여 두 균주간의 차이는 유의성이 없는 것으로 판단되었다.
- 또한, 0.1보다 농도를 높게 처리한 0.25 mg/ml에서 저해효과가 높았으나 그 차이가 5-LO에서 나타난 차이만큼 크지 않았으며, 두 균주 모두 30ºC에서 발효 한 시료의 저해효과가 가장 높게 나타났으나, 발효물의 처리농도 보다 훨씬 낮은 0.01 mg/ml 처리한 양성대조구인 EGCG의 88.46%에 비하면 COX-2의 억제 효과는 유의성이 없는 것으로 평가되었다.
- 어성초의 항알레르기 효능을 알아보기 위한 실험 중 하나로 5-LO 억제 효능을 측정한 결과를 Table 1과 Table 2에 나타내었다. 먼저 L. mesenteroides 4395로 발효한 어성초 추출물의 5-LO 억제효능을 Table 1에서 보면, 추출물의 농도를 0.1 mg/ml 처리한 결과보다 0.25 mg/ml 농도로 처리한 경우 억제효과가 2배 이상 더 높게 나타나서 억제 효능이 농도에 거의 비례하는 것으로 추정되었다. 그리고 발효하지 않은 대조구의 80.
- 반면에 Leuconostoc mesenteroides 4395로 30ºC , 35ºC 그리고 40ºC에서 발효한 추출물을 25 μg/ml을 처리하였을 경우에는 유의성이 있는 것으로 나타났으며, 각각에 대한 방출율은 88.69%, 90.23% 그리고 89.06%이었다.
- 발효하지 않은 대조구(control)의 방출율은 10 μg/ml 처리시 110%, 25 μg/ml에서는 96.7% 수준으로 억제 효능에 대한 유의성은 없는 것으로 나타났으며, Fig. 1에 나타낸 Lactobacillus sakei 383로 발효한 추출물의 경우, 10 μg/ml로 처리했을 때 30ºC에서 97.67%로 가장 낮은 방출율을 나타냈으나 발효하지 않은 대조군과 비교했을 때 역시 유의성은 나타나지 않았다.
후속연구
- , 1990; Tinker and Wallace, 2006). 따라서 알레르기를 일으키는 leucotrienes와 prostaglandins를 생성하는 물질인 5-LO와 COX-2를 억제하는 것은 제Ⅰ형 알레르기의 예방 및 치료에 사용 할 수 있을 것으로 보인다. 이러한 알레르기의 억제 효능을 가지는 천연물로서 과일이나 채소, 약재 등을 열거하고 있으며, 그 중 하나인 어성초(Houttuynia cordata Thunb)는 삼백초과(Saururaceae)에 속하는 다년생 초본의 약초로 한국, 중국 및 일본이 원산지이며, 잎과 줄기에서 특유의 비린내가 나서 어성초라는 이름을 가지며, 또한 약모밀이라고도 불려진다.
- 06%이었으며, 이 중에 알러지 억제에 가장 좋은 효과를 나타내는 것은 30ºC에서 발효한 추출물로 나타났다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, 유산균 발효에 의하여 어성초의 항알러지 활성을 증대시켜 기능성 식품으로의 개발 가능성을 보여 주었다.
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