[논문]인간 비만세포에서 그라비올라 잎 추출물의 항알러지 효과

김대용

doi:10.12925/jkocs.2020.37.6.1764

인간 비만세포에서 그라비올라 잎 추출물의 항알러지 효과
Anti-allergic Effect of Graviola Leaf Extract in Human Mast Cells 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.37 no.6, 2020년, pp.1764 - 1772

김대용 (우석대학교 한의과대학)

초록
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본 연구는 그라비올라(Annona muricata)가 인간 비만세포(LUVA 세포)에서 immunoglobulin(Ig) E-매개 알러지 반응에 어떠한 효과를 나타내는지 확인하는데 목적이 있다. 그라비올라 잎 추출물(GLE)의 항알러지 효과를 알아보기 위해 IgE로 감작된 비만세포에 다양한 농도의 추출물을 처리하였다. 비만세포의 IgE-매개 탈과립 실험 결과, GLE가 LUVA 세포에서 histamine, β-hexosaminidase, TNF-α, IL-4 및 IL-6의 방출을 유의하게 억제하였다. 또한 GLE는 IgE 유도에 의한 Lyn과 Syk의 인산화를 억제하였고 그 하위 경로에 있는 MAPK의 활성을 억제하였다. 이상의 결과는 GLE가 비만세포 활성화 및 알러지 반응을 억제할 수 있음을 보여주고, 이는 GLE가 항알러지 효과를 통하여 기능성 화장품 소재로서의 활용이 가능함을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study is aimed at determining whether graviola (Annona muricata) beneficially influences immunoglobulin (Ig) E-mediated allergic reactions in human mast cells (LUVA cells). To examine the anti-allergic effect of graviola leaf extract (GLE), we treated antigen/IgE sensitized mast cells with extracts of various concentrations. In this study, the results of the in vitro model of IgE-mediated mast cell degranulation showed that GLE significantly inhibited the release of histamine, β-hexosaminidase, TNF-α, IL-4 and IL-6 in LUVA cells. Pretreatment with GLE suppressed the phosphorylation of antigen-induced Lyn and Syk, thus suppressing the downstream MAPKs pathways. The above results indicate GLE could suppress mast cell activation and allergic responses. Accordingly, it can be supported that GLE has the potential to be used as functional cosmetic material.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. The effect of GLE on cell viability. LUVA cells were seeded at a density of 5 × 10⁵ cells per well (96-well plate) and MTT assay was conducted with various concentrations of GLE.
그림 Fig. 2. Effect of GLE on degranulation. For mast cell degranulation, anti-DNP IgE (30 ng/mL)-sensitized LUVA cells were pretreated with or without GLE and then challenged with DNP-HSA (10 μg/mL). Histamine and β-hexosaminidase levels were detected using ELISA. Graph data represent the ± SD of 3 independent experiments. *p<0.05 compared with the DNP-HSA-challenged group.
그림 Fig. 3. Effect of GLE on secretion of inflammatory cytokines. Anti-DNP IgE-sensitized LUVA cells were pretreated with or without GLE and then challenged with DNP-HSA. The secretion of inflammatory cytokines was measured by ELISA. Graph data represent the ± SD of 3 independent experiments. *p<0.05 compared with the DNP-HSA-challenged group.
그림 Fig. 4. Effect of GLE on the phosphorylation of Lyn and Syk in mast cells. Anti-DNP IgE-sensitized LUVA cells were pretreated with or without GLE and then challenged with DNP-HSA. The proteins derived from the LUVA cell lysates were subjected to immunoblot analysis to detect phosphorylated forms of Lyn and Syk. Representative images are shown from 3 independent experiments.
그림 Fig. 5. Effect of GLE on the phosphorylation of MAP kinases in mast cells. Anti-DNP IgE-sensitized LUVA cells were pretreated with or without GLE and then challenged with DNP-HSA. The proteins derived from the LUVA cell lysates were subjected to immunoblot analysis to detect phosphorylated forms of MAP kinases. Representative images are shown from 3 independent experiments.

AI 본문요약
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문제 정의

연구를 수행하였다. IgE로 감작한 인간 비만세포에서 다양한 알러지 매개체들과 신호전달 분자들이 그라비올라 잎 추출물에 의하여 어떠한 영향을 받는지 확인하고자 하였다. 따라서 본 연구는 이러한 결과를 통하여, 알러지성 피부염과 같은 염증성 피부질환에 효과를 가지고 있는 천연물 소재로서 그라비올라 잎 추출물의 가능성을 확인하고, 나아가 기능성 화장품 소재로서의 가치를 밝히고자 하였다.
이러한 경로는 알러지 염증을 유발하는 매개체의 분비에 필수적이다[1]. 그러므로 본 연구에서는 비만세포에서 IgE 매개 염증 신호전달에 GLE가 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 우선 GLE의 비만세포에 대한 세포독성을 파악하기 위하여 다양한 농도의 GLE를비만세포에 처리하였다.
그러므로 본 연구에서는 항원 자극에 의해 활성화된 비만세포에서 Lyn/Syk의 활성이 GLE에의해 조절되는지 살펴보았다. 항원에 의해 활성화된 비만세포에서 Lyn/Syk의 인산화는 증가하였으며 이것은 GLE에 의하여 억제되었다(Fig.
하지만 알러지 반응에서의 효능은 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구는 그라비올라잎 추출물의 인간 비만세포에서의 항알러지 효능을 알아보기 위해, 인간 비만세포주인 LUVA 세포에 IgE로 자극한 다음, 그라비올라 잎 추출물을 처리하고 알러지 매개체인 histamine, β -hexosaminidase, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-4 및 IL-6의 발현을 측정하였다. 또한 신호전달 분자인 Lyn/Syk, MAPKs의 인산화 활성을 측정하였다.
IgE로 감작한 인간 비만세포에서 다양한 알러지 매개체들과 신호전달 분자들이 그라비올라 잎 추출물에 의하여 어떠한 영향을 받는지 확인하고자 하였다. 따라서 본 연구는 이러한 결과를 통하여, 알러지성 피부염과 같은 염증성 피부질환에 효과를 가지고 있는 천연물 소재로서 그라비올라 잎 추출물의 가능성을 확인하고, 나아가 기능성 화장품 소재로서의 가치를 밝히고자 하였다.
유용한 표적이 될 수 있다[14]. 따라서 본 연구에서는 GLE가 TNF-α, IL-4 및 IL-6의 발현에 어떤 효과를 나타내는지 실험하였다. 그 결과, GLE에 의하여 TNF-α, IL-4 및 IL-6의 발현이 현저히 감속됨을 확인하였다(Fig.
특히 histaminee알러지성 아나필락시스에서 혈관 확장, 혈관 투과성 증가, 가려움증 및 평활근 수축의 발현에 가장 중요한 것으로 알려져 있으며 IgE에 의한 비만세포 탈과립을 예방하는 전략은 알러지 질환 치료를 위한 중요한 타겟으로 연구되고 있다[2]. 따라서 본 연구에서는 GLE의 탈과립에 미치는 영향을 확인하기 위하여 histamine과 β -hexosaminidase의 분비를 측정하였다. 그 결과, GLE의 histamine과 β-hexosaminidas에 대한 분비 저해 효과가 농도 의존적으로 나타남을 확인하였다(Fig.
이러한 결과는 그라비올라 잎 추출물이 인간 비만세포에서 항알러지 효과를 가지고 있음을 보여주며, 특히, Lyn/Syk-MAPKs 경로를 억제하는 메커니즘을 규명했다는 것에 의의가 있다. 따라서 본연구는 그라비올라 잎 추출물이 항알러지 효과를 가지는 천연물 소재로 알러지성 피부염과 같은 피부질환에 기능성을 가지는 화장품 소재로 활용될 수 있는 과학적 근거를 제시하였다고 사료된다.
본 연구에서는 그라비올라 잎 추출물의 항알러지 활성을 확인하고 그 메커니즘을 밝히기 위하여 연구를 수행하였다. IgE로 감작한 인간 비만세포에서 다양한 알러지 매개체들과 신호전달 분자들이 그라비올라 잎 추출물에 의하여 어떠한 영향을 받는지 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 비만세포에서 FcεRI 매개 알러지 반응에 대한 GLE의 작용에 대한 MAPKs 경로를 밝히기 위해, MAPKs 활성화에 대한 GLE 의 효과를 실험하였다. GLE의 전처리를 통하여 비만세포에서 IgE 매개에 의해 활성화된 ERK, JNK 및 p38을 포함한 MAPKs의 인산화가 감소하였다(Fig.

제안 방법

GLE의 세포독성을 확인하기 위하여 비만세포에서의 성장 저해능을 실험하였다. LUVA 세포를 96-well plate에 5×10⁴ cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하였다.
5% skim milk로 1시간 blocking을 실시하였다. Lyn, Syk, 및 MAPKs (ERK, JNK, p38)의 단백질 발현 및 인산화는 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액 (Amersham, USA)을 이용하여 확인하였다.
그 후 배양액을 5, 000 rpm에서 원심분리하여 상층액을 수거하였다. TNF-α, IL-4, IL-6의 발현은 ELISA kit (abcam, UK)를 이용하여 측정하였다.
LUVA 세포를 24 well plate에 2×10⁶ cells/well로 배양한 후 anti-DNP IgE (30 ng/mL)로 감작하여 24시간 배양하였다. 그 후 배지를 교환하고 GLE 를 농도별로 1시간 동안 전처리하였다. 그리고 DNP-HSA (10 μg/mL)를 30분 동안 자극하고 ice bath에서 10분간 방치하여 반응을 종결시켰다.
LUVA 세포를 24 well plate에 2×10⁶ cells/well로 배양한 후 anti-DNP IgE (30 ng/mL)로 감작하여 24시간 배양하였다. 그 후 배지를 교환하고 GLE 를 농도별로 1시간 동안 전처리하였다. 그리고 DNP-HSA (10 μg/mL)를 30분 동안 자극하고 ice bath에서 10분간 방치하여 반응을 종결시켰다.
LUVA 세포를 100 mm dish에 5×10⁵ cells/mL로 분주한 후 anti-DNP IgE (30 ng/mL)로 감작하고 24시간 배양하였다. 그 후 배지를 교환하고 GLE를 농도별로 1시간 동안 전처리한 다음, DNP-HSA (10 μg/mL)를 1시간 반응시켰다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 lysis buffer (10 mM pH 7.
LUVA 세포를 96-well plate에 5×10⁴ cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하였다. 그 후, 농도별(0, 5, 10, 50, 100, 500, 1,000 μg/mL) 로 GLE를 처리한 후 같은 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후 CellTiter 96^® AQ_ueous One Solution Cell Proliferation assay kit (Promega, USA)를 이용하여 세포 독성을 확인하였다.
따라서 본 연구는 그라비올라잎 추출물의 인간 비만세포에서의 항알러지 효능을 알아보기 위해, 인간 비만세포주인 LUVA 세포에 IgE로 자극한 다음, 그라비올라 잎 추출물을 처리하고 알러지 매개체인 histamine, β -hexosaminidase, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-4 및 IL-6의 발현을 측정하였다. 또한 신호전달 분자인 Lyn/Syk, MAPKs의 인산화 활성을 측정하였다.
모든 실험은 3회 반복하여 진행하였고, mean±SD로 표시하였다. 결과는 SPSS 18.
그 후, 농도별(0, 5, 10, 50, 100, 500, 1,000 μg/mL) 로 GLE를 처리한 후 같은 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후 CellTiter 96^® AQ_ueous One Solution Cell Proliferation assay kit (Promega, USA)를 이용하여 세포 독성을 확인하였다. AQueous One Solution을 96-well plate에 20 μL 씩 첨가하여 4시간 반응시킨 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그리고 DNP-HSA (10 μg/mL)를 30분 동안 자극하고 ice bath에서 10분간 방치하여 반응을 종결시켰다. 배양액을 5,000 rpm에서 원심분리하여 상층 액을 수거하여 Histamine Elisa Kit (Abcam, UK)와 Beta-hexosaminidase ELISA kit (Cusabio, USA)를 이용하여 지표를 측정하였다.
비만세포의 활성화에 관계되어 있는 신호전달경로를 확인하기 위하여 다양한 단백질의 발현 및 인산화를 확인하였다. LUVA 세포를 100 mm dish에 5×10⁵ cells/mL로 분주한 후 anti-DNP IgE (30 ng/mL)로 감작하고 24시간 배양하였다.
알러지 반응에서 탈과립의 지표에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 histamine과 β -hexosaminidase의 분비를 확인하였다. LUVA 세포를 24 well plate에 2×10⁶ cells/well로 배양한 후 anti-DNP IgE (30 ng/mL)로 감작하여 24시간 배양하였다.
그러므로 본 연구에서는 비만세포에서 IgE 매개 염증 신호전달에 GLE가 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 우선 GLE의 비만세포에 대한 세포독성을 파악하기 위하여 다양한 농도의 GLE를비만세포에 처리하였다. 그 결과, 1000 μg/mL 에서 약간의 독성이 있음을 확인하였다(Fig.
1). 이에 본 연구에서는 1000 μg/mL 미만의 농도에서 연구를 진행하였다.
활성화된 비만세포에서 염증성 사이토카인의발현에 대한 효과를 확인하기 위하여 TNF-α, IL-4, IL-6의 발현을 측정하였다. LUVA 세포를 24 well plate에 2×10⁶ cells/well로 분주한 후 anti-DNP IgE (30 ng/mL)로 감작하여 24시간 배양하였다.

대상 데이터

구입하여 사용하였다. L-glutamine (2 mM), Pen Strep (10, 000 U/mL), Primocin (50 mg)가 첨가된 StemPro-34 SFM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂조건의 배양기에서 배양하였다.
이 과정을 3회 반복하여 실시하였으며, 추출한 시료는 감압여과기 통해 여과하였다. 감압농축기 (N-100, EYELA, Japan)로 농축한 후, 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSIN, Korea)에서 72시간 동결건조하여 분말을 제조하였고 냉동실에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 시료는 11.
그라비올라 잎 추출물(Glaviola leaf extract, GLE)은 (주)래디안에서 제공받아 실험에 사용하였다. 그라비올라 잎 300 g을 분쇄기로 잘게 갈아 900 mL의 증류수에서 60℃, 30 rpm으로 24 시간 교반하여 상층액과 침전물을 분리하였다.
인간 비만세포인 LUVA 세포는 Kerafast (MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. L-glutamine (2 mM), Pen Strep (10, 000 U/mL), Primocin (50 mg)가 첨가된 StemPro-34 SFM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂조건의 배양기에서 배양하였다.

데이터처리

, USA)으로 통계분석하였다. 통계학적인 유의성 검증은 p < 0.05에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였다.

성능/효과

효과를 실험하였다. GLE의 전처리를 통하여 비만세포에서 IgE 매개에 의해 활성화된 ERK, JNK 및 p38을 포함한 MAPKs의 인산화가 감소하였다(Fig. 5). 이전 연구에 의하며 LPS로 자극된 대식세포에서 활성화된 MAPKs의 인산화가 그라비올라 잎 추출물에 의하여 억제되는 것이 보고되었는데[11], 본 연구에서도 비만세포에 항원 자극에 의하여 증가된 MAPKs의 활성이 GLE 에 의해 억제된다는 것을 확인한 것이다.
우선 GLE의 비만세포에 대한 세포독성을 파악하기 위하여 다양한 농도의 GLE를비만세포에 처리하였다. 그 결과, 1000 μg/mL 에서 약간의 독성이 있음을 확인하였다(Fig. 1). 이에 본 연구에서는 1000 μg/mL 미만의 농도에서 연구를 진행하였다.
따라서 본 연구에서는 GLE가 TNF-α, IL-4 및 IL-6의 발현에 어떤 효과를 나타내는지 실험하였다. 그 결과, GLE에 의하여 TNF-α, IL-4 및 IL-6의 발현이 현저히 감속됨을 확인하였다(Fig. 3). 다른 연구에 의하면, 대식세포에서 LPS 자극에 의해 증가된 TNF-α와 IL-4가 그라비올라 잎 추출물에 의해서 억제됨을 확인하였고[11], 동물모델에서 자극원에 의해 증가된 IL-6가 그라비올라 잎 추출물에 의하여 감소되는 것이 밝혀졌다[17].
따라서 본 연구에서는 GLE의 탈과립에 미치는 영향을 확인하기 위하여 histamine과 β -hexosaminidase의 분비를 측정하였다. 그 결과, GLE의 histamine과 β-hexosaminidas에 대한 분비 저해 효과가 농도 의존적으로 나타남을 확인하였다(Fig. 2). 이전 연구에 의하면 동물모델에서 그라비올라 열매 추출물이 histamine의 발현을 억제시킨다는 보고가 있으나[15], 본 연구를 통하여 열매가 아닌 잎 추출물에서도 histamine 억제 효과가 있음이 확인되었다.
4). 따라서 본 연구의 결과로, GLE는 Lyn/Syk 경로를 억제하여 염증성 사이토카인의 발현을 감소시킴으로써 항알러지 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
다른 연구에 의하면, 대식세포에서 LPS 자극에 의해 증가된 TNF-α와 IL-4가 그라비올라 잎 추출물에 의해서 억제됨을 확인하였고[11], 동물모델에서 자극원에 의해 증가된 IL-6가 그라비올라 잎 추출물에 의하여 감소되는 것이 밝혀졌다[17]. 본 연구를 통하여 비만세포에서 IgE 자극에 의해 증가된염증성 사이토카인의 발현이 GLE에 의하여 억제되고 이는 항알러지 효과로 이어질 수 있을 것으로 판단된다.
이러한 결과는 그라비올라 잎 추출물이 인간 비만세포에서 항알러지 효과를 가지고 있음을 보여주며, 특히, Lyn/Syk-MAPKs 경로를 억제하는 메커니즘을 규명했다는 것에 의의가 있다. 따라서 본연구는 그라비올라 잎 추출물이 항알러지 효과를 가지는 천연물 소재로 알러지성 피부염과 같은 피부질환에 기능성을 가지는 화장품 소재로 활용될 수 있는 과학적 근거를 제시하였다고 사료된다.
이러한 연구결과를 통하여 그라비올라 잎 추출물이 활성화된 비만세포의 탈과립을 억제하고 Lyn/Syk, MAPKs 경로를 저해하여 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 그라비올라 잎 추출물이 인간 비만세포에서 항알러지 효과를 가지고 있음을 보여주며, 특히, Lyn/Syk-MAPKs 경로를 억제하는 메커니즘을 규명했다는 것에 의의가 있다.
이전 연구에 의하면 동물모델에서 그라비올라 열매 추출물이 histamine의 발현을 억제시킨다는 보고가 있으나[15], 본 연구를 통하여 열매가 아닌 잎 추출물에서도 histamine 억제 효과가 있음이 확인되었다. 이상의 결과로 GLE는 탈과립을 억제하여 항알러지 효과를 가지고 있음을 나타낸다.
이전 연구에 의하며 LPS로 자극된 대식세포에서 활성화된 MAPKs의 인산화가 그라비올라 잎 추출물에 의하여 억제되는 것이 보고되었는데[11], 본 연구에서도 비만세포에 항원 자극에 의하여 증가된 MAPKs의 활성이 GLE 에 의해 억제된다는 것을 확인한 것이다. 이상의 결과로, IgE 매개 비만세포의 활성화에 대한 GLE의 억제 효과는 Lyn/Syk, MAPKs 경로의 저해로 인하여 염증성 사이토카인의 발현이 억제되는 것임을 알 수 있고, 이는 항알러지 효과로 나타날 수 있을 것으로 사료된다.
2). 이전 연구에 의하면 동물모델에서 그라비올라 열매 추출물이 histamine의 발현을 억제시킨다는 보고가 있으나[15], 본 연구를 통하여 열매가 아닌 잎 추출물에서도 histamine 억제 효과가 있음이 확인되었다. 이상의 결과로 GLE는 탈과립을 억제하여 항알러지 효과를 가지고 있음을 나타낸다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
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