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문제 정의
- 동일 속의 probiotic 균주를 사용하더라도 균주별 특성과 기능성의 차이로 첨가 효능은 상이하게 나타날 수 있다. 따라서 이 연구는 국내 양식장에서 분리한 Bacillus 균주 3종을 넙치사료에 첨가하여 성장, 사료효율, 비특이적 면역반응 및 Streptococcus iniae에 대한 질병저항성에 미치는 영향을 알아보고자 수행되었다.
제안 방법
- 실험어인 넙치치어는 전라남도에 위치한 종묘배양장에서 구입하여 제주대학교소속 해양과환경연구소로 이송되었다. 2주간 3톤 FRP수조에서 시판 배합사료를 공급하면서 실험환경에 적응할 수 있도록 순치시킨 후 실험에 사용하였다. 예비사육 후 넙치(초기평균무게: 20±0.
- 9주간의 사료공급 후, 어류의 최종 무게를 측정하여 증체율(weight gain), 일간성장률(specific growth rate), 사료전환효율(feed conversion ratio), 단백질이용효율(protein efficiency ratio) 및 생존율(survival)을 계산하였다. 최종무게 측정 후, 각 수조당 6마리(사료구당 18마리)의 실험어를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol 용액(100 ppm)으로 마취시킨 후 6마리 중 3마리는 헤파린이 처리된 주사기를 이용하여 꼬리 미병부에서 채혈하였다.
- 9주간의 성장실험 종료 후, 혈액 및 전어체 샘플을 하고 남은 어류를 대상으로 공격실험을 실시하였다. 그람양성 세균인 S.
- 채혈된 전혈은 hematocrit, hemoglobin 및 대식세포활성(NBT; nitroblue-tetrazolium) 분석에 이용되었다. Hematocrit은 헤파린이 처리된 모세혈관 채혈튜브(Micro-hematocrit capillary tube)에 혈액을 채운 후, 고무판(Wax plates)에 세워 혈액진단원심분리기(Micro Hematocrit VS-12000, Vision, Korea)에서 10분간 원심분리하여 값을 측정하였다. Hemoglobin, triglyceride, glucose, total protein, total cholesterol, ALT (alanine aminotransferase) 및 AST (aspartate aminotransferase) 분석은 각각의 시판 kit시약과 반응시킨 후 혈액생화학분석기(Express plus system, Seac, USA)를 이용하여 분석하였다.
- Hematocrit은 헤파린이 처리된 모세혈관 채혈튜브(Micro-hematocrit capillary tube)에 혈액을 채운 후, 고무판(Wax plates)에 세워 혈액진단원심분리기(Micro Hematocrit VS-12000, Vision, Korea)에서 10분간 원심분리하여 값을 측정하였다. Hemoglobin, triglyceride, glucose, total protein, total cholesterol, ALT (alanine aminotransferase) 및 AST (aspartate aminotransferase) 분석은 각각의 시판 kit시약과 반응시킨 후 혈액생화학분석기(Express plus system, Seac, USA)를 이용하여 분석하였다. 남은 3마리의 혈액은 헤파린이 처리되지 않은 주사기를 이용하여 채혈하였으며 채혈된 전혈은 상온에서 60분 방치시킨 후 원심분리기로(5,000 ×g) 혈청을 분리하여 MPO (myeloperoxidase)활성 및 SOD (superoxide dismutase)활성을 분석하였다.
- 9주간의 성장실험 종료 후, 혈액 및 전어체 샘플을 하고 남은 어류를 대상으로 공격실험을 실시하였다. 그람양성 세균인 S. iniae을 이용하여 109 CFU/mL의 농도가 되도록 멸균 생리염수에 현탁한 후, 어류를 1시간 동안 현탁액에 침지하였다. S.
- 남은 3마리의 혈액은 헤파린이 처리되지 않은 주사기를 이용하여 채혈하였으며 채혈된 전혈은 상온에서 60분 방치시킨 후 원심분리기로(5,000 ×g) 혈청을 분리하여 MPO (myeloperoxidase)활성 및 SOD (superoxide dismutase)활성을 분석하였다.
- iniae에 감염시킨 실험어(총 120마리)는 총 12개의 64 L 수조에 3반복으로 배치되었다. 모든 수조는 22-25℃ 수온으로 유지되었고 에어스톤으로 충분한 용존산소를 유지하였으며 매일 100% 환수를 하였고 총 18일 동안 누적폐사율을 조사하였다.
- 실험어의 무게 측정은 3주마다 실시되었고, 측정 24시간 전에 실험어의 스트레스를 줄이기 위해 모든 어류를 절식시켰다. 사료공급실험은 총 9주간 수행되었다.
- 광주기는 형광등을 이용하여 12 L:12 D 조건으로 유지되었고, 실험기간 동안 사육수온은 22-28℃ 범위로 자연수온에 의존하였다. 실험사료는 1일 2회(09:00와 17:00)로 육안관찰에 의한 만복공급을 하였다. 실험어의 무게 측정은 3주마다 실시되었고, 측정 24시간 전에 실험어의 스트레스를 줄이기 위해 모든 어류를 절식시켰다.
- 실험에 사용된 3가지 생균제인 Bacillus 균주(CJ제일제당주식회사)의 성분분석 결과는 Table 2에 나타내었다. 실험사료는 생균제가 첨가되지 않은 대조구에 각각 0.5%의 생균제를 첨가하여 제작하였으며, 생균제가 첨가되는 양만큼 cellulose 양을 감소시켜 생균제 첨가에 따른 영양소의 변화가 없도록 하였다. 실험사료의 제조는 파쇄기를 이용하여 모든 사료원을 분말형태(200 µm 이하)로 만든 후, 각 사료원을 사료조성표에 따라 정확히 무게를 재고 혼합하였다.
- 실험사료의 제조는 파쇄기를 이용하여 모든 사료원을 분말형태(200 µm 이하)로 만든 후, 각 사료원을 사료조성표에 따라 정확히 무게를 재고 혼합하였다.
- 실험사료는 1일 2회(09:00와 17:00)로 육안관찰에 의한 만복공급을 하였다. 실험어의 무게 측정은 3주마다 실시되었고, 측정 24시간 전에 실험어의 스트레스를 줄이기 위해 모든 어류를 절식시켰다. 사료공급실험은 총 9주간 수행되었다.
- 이후 2,000 ×g 에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 취한 후, 분광광도계(Genesys 10 UV, Beckman, USA)를 이용하여 540nm에서 NBT의 감소 범위를 측정하였다.
- 9주간의 사료공급 후, 어류의 최종 무게를 측정하여 증체율(weight gain), 일간성장률(specific growth rate), 사료전환효율(feed conversion ratio), 단백질이용효율(protein efficiency ratio) 및 생존율(survival)을 계산하였다. 최종무게 측정 후, 각 수조당 6마리(사료구당 18마리)의 실험어를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol 용액(100 ppm)으로 마취시킨 후 6마리 중 3마리는 헤파린이 처리된 주사기를 이용하여 꼬리 미병부에서 채혈하였다. 채혈된 전혈은 hematocrit, hemoglobin 및 대식세포활성(NBT; nitroblue-tetrazolium) 분석에 이용되었다.
대상 데이터
- 이 실험에 사용한 Bacillus 균주는 CJ제일제당㈜의 양어용 Probiotics 균주를 사용하였다. 3종류의 균주는 생산성이 우수한 국내 양식장에서 선발된 균주들로서 단백질, 지방, 전분, 섬유소 등에 대한 복합 소화효소 활성 및 S. iniae, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda, Vibrio harveyi 등의 병원성 세균 및 수생곰팡이에 대한 복합 항균활성과 siderophore 생산성 평가 등을 통해 선발된 균주들이다. 실험에 사용한 3개 균주는 동정결과 B.
- 이후 2,000 ×g 에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 취한 후, 분광광도계(Genesys 10 UV, Beckman, USA)를 이용하여 540nm에서 NBT의 감소 범위를 측정하였다. Blank는 dimethyl formamide를 사용하였다.
- iniae을 이용하여 109 CFU/mL의 농도가 되도록 멸균 생리염수에 현탁한 후, 어류를 1시간 동안 현탁액에 침지하였다. S. iniae에 감염시킨 실험어(총 120마리)는 총 12개의 64 L 수조에 3반복으로 배치되었다. 모든 수조는 22-25℃ 수온으로 유지되었고 에어스톤으로 충분한 용존산소를 유지하였으며 매일 100% 환수를 하였고 총 18일 동안 누적폐사율을 조사하였다.
- 실험어인 넙치치어는 전라남도에 위치한 종묘배양장에서 구입하여 제주대학교소속 해양과환경연구소로 이송되었다. 2주간 3톤 FRP수조에서 시판 배합사료를 공급하면서 실험환경에 적응할 수 있도록 순치시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 4개의 실험사료는 조단백질 43%, 조지방 14%로 제조하였으며, 에너지는 17.4 MJ/kg로 실험실에서 동일하게 제조되었다 (Table 1). 실험에 사용된 3가지 생균제인 Bacillus 균주(CJ제일제당주식회사)의 성분분석 결과는 Table 2에 나타내었다.
- 이 실험에 사용한 Bacillus 균주는 CJ제일제당㈜의 양어용 Probiotics 균주를 사용하였다. 3종류의 균주는 생산성이 우수한 국내 양식장에서 선발된 균주들로서 단백질, 지방, 전분, 섬유소 등에 대한 복합 소화효소 활성 및 S.
- 최종무게 측정 후, 각 수조당 6마리(사료구당 18마리)의 실험어를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol 용액(100 ppm)으로 마취시킨 후 6마리 중 3마리는 헤파린이 처리된 주사기를 이용하여 꼬리 미병부에서 채혈하였다. 채혈된 전혈은 hematocrit, hemoglobin 및 대식세포활성(NBT; nitroblue-tetrazolium) 분석에 이용되었다. Hematocrit은 헤파린이 처리된 모세혈관 채혈튜브(Micro-hematocrit capillary tube)에 혈액을 채운 후, 고무판(Wax plates)에 세워 혈액진단원심분리기(Micro Hematocrit VS-12000, Vision, Korea)에서 10분간 원심분리하여 값을 측정하였다.
데이터처리
- 데이터는 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석하였다.
- 실험사료군의 배치는 완전확률계획법(Completely randomized design)을 실시하였고, 분석결과는 SPSS (Statistical package for the social sciences, Version 11.0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA를 실시한 이후 실험구간의 유의성은 LSD (Least Significant Difference)로 평균간의 유의성(P<0.05)을 비교하였다.
이론/모형
- 일반성분분석은 AOAC (1995) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법(125℃, 3시간), 조회분은 직접회화로법(550℃, 6시간), 단백질은 자동 조단백질 분석기(Kjeltec System 2300, Sweden)로 분석되었으며, 지방은 Folch et al. (1959)의 방법에 따라 Soxhlet 추출장치(Soxhlet Heater System C-SH6, Korea)를 이용하여 분석되었다.
- 혈액내의 대식세포 활성은 Kumari and Sahoo (2005)의 분석방법을 이용하여 호중구의 oxidative radical 생성량을 측정하였다. 혈액(전혈)과 NBT solution (0.
- 혈청 내 MPO 활성은 Kumari and Sahoo (2005)의 방법을 기초로 분석하였다. 먼저 HBSS (Hanks balanced salt solution) 용액을 96-well plates에 80 µL씩 분주한 다음 혈청 20 µL를 넣은 후 20 mM TMB (3,3’5,5’-tetramethyllbenzidine hydrochloride) 용액과 5 mM H2O2용액을 넣고, 2분간 반응시킨 후 4 M H2SO4용액을 35 µL 첨가하여 microplate reader (Thermo, Biochrom, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 혈청 내 SOD활성은 superoxide dismutase assay kit (Sigma, 19160)를 이용하여 분석되었다.
성능/효과
- B. pumilus와 B. licheniformis가 첨가된 그룹에서는 같은 기간에 85% 이상의 높은 생존율을 보였으며 대조구에 비해 유의적으로 높은 생존율을 나타내었다(P<0.05).
- B. subtilis 균주는 국내 넙치양식장에서 분리한 균주로 protease, amylase, cellulase, lipase와 같은 소화효소 활성이 우수하고 병원성 균주와의 경쟁적 철분 포획을 위한 siderophore 생산성이 높으며 S. iniae, A. salmonicida, E. tarda, V. Harveyi에 높은 항균활성이 있는 것으로 선택되었다. Ziaei-Nejad et al.
- 1에 나타내었다. S. iniae를 인위 감염 시켰을 때, 대조구에서는 3일째부터 사망개체가 발견되었고 감염 18일째에 약 45%의 낮은 생존율을 보였다. B.
- 1. Survivals of olive flounder Paralichthys olivaceus during the challenge test against S.iniae by immersion (109 CFU/mL) after 9 weeks of the feeding trial. Fish were fed on the diets containing three different Bacillus sp.
- 그러나 9주간의 사료공급 후 비특이적 면역분석결과에서는 모든 실험구에서 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 5).
- 이번 연구에서의 hematocrit, hemoglobin, cholesterol, glucose, AST 및 ALT 결과, Bacillus균주에 따른 유의적인 차이는 없었다. 그러나 혈장 내 total protein의 함량은 B. subtilis를 섭취한 그룹이 대조구에 비해 유의적으로 낮은 값을 보였으나, B. pumilius 와 B. licheniformis 그룹과는 유의적인 차이가 없었다. Pack et al.
- , 2007). 따라서, 사료에 첨가된 생균제의 효능은 모든 어종에 동일하게 적용되는 것이 아니라 양식생물의 종류, 연령, 성장단계와 생균제의 종류, 배양방법 및 첨가농도에 따라 달라질 수 있으므로 각 어종에 적합한 균주의 선택과 사료 내 첨가함량의 적절한 조절이 중요할 것으로 사료된다.
- 생존율은 모든 실험구에서 유의적인 차이가 없었다. 성장결과에서는 증체율과 일간성장률에 있어서 B. subtilis 균주가 첨가된 그룹이 B. pumilus 균주가 첨가된 그룹에 비해 유의적으로 높은 값을 보였으나, 무첨가 그룹인 대조구와는 유의적인 차이가 없었다. 이번 연구에서 B.
- iniae, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda, Vibrio harveyi 등의 병원성 세균 및 수생곰팡이에 대한 복합 항균활성과 siderophore 생산성 평가 등을 통해 선발된 균주들이다. 실험에 사용한 3개 균주는 동정결과 B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis로 동정되었다.
- pumilus 균주가 첨가된 그룹에 비해 유의적으로 높은 값을 보였으나, 무첨가 그룹인 대조구와는 유의적인 차이가 없었다. 이번 연구에서 B. subtilis 균주가 다른 균주들에 비해 다소 성장을 촉진시킨 결과는 B. subtilis 균주가 단백질분해효소의 분비를 촉진시켜 사료의 단백질소화율을 증진시켰을 것으로 추측된다. 틸라피아(Aly et al.
- , 2006). 이번 연구에서의 hematocrit, hemoglobin, cholesterol, glucose, AST 및 ALT 결과, Bacillus균주에 따른 유의적인 차이는 없었다. 그러나 혈장 내 total protein의 함량은 B.
- (2007)도 생균제가 어류의 생존능력과 내성면역력을 향상시킬 수 있다고 보고하였지만 그 메커니즘에 대한 정확한 해답은 제시하지 못하였다. 이번 연구의 결과를 종합해 볼 때 사료 내 Bacillus 균주의 첨가는 어류질병을 유발시키는 병원균에 대한 저항성을 높일 수 있을 것으로 사료된다. 추후 연구에서는 우수성이 보고된 생균제의 첨가농도를 조절하여 사료 내 적정 첨가량을 규명하고 나아가 혼합첨가 효과도 조사하여 사료첨가제로써 생균제가 안정적으로 사용될 수 있는 결과를 도출해야할 것으로 판단된다.
후속연구
- 우수성이 보고된 생균제라도 대상어종과 실험조건에 따라 그 효능은 다르게 나타날 수 있다. 동일 속의 균주라도 종의 특성에 따라 그 결과는 상이하게 나타날 수 있으므로, 각 어종의 특성에 적합한 생균제의 탐색과 균주선발이 필요할 것으로 사료된다. 넙치의 혈액분석 결과는 Table 4에 나타내었다.
- 이는 사료에 첨가된 생균제가 단백질합성 및 분비를 촉진시켜 혈중 단백질량이 증가되었을 것이라 추측하며 이번 연구결과와는 반대의 경향이 나타났다. 이번 연구와 Pack et al. (2008)의 연구에서 사용된 균주가 달랐더라도 생균제에 따른 혈중 단백질 함량의 증감은 양식어류의 성장에 매우 중요하므로 추가적인 보충연구를 통하여 이에 대한 메커니즘을 규명할 필요성이 있다.
- 이번 연구의 결과를 종합해 볼 때 사료 내 Bacillus 균주의 첨가는 어류질병을 유발시키는 병원균에 대한 저항성을 높일 수 있을 것으로 사료된다. 추후 연구에서는 우수성이 보고된 생균제의 첨가농도를 조절하여 사료 내 적정 첨가량을 규명하고 나아가 혼합첨가 효과도 조사하여 사료첨가제로써 생균제가 안정적으로 사용될 수 있는 결과를 도출해야할 것으로 판단된다.
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