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문제 정의
- 따라서 본 연구는 착유우용 배합사료를 이용하여 적절한온도와 습도를 맞춘 후 공기에 노출시키면서, 사료 내 미생물및 화학적 변화를 분석하여 부패과정을 모니터링하고자 하였다.
제안 방법
- Fig. 1C에서 사료 내 오염 세균을 동정하고자 형태학적으로 서로 다른 세균의 콜로니를 LB에서 3종, MRS에서 3종, NA에서 2종, YM에서 3종을 분리하여 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 동정하였다(Table 2). Acinetobacter oleivorans (SK3806, SK3812)는 토양 및 논에서 분리되는 균이다[20].
- 45 μm)로여과한 후 Elisa reader (Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader, BioTek, USA)를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. L-tyrosine 용액으로 작성한 표준곡선에 흡광도를 대입하여 Tyrosine의 생성량을 구하였고, 1 unite 1분간 1 μg의 Tyrosine을 생성하는 능력으로 계산하였다.
- 각 실험 일자 별로 사료 샘플을 채취하였다. 각 샘플을 희석한 후 평판배지에 도말하여 콜로니 중 형태학적으로 서로 다른 세균과 곰팡이를 분리하였다. 분리한 세균에 대한 16S rRNA 염기서열은 Biofact (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였으며 Primer 27F (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 Primer 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T -3')을 사용하여 PCR로 증폭한 후 Primer 337F (5’-GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG-3’)를 사용하여 ABI 3730XL DNA analyzer로 염기서열을 분석하였다.
- 분리한 세균에 대한 16S rRNA 염기서열은 Biofact (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였으며 Primer 27F (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 Primer 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T -3')을 사용하여 PCR로 증폭한 후 Primer 337F (5’-GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG-3’)를 사용하여 ABI 3730XL DNA analyzer로 염기서열을 분석하였다. 곰팡이에 대한 5.8S rRNA 염기서열은 Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였으며 Primer ITS1 (5’-´TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG-3’)와 ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)을 사용하여 PCR로 증폭한 후 동일한 Primer를 사용하여 ABI 3730XL DNA analyzer로 염기서열을 분석하였다. 상동성 검색은 NCBI의 BLAST를 이용하였다.
- 디옥시니발레놀의 경우 착유우의 유량, 건강 및 생산성에 영향을 그다지 미치지 않고 우유로 전이되지 않기 때문에[6, 17], 본 실험에서는 착유우 및 여러 축종에 다양한 영향을 미치는 제랄레논의 농도를 측정하였다. 곰팡이독소 중 제랄레논은 실험 개시 샘플에서 59.
- NA, MRS, LB 평판배지는 37℃에서 24시간, YM 평판배지는 30℃에서 48시간, PDA 평판배지는 25℃에서 72시간 동안 배양하였다. 또한, 10배로 희석한 사료의 pH를 pH/ISE meter 735P (Istek, Inc., Republic of Korea)로 측정하였다.
- 부패가 진행되는 동안 사료 내의 생균수, pH 및 수분 활성도의 변화를 알아보기 위해 모든 시료를 제조한 날을 포함하여 5일 간격으로 15일 동안 생균수, pH 및 수분활성도를 측정하였다. 시료를 약 15 g을 채취한 후 바로 Aquaspector (AQS-31, NAGY Messsysteme GmbH, Germany)로 수분활성도를 25℃ 에서 측정하였다.
- 각 샘플을 희석한 후 평판배지에 도말하여 콜로니 중 형태학적으로 서로 다른 세균과 곰팡이를 분리하였다. 분리한 세균에 대한 16S rRNA 염기서열은 Biofact (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였으며 Primer 27F (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 Primer 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T -3')을 사용하여 PCR로 증폭한 후 Primer 337F (5’-GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG-3’)를 사용하여 ABI 3730XL DNA analyzer로 염기서열을 분석하였다. 곰팡이에 대한 5.
- 보관한 샘플을 본 실험에 사용하였다. 사료 샘플은 3 반복으로 제조하였으며, 부패가 일어나기 쉽도록 수분을 최종 33% 로 조정하여 30℃에 보관하면서 샘플링을 하였다. 생균수, pH 및 수분활성도 측정은 샘플 채취 후 바로 분석하였으며, 그 밖의 항목 측정은 샘플 채취 후 분석 시까지 -20℃에 보관한 것을 사용하였다.
- 사료가 부패되면서 일어나는 과정에서 pH, 수분활성도 및미생물의 성장을 관찰하였다. pH는 실험 개시 시점에 6.
- 사료 샘플은 3 반복으로 제조하였으며, 부패가 일어나기 쉽도록 수분을 최종 33% 로 조정하여 30℃에 보관하면서 샘플링을 하였다. 생균수, pH 및 수분활성도 측정은 샘플 채취 후 바로 분석하였으며, 그 밖의 항목 측정은 샘플 채취 후 분석 시까지 -20℃에 보관한 것을 사용하였다.
- 시료를 약 15 g을 채취한 후 바로 Aquaspector (AQS-31, NAGY Messsysteme GmbH, Germany)로 수분활성도를 25℃ 에서 측정하였다. 생균수의 측정을 위해 모든 샘플에서 1 g의 시료를 채취하여 멸균 증류수 9 ml로 희석(1:9)한 후 단계 희석하여서 NA, MRS, LB, YM 및 PDA 평판배지에서 생균 수를 측정하였다. 모든 배지는 Difco사(USA)의 것을 사용하였으며 그 지침에 따라 제조하였다.
- 시료를 약 15 g을 채취한 후 바로 Aquaspector (AQS-31, NAGY Messsysteme GmbH, Germany)로 수분활성도를 25℃ 에서 측정하였다. 생균수의 측정을 위해 모든 샘플에서 1 g의 시료를 채취하여 멸균 증류수 9 ml로 희석(1:9)한 후 단계 희석하여서 NA, MRS, LB, YM 및 PDA 평판배지에서 생균 수를 측정하였다.
- 5 ml 튜브에 넣고 15분간 5, 645× g로 원심분리 하여 그 상층액을 이용하였다. 젖산과 VFA는 UV detector (L-2400, Hitachi, Japan)와 컬럼(Metacarb 87H, Varian, Palo Alto, CA, USA)을 장착한 HPLC (L-2200, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 흡광도 측정값으로 반응 산물인 p-Nitrophenol (p-NP)의 양을 계산하였으며 p-NP 용액으로 표준곡선을 이용하였다. 효소 활성 1 unite 1분간 1 μM의 p-NP를 생성하는 능력으로 계산하였다.
- 37℃에서 30분간 반응시킨 후 Elisa reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정값으로 반응 산물인 p-Nitrophenol (p-NP)의 양을 계산하였으며 p-NP 용액으로 표준곡선을 이용하였다. 효소 활성 1 unite 1분간 1 μM의 p-NP를 생성하는 능력으로 계산하였다.
대상 데이터
- 생균수의 측정을 위해 모든 샘플에서 1 g의 시료를 채취하여 멸균 증류수 9 ml로 희석(1:9)한 후 단계 희석하여서 NA, MRS, LB, YM 및 PDA 평판배지에서 생균 수를 측정하였다. 모든 배지는 Difco사(USA)의 것을 사용하였으며 그 지침에 따라 제조하였다. NA, MRS, LB 평판배지는 37℃에서 24시간, YM 평판배지는 30℃에서 48시간, PDA 평판배지는 25℃에서 72시간 동안 배양하였다.
- 8S rRNA 염기서열은 Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였으며 Primer ITS1 (5’-´TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG-3’)와 ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)을 사용하여 PCR로 증폭한 후 동일한 Primer를 사용하여 ABI 3730XL DNA analyzer로 염기서열을 분석하였다. 상동성 검색은 NCBI의 BLAST를 이용하였다.
- 실험 사료 내 주로 자생하고 있는 미생물을 동정하기 위하여 각 실험 일자 별로 사료 샘플을 채취하였다. 각 샘플을 희석한 후 평판배지에 도말하여 콜로니 중 형태학적으로 서로 다른 세균과 곰팡이를 분리하였다.
- 지방분해효소(Lipase) 활성 측정에는 상기 여과액을 감압농축기(RE111, Büchi, Germany)로 5배 농축한 샘플을 사용하였다. Lipase 활성은 50 mM p-Nitrophenyl butyrate 0.
- 착유우용 시판사료의 영양학적 및 일반성분 조성은 Table 1과 같으며, 이 사료를 1회 개봉한 후 당일 밀봉하여 2달간 냉장 보관한 샘플을 본 실험에 사용하였다. 사료 샘플은 3 반복으로 제조하였으며, 부패가 일어나기 쉽도록 수분을 최종 33% 로 조정하여 30℃에 보관하면서 샘플링을 하였다.
데이터처리
- Change of pH (A), water activity (B), microbial growth (C), and complete feed for dairy milking cow before and after spoilage (D). Means±SD with different superscripts mean significant differences based on Duncan's multiple range test (p<0.05).
- Change of pH (A), water activity (B), microbial growth (C), and complete feed for dairy milking cow before and after spoilage (D). Means±SD with different superscripts mean significant differences based on Duncan's multiple range test (p<0.05).
- 1 Statistics Analytical System)의 General Linear Model 방법을 이용하여 분산분석을 하였다. 각 기간의 평균값을 비교하기 위해 Duncan's mul- tiple range test를 이용하여 유의성 검정을 p<0.05 수준에서실시하였다.
- 본 실험 결과는 SAS program (ver. 9.1 Statistics Analytical System)의 General Linear Model 방법을 이용하여 분산분석을 하였다. 각 기간의 평균값을 비교하기 위해 Duncan's mul- tiple range test를 이용하여 유의성 검정을 p<0.
이론/모형
- Adesogan 등의 방법에 따라 유기산 분석을 실시하였다[1]. 물로 추출한 사료를 1.
- 1, Toyo Roshi Kaicha, Japan)로 여과하여 단백질분해효소(protease) 활성 측정에 사용하였다. 사료 내의 단백질분해효소 활성은 Tyrosine을 이용한 Folin과 Ciocalteu의 방법(1927)을 사용하였다[14]. Methanol 추출액 1 ml에 기질로써 Casein 5 ml을 첨가하여 30분간 37℃에서 진탕 배양하였다.
- 시료에 대하여 총에너지는 Bomb calorimeter (Model C2000, IKA, Germany)로 측정하였으며 수분, 조단백, 조지방, 조섬유 및 조회분은 AOAC 방법[3]에 따라 분석하였다.
성능/효과
- 3). 15일차의 시료의 건물함량은 66.3%로 젖산 함량은 0.7 DM% 로 약간 증가하였으며 아세트산은 검출되지 않았다(p<0.01). 실험 초기에 검출되지 않았던 프로피온산의 경우 15일차에 1.
- Methylobacterium komagatae (SK3816)은 메탄올을 이용하는 균으로 식품가공장 등에서 분리된다[5, 21]. LB, MRS, NA 배지에 주로 관찰된 각각의 균주는 A. oleivorans SK3806, P. acidilactici SK3809, A. oleivorans SK3812이었다. YM 배지의 경우 0~10일차에는 W.
- 결론적으로 사료 내 pH의 감소와 생균수의 증가는 실험개시 이후 5일째에 일어났다. 그 이후에는 수분 및 단백질분해효소와 지방분해효소 활성의 증가로 사료의 생화학적 변화가 계속 진행되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
- komagatae SK3816이 주로 성장하였다. 곰팡이는 PDA에서 7개를 분리하였고 Mucor속 2종(F15, F16), Fusarium속 3종 (F104, F107, F109) 및 Hyphopichia burtonii F106, Alternaria al- ternate F113 등으로 동정되었으며, Fusarium속과 Mucor속 곰팡이가 주를 이루었다. Mucor circinelloides는 접합진균증을 일으키는 병원성 곰팡이이며[13, 18] Fusarium속 곰팡이는 곰팡이독소 중 주로 제랄레논과 디옥시니발레놀 등을 생성하는 것으로 알려져 있다[10, 23, 32].
- 이후 5일째에 일어났다. 그 이후에는 수분 및 단백질분해효소와 지방분해효소 활성의 증가로 사료의 생화학적 변화가 계속 진행되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 제랄레논은 사료가 부패함에 따라 10.
- 그 이후에는 수분 및 단백질분해효소와 지방분해효소 활성의 증가로 사료의 생화학적 변화가 계속 진행되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 제랄레논은 사료가 부패함에 따라 10.5배 이상 증가하여 우리나라의 사료내 권고기준을 넘어서는 수준으로 나타났다. 국내에서 현재규제가 이루어지고 있는 사료 내 아플라톡신, 오크라톡신 이외에도 앞으로는 제랄레논 허용기준에 대하여 고찰할 필요가 있다고 사료된다.
- 이는 배합사료를 개봉한 후 2 달 정도 지난 샘플이기 때문으로 이미 공기 중의 오염된 세균이 증식하였음을 나타낸다. 모든 배지에서 5일 후에 생균수가 증가하면서 MRS와 YM배지에서는 각각 7.0×108, 4.0×108 CFU/g로 증가하여 비슷한 수준으로 유지되었다. NA배지에서는 4.
- 실험 5일 후부터 모든 배지에서생균수가 증가하였는데 이는 수분함량, 수분활성도, pH 및 온도 등이 모두 미생물의 증식에 최적의 환경을 만들어 주었기 때문으로 보인다[16]. 실험 15일째에 실험사료에 곰팡이가 많이 증식된 것이 육안으로도 확인되었다(Fig. 1D). 시작일에 곰팡이는 1.
- 실험 개시 시 건물함량(Dry matter)이 67.0%인 사료 내 젖산(Lactate)과 아세트산(Acetate)의 함량은 각각 0.5, 0.1 DM% 이었으며 프로피온산(Propionate)은 검출되지 않았다(Fig. 3). 15일차의 시료의 건물함량은 66.
- 실험 시작일에 배합사료 내 서식하는 생균수는 약 107 CFU/g으로 나타났다(Fig. 1C). 이는 배합사료를 개봉한 후 2 달 정도 지난 샘플이기 때문으로 이미 공기 중의 오염된 세균이 증식하였음을 나타낸다.
후속연구
- 7 DM%로 측정되었다. 본 실험에서는 사료가 부패되면서 젖산과 프로피온산은 증가하였고 아세트산은 검출되지 않았으나, 그 밖의 다양한 휘발성 지방산 분석 결과로부터 부패과정 동안의 화학적 변화를 종합적으로 고찰할 필요가 있다.
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