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문제 정의
- 따라서 본 연구는 시중에서 판매중인 3종(닭[초생추], 돼지[분만 전], 한우[성우])의 배합사료를 하절기 환경에 노출시켜 자연부패를 유도하고, 발생한 부패 진행의 정도에 따라서 생성되는 저분자 유기화합물의 변화를 통하여 배합사료의 부패유무를 미리 예측할 수 있는 효과적인 모니터링 방법을 제시하고자 한다.
- 본 연구에서는 시중에서 판매중인 3종 배합사료가 온도 및 습도가 높은 환경에서 자연부패가 진행됨에 따라 발생하는 저분자 유기화합물을 동정하고, 부패 미생물을 이용하여 인위적으로 부패시 생긴 저분자 유기화합물과 비교 모니터링하여 공통으로 확인되는 저분자 유기화합물을 동정하여 사료의 부패를 미리 예측하는 효과적인 방법을 제시하고자 한다. 3종의 배합사료 1주차에서 검출되는 화합물은 0주차와 변화는 별다른 차이가 없었으나, 2주차 이후부터 곰팡이 및 미생물의 군집이 형성되기 시작하였고, Koiganal 의 발생이 급격하게 증가한 것을 볼 수 있었다.
제안 방법
- 부패시키기 시작한 날을 최초 시료 채취 일 0주차로 설정하여 일주일 간격으로 1주차, 2주차, 3주차로 설정하여 진행하였다. 0주차, 1주차 샘플 채취 후에는 약간의 멸균수를 이용하여 수분 함량을 0주차와 1주차와 동일한 상태로 유지하면서 2주차, 3주차 샘플을 채취하였다. 멸균수를 첨가 할 때에는 70% ethanol로 소독한 분무기를 사용하였다.
- 사료는 닭(초생추), 돼지(분만 전), 한우(성우)로 세 가지를 이용하여 실험을 진행하였다. 2016년 6월 21일부터 동년 7월 12일 까지 연중 습도와 온도가 높은 장마철에 진행하였으며, 최대한 농가와 비슷한 환경에서의 변화를 알아보기 위하여 슬레이트 지붕의 창고에서 지상으로부터 50 cm 띄운 곳에 방치하여 사료의 자연 부패를 진행시켰다. 사료를 부패 관련 미생물 군으로 접종한 인위 부패 시에 발생하는 미생물별 전구 지표물질을 이용하여 자연부패 사료를 GC/MS를 이용하여 모니터링 하였다.
- 270°C에서 분당 5°C/min로 4분간 올린 후 290°C에서 20분간 유지하여 총 66분간 분리를 실시하였다.
- 3종의 시판 배합사료(닭, 돼지, 한우)를 자연 부패시키기 시작한 날을 0주차로 하여 1주차, 2주차, 3주차에 10 g을 각각 정량하여 bottle에 옮긴 후 MeOH과 hexane 혼합액(v:v/1:1) 10 mL을 추출 용매로 30°C에서 30분간 sonication하여 추출하였다.
- Mass 조건은 EI mode를 사용하며 electron impact를 70eV, Ion source temperature는 180°C, interface temperature는 280°C로 설정하여 질량 분석을 실시하였다.
- 3종의 시판 배합사료(닭, 돼지, 한우)를 자연 부패시키기 시작한 날을 0주차로 하여 1주차, 2주차, 3주차에 10 g을 각각 정량하여 bottle에 옮긴 후 MeOH과 hexane 혼합액(v:v/1:1) 10 mL을 추출 용매로 30°C에서 30분간 sonication하여 추출하였다. vortexing하여 균질화 시킨 후 여과장치를 사용하여 추출물을 수득 하였으며, MeOH와 hexane에 가용인 부분으로 분획하였다. 분획된 hexane층을 10 mg/mL의 농도로 제조한 다음 실린지 필터(PTFE/0.
- 4). 본 연구실에서는 부패미생물을 배합사료에 접종하여 aflatoxin이 검출된 사료와 미검출된 사료의 저분자 유지화합물의 변화양상을 관찰 하여 aflatoxin의 생성을 예측할 수 있는 전구물질을 분석하였으며, Aflatoxin이 검출된 Aspergillus flavus 접종한 사료에서 koiganal이 검출 되었고 Aflatoxin이 미검출된 Acinetobacter calcoaceticus 접종한 사료에서는 butadienone과 cyclohexanol이 검출되었다. 따라서 koiganal이 aflatoxin의 발생을 예측할 수 있는 독성 유발 전구 지표물질 성분으로 보고하였다(Kim 등, 2016).
- 사료를 부패 관련 미생물 군으로 접종한 인위 부패 시에 발생하는 미생물별 전구 지표물질을 이용하여 자연부패 사료를 GC/MS를 이용하여 모니터링 하였다. 부패시키기 시작한 날을 최초 시료 채취 일 0주차로 설정하여 일주일 간격으로 1주차, 2주차, 3주차로 설정하여 진행하였다. 0주차, 1주차 샘플 채취 후에는 약간의 멸균수를 이용하여 수분 함량을 0주차와 1주차와 동일한 상태로 유지하면서 2주차, 3주차 샘플을 채취하였다.
- 분리에 사용된 컬럼은 HP-1 (100 m/0.250 mm/0.50 µm, Agilent, USA)과 injection syringe를 이용하여 수행하였다.
- vortexing하여 균질화 시킨 후 여과장치를 사용하여 추출물을 수득 하였으며, MeOH와 hexane에 가용인 부분으로 분획하였다. 분획된 hexane층을 10 mg/mL의 농도로 제조한 다음 실린지 필터(PTFE/0.20 10m/13 mm, ADVANTEC)를 이용하여 여과하였다. 여과된 시료 µ1 L를 Splitless 모드와 270°C로 설정되어 있고, column (HP-1; agilent)이 장착되어진 GC-Mass (GC-2010, GC-MS QP2010:Shimazu)에 주입하여 분석하였다.
- 2016년 6월 21일부터 동년 7월 12일 까지 연중 습도와 온도가 높은 장마철에 진행하였으며, 최대한 농가와 비슷한 환경에서의 변화를 알아보기 위하여 슬레이트 지붕의 창고에서 지상으로부터 50 cm 띄운 곳에 방치하여 사료의 자연 부패를 진행시켰다. 사료를 부패 관련 미생물 군으로 접종한 인위 부패 시에 발생하는 미생물별 전구 지표물질을 이용하여 자연부패 사료를 GC/MS를 이용하여 모니터링 하였다. 부패시키기 시작한 날을 최초 시료 채취 일 0주차로 설정하여 일주일 간격으로 1주차, 2주차, 3주차로 설정하여 진행하였다.
- 여과된 시료 µ1 L를 Splitless 모드와 270°C로 설정되어 있고, column (HP-1; agilent)이 장착되어진 GC-Mass (GC-2010, GC-MS QP2010:Shimazu)에 주입하여 분석하였다.
대상 데이터
- 2016년 6월 21일부터 동년 7월 12일까지 연중습도와 온도가 높은 장마철 슬레이트 지붕의 창고에서 지상으로부터 50 cm 띄운 곳에 방치하여 사료의 부패를 진행시켰다. 0주차와 1주차에는 부패의 진행이 관찰되지 않았으나 쾌쾌한 냄새가 났으며 2주차 에서 육안으로 부패가 관찰 되었다.
- 50 µm, Agilent, USA)과 injection syringe를 이용하여 수행하였다. GC/MS 분석, 추출에 사용된 용매는 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입한 HPLC급 용매를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 GC/MS는 GC-2010 및 QP-2010를포함하는 GC/MS-2010 series (Shimazu Co, JAPEN)를 사용하였다. 분리에 사용된 컬럼은 HP-1 (100 m/0.
- 본 실험에서도 닭(초생추) 배합사료에서 0주차에서 1주차까지 변화가 없다가 2주차, 3주차에서 독성 유발 전구 지표물질인 Koiganal II이 검출 되었다. 돼지(분만 전)배합사료에서도 0주차에서 1주차까지 변화가 없다가 2주차, 3주차에서 독성 유발 전부 지표물질인 Koiganal II이 검출 되었다.
- 시판 배합사료는 농촌진흥청 국립축산과학원 영양 생리 팀에서 제공받아 사용하였다. 사료는 닭(초생추), 돼지(분만 전), 한우(성우)로 세 가지를 이용하여 실험을 진행하였다. 2016년 6월 21일부터 동년 7월 12일 까지 연중 습도와 온도가 높은 장마철에 진행하였으며, 최대한 농가와 비슷한 환경에서의 변화를 알아보기 위하여 슬레이트 지붕의 창고에서 지상으로부터 50 cm 띄운 곳에 방치하여 사료의 자연 부패를 진행시켰다.
- 시판 배합사료는 농촌진흥청 국립축산과학원 영양 생리 팀에서 제공받아 사용하였다. 사료는 닭(초생추), 돼지(분만 전), 한우(성우)로 세 가지를 이용하여 실험을 진행하였다.
- 여과된 시료 µ1 L를 Splitless 모드와 270°C로 설정되어 있고, column (HP-1; agilent)이 장착되어진 GC-Mass (GC-2010, GC-MS QP2010:Shimazu)에 주입하여 분석하였다. 이동상은 초고순도 헬륨(99.9%)을 사용하며, 유속은 0.36 mL/min이었다. 컬럼 내부 온도 변화는 120°C에서 분석을 시작하여 5°C/min로 30분간 올린 후 270°C에서 10분간 유지하였다.
성능/효과
- 이러한 결과는 독소유발 전구 지표물질 발현 예상 시기와 Koiganal 발생의 검출시기와 일치한 것을 알 수 있었다. 2주차부터 급격한 부패가 시작 되어 붉은 양상과 곰팡이가 생성된 것을 볼 수 있으며, 3주차에도 많은 곰팡이와 미생물 군집이 발견된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 본 연구에서는 시중에서 판매중인 3종 배합사료가 온도 및 습도가 높은 환경에서 자연부패가 진행됨에 따라 발생하는 저분자 유기화합물을 동정하고, 부패 미생물을 이용하여 인위적으로 부패시 생긴 저분자 유기화합물과 비교 모니터링하여 공통으로 확인되는 저분자 유기화합물을 동정하여 사료의 부패를 미리 예측하는 효과적인 방법을 제시하고자 한다. 3종의 배합사료 1주차에서 검출되는 화합물은 0주차와 변화는 별다른 차이가 없었으나, 2주차 이후부터 곰팡이 및 미생물의 군집이 형성되기 시작하였고, Koiganal 의 발생이 급격하게 증가한 것을 볼 수 있었다. 또한, 자연부패 2주차 이후 생성되는 Koiganal (43.
- 3종의 배합사료 모두에서 2주차와 3주차에서 독성유발 예상 전구물질로 보고한 Koiganal II가 검출되었다. 3종의 배합사료 모두에서 2주차 이후에 공통적으로 Methyl dihy-drohydnocarpate (34.0 min), Ethyl palmitate (35.7 min), Ethyl pentadecanoate (35.9 min), Methyl elaidate (38.7 min)의 성분이 검출되었다(Fig. 5).
- 8 min)은 이미 보고한(Kim 등, 2016) 인위 부패시와 동일한 양상을 보였다. 그러므로, Koiganal (43.8 min)은 배합사료의 종류에 상관없이 자연적, 인위적 부패에 공통적으로 발생되는 저분자 화합물이므로 독성유발 예상 전구물질로서 부패의 진행을 예측하는 지표물질로 이용하여, 사료의 부패 정도를 사전에 모니터링 하는데 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 3주차의 자연부패 사료에서는 2주차의 자연 부패사료보다 부패의 정도가 심해진 것을 관찰 할 수 있었다. 이러한 결과로부터 유해 미생물이 2주차가 접어드는 시기부터 독소를 발생시키는 것을 인지할 수 있었다. 이러한 결과는 독소유발 전구 지표물질 발현 예상 시기와 Koiganal 발생의 검출시기와 일치한 것을 알 수 있었다.
- 자연부패 시키기 시작한 날을 0주차로 하여, 1주차, 2주차, 3주차에서 각 시료의 저분자 유기 화합물의 변화 양상을 분석한 결과, 3종류의 배합사료 모두에서 1주차까지에서는 저분자 화합물의 변화가 나타나지 않았다. 그러나 2주차부터는 3종류 모두에서 다양한 저분자 유기화합물의 변화 양상을 보여주었다.
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