왕우럭(Tresus keenae)에서 분리된 Bacillus species의 고분자 유기물질 분해능력과 항균활성 Degradation capability of macromolecular organic matters and antimicrobial activities of Bacillus species isolated from surf clam (Tresus keenae)원문보기
The production of enzymes that help digestion, assimilation of essential nutrients, and prevent pathogenic bacteria are important for probiotics used in aquaculture. The objective of this study was to investigate enzyme activities for macromolecular organic matters and antimicrobial properties of th...
The production of enzymes that help digestion, assimilation of essential nutrients, and prevent pathogenic bacteria are important for probiotics used in aquaculture. The objective of this study was to investigate enzyme activities for macromolecular organic matters and antimicrobial properties of the selected potential probiotics isolated from gut of surf clam (Tresus keenae) against well-known shellfish-pathogenic bacteria. Among 65 isolates from guts of 60 surf clams, seven Bacillus strains with outstanding degradation capability of macromolecule organic matter were selected as potential probiotics as follows: TKI01 (B. vietnamensis), TKI02, TKI26 (B. thuringiensis), TKI14, TKI32, TKI42 (B. amyloliquefaciens), and TKI18 (B. stratosphericus). After in vitro antimicrobial activity test was performed against five shellfish-pathogenic bacteria including Listonella anguillarum, Vibrio parahaemolyticus, V. splendidus, V. harveyi, V. tubiashii, PCR assay was performed to detect bacteriocin-producing strain. PCR results revealed that the five Bacillus strains possessed diverse bacteriocin genes including ericinA, coagulin, surfactin, iturin, bacyllomicin, fengycin, bacylisin, subtilin, and lantibiotics. In the present study, the selected seven Bacillus strains showed different enzyme activities according to types of macromolecule organic matters. And their antimicrobial activities varied based on the species of pathogenic bacteria. In addition, at least five Bacillus strains had genetic potential to produce several natural lipopeptide antibiotics that may help biological control of surf clam aquaculture. Therefore, mixed use of probiotics might show co-operative effect and increase the efficiency of probiotics rather than separate use. To the best of our knowledge, it is the first report on antimicrobial properties of Bacillus species isolated from surf clam.
The production of enzymes that help digestion, assimilation of essential nutrients, and prevent pathogenic bacteria are important for probiotics used in aquaculture. The objective of this study was to investigate enzyme activities for macromolecular organic matters and antimicrobial properties of the selected potential probiotics isolated from gut of surf clam (Tresus keenae) against well-known shellfish-pathogenic bacteria. Among 65 isolates from guts of 60 surf clams, seven Bacillus strains with outstanding degradation capability of macromolecule organic matter were selected as potential probiotics as follows: TKI01 (B. vietnamensis), TKI02, TKI26 (B. thuringiensis), TKI14, TKI32, TKI42 (B. amyloliquefaciens), and TKI18 (B. stratosphericus). After in vitro antimicrobial activity test was performed against five shellfish-pathogenic bacteria including Listonella anguillarum, Vibrio parahaemolyticus, V. splendidus, V. harveyi, V. tubiashii, PCR assay was performed to detect bacteriocin-producing strain. PCR results revealed that the five Bacillus strains possessed diverse bacteriocin genes including ericinA, coagulin, surfactin, iturin, bacyllomicin, fengycin, bacylisin, subtilin, and lantibiotics. In the present study, the selected seven Bacillus strains showed different enzyme activities according to types of macromolecule organic matters. And their antimicrobial activities varied based on the species of pathogenic bacteria. In addition, at least five Bacillus strains had genetic potential to produce several natural lipopeptide antibiotics that may help biological control of surf clam aquaculture. Therefore, mixed use of probiotics might show co-operative effect and increase the efficiency of probiotics rather than separate use. To the best of our knowledge, it is the first report on antimicrobial properties of Bacillus species isolated from surf clam.
따라서 본 연구에서는 왕우럭의 소화관에서 잠재적 패류의 프로바이오틱스 균주로서, 고분자 유기물질의 소화와 흡수를 도울 수 있는 균주를 선별하여 잘 알려진 패류 병원체에 대해 항균활성을 탐구하고, PCR을 통해 항균력의 배경 물질을 밝혀내고자 하였다.
제안 방법
왕우럭의 소화관에서 여름과 겨울에 각각 33주, 22주의 미생물을 분리 및 동정하여 국내외를 통틀어 최초로 보고하였다. 분리주들 중 고분자 유기물질 분해능력이 뛰어난 7개의 Bacillus spp. 균주를 선별하여 알려진 5종의 패류 병원성 세균에 대한 항균활성을 조사하였으며, 수산용 항생제를 포함한 항생제 10개를 양성대조군으로 설정하여 상대적으로 항균활성을 비교하였다. 또, 항균활성의 유전자적 배경을 찾고자 알려진 Bacillus spp.
항균력 시험 결과를 바탕으로 선별된 7주의 Bacillus 균주들이 알려진 bacteriocin 유전자를 보유하고 있는지 탐색하기 위해 PCR 분석을 수행하였다. 선별 균주의 항균 활성의 유전적 배경 탐색에 사용된 프라이머의 염기서열 및 annealing temperature 등 자세한 정보는 Table 1에 정리하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 패류 병원성 세균은 Listonella anguillarum KCTC 2711, Vibrio parahaemolyticus KCTC 2729, V. splendidus KCTC 12679, V. harveyi KCTC 12724, V. tubiashii KCTC 12729 균주로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양받아 사용하였다. MA 배지에 25°C에서 배양하여 2회 계대배양한 뒤 사용하였다.
본 연구에 사용된 왕우럭(Tresus keenae)은 잠수기어업을 이용하여 포획되었으며 여수의 한 양식업체를 통해 여름과 가을에 각각 30마리씩 구입하였다. 채집한 개체는 각고, 각장, 각폭을 측정한 뒤 탈염 수돗물로 2∼3회 정도 세척하여 불순물을 제거한 뒤 멸균된 해부용 칼을 이용하여 패각과 근육을 제거하고 소화관을 분리하였다.
데이터처리
분석된 16s rRNA 유전자 염기서열은 BioEdit software (Hall, 1999)와 SeqMan software (DNASTAR, WI, USA)를 이용하여 trimming, alignment, assembly를 수행한 뒤 BLAST search (NCBI, MD, USA)를 이용하여 각 세균을 동정하였다. BLAST search만으로 종 단위까지 정확한 동정이 어려운 경우, 각 세균의 genus에 속하는 type strain을 수집하여 염기서열의 상동성 비교 및 계통분석을 실시하여 동정하였다. 분리주와 type strain과 염기서열은 BioEdit software (Hall, 1999)와 Clustal omega (EBI, Cambridge, UK)를 이용해 multi-alignment 후, MEGA6 software (Tamura 등, 2013)를 이용해 계통 분석을 실시하였다.
BLAST search만으로 종 단위까지 정확한 동정이 어려운 경우, 각 세균의 genus에 속하는 type strain을 수집하여 염기서열의 상동성 비교 및 계통분석을 실시하여 동정하였다. 분리주와 type strain과 염기서열은 BioEdit software (Hall, 1999)와 Clustal omega (EBI, Cambridge, UK)를 이용해 multi-alignment 후, MEGA6 software (Tamura 등, 2013)를 이용해 계통 분석을 실시하였다. 계통분석은 neighbor-joining method와 Kimura-2 parameter를 이용하여 수행하였고 1,000회의 bootstrap 분석을 통해 계통분석의 신뢰도를 평가하였다.
이론/모형
잘 알려진 5종의 패류 병원성 세균에 대해, 선별된 7개 Bacillus spp. 균주의 항균활성과 항생제의 항균활성을 비교하기 위해 양성 대조군으로서 다양한 항생제가 포함된 8 mm의 항생제 디스크를 이용한 디스크확산법으로 항생제 감수성 시험을 수행하였다. 접종액은 MA에 배양한 병원체 세균의 colony를 멸균 saline에 현탁하여 탁도를 0.
성능/효과
본 연구 결과에 따르면, 고분자 분해 활성에 있어서는 TKI01, TKI02, TKI26, TKI32, TKI45 균주가 소화 및 흡수에 가장 효과적일 것으로 생각된다. In vitro 항균활성능 시험에서는 병원성 세균의 종류에 따라 각 균주의 항균력의 수준이 다르게 나타났지만, PCR을 이용한 유전자 수준의 분석 결과, TKI01, TKI26 두 개 균주를 제외한 모든 균주가 잠재적 항균활성을 가지는 것으로 생각된다. 따라서 단일 균주의 사용보다는 고분자 유기물질 분해능과 항균활성이 다른 균주를 혼합하여 사용하는 것이 더 효과적일 것으로 생각된다.
의 bacteriocin 유전자를 타겟으로 PCR 분석을 수행하였다. 본 연구 결과에 따르면, 고분자 분해 활성에 있어서는 TKI01, TKI02, TKI26, TKI32, TKI45 균주가 소화 및 흡수에 가장 효과적일 것으로 생각된다. In vitro 항균활성능 시험에서는 병원성 세균의 종류에 따라 각 균주의 항균력의 수준이 다르게 나타났지만, PCR을 이용한 유전자 수준의 분석 결과, TKI01, TKI26 두 개 균주를 제외한 모든 균주가 잠재적 항균활성을 가지는 것으로 생각된다.
그러므로 유전자의 보유 여부만으로는 실제 bacteriocin의 발현 및 표현 수준을 예측할 수 없다. 본 연구에서 선별된 7개의 Bacillus 균주에 대해 고분자 유기물질 분해능력과 항균활성능력을 종합적으로 평가해보았을때, 단일 균주만을 생균제로 개발 및 사용하는 것은 한계가 있을 것으로 보이나, 효과가 다른 여러 균주를 혼합하여 사용한다면 상가효과 또는 상승효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
따라서 단일 균주의 사용보다는 고분자 유기물질 분해능과 항균활성이 다른 균주를 혼합하여 사용하는 것이 더 효과적일 것으로 생각된다. 그러나 in vitro 실험의 결과가 in vivo 적용 시험에서도 반드시 일관적으로 나타나는 것은 아니며 사육수와 왕우럭 유생의 생체 내 영향까지도 고려해야 하므로, 생균제로서의 개발을 위해서는 반드시 현장 또는 현장과 유사한 환경에서의 적용 시험을 수행하여 왕우럭 종묘의 생존율, 먹이활동, 수질환경, 사육수의 미생물총 변화 등에 대해 추가적인 연구를 수행할 필요가 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
왕우럭이란?
왕우럭(Tresus keenae)은 개량조개과(Mactridae), 왕우럭속(Tresus)에 속하는 비부착성 대형 패류로 한국과 일본에만 분포한다. 우리나라에서는 거제, 사천, 남해, 여수 등의 연안 바다에서 수심 5∼20 m 전후의 사니질에 잡입하여 서식하는 특산종으로 자원량이 적은 편이다.
왕우럭의 국내 서식 특징은?
왕우럭(Tresus keenae)은 개량조개과(Mactridae), 왕우럭속(Tresus)에 속하는 비부착성 대형 패류로 한국과 일본에만 분포한다. 우리나라에서는 거제, 사천, 남해, 여수 등의 연안 바다에서 수심 5∼20 m 전후의 사니질에 잡입하여 서식하는 특산종으로 자원량이 적은 편이다. 대부분은 일본에 수출되는 고가의 조개이지만, 모패로 성장하기까지 2∼3년 이상의 오랜 시간이 걸릴 뿐 아니라 현재는 남획으로 인하여 자연자원량이 점차 감소하고 있는 실정이다.
왕우럭의 채집은 어떻게 이루어지는가?
대부분은 일본에 수출되는 고가의 조개이지만, 모패로 성장하기까지 2∼3년 이상의 오랜 시간이 걸릴 뿐 아니라 현재는 남획으로 인하여 자연자원량이 점차 감소하고 있는 실정이다. 게다가 왕우럭의 채집은 잠수부가 수심 20 m 전후에서 분사식고압펌프를 이용하여 모래를 흩어낸 후 채취하는 방법으로 이루어져, 채집 대상인 왕우럭 성체뿐 아니라 주변 유생의 서식지도 파괴되어 자연 자원량의 감소를 심화시키고 있다.
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