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문제 정의
- 본 연구에서는 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 다년초식물인 참소리쟁이(Rumex japonicus Houtt.) 뿌리의 추출물 및 분획과 gentamicin의 항생제 증강 효과를 그람 음성 세균인 S. aureus와 S. epidermidis에서 확인하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- 2 배 희석법을 이용하여 여러 농도로 제조한 gentamicin과 0.1 ㎎/㎖의 농도가 되도록 n-hexane 분획(HF)과 CHCl3 분획(CF)을 각각 30 ㎕씩 처리한 후 균액을 30 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 24 시간 배양하였다. 배양액을 200 ㎕를 취하여 96 well plate에 옮겨 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 각 균주를 계대 배양한 배양액 100 ㎕를 항균시험용 평판배지에 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하여 준비하였고, 직경 6 ㎜의 paper disc에 여러 농도의 시료를 천천히 흡수시킨 뒤 용매를 휘발시키는 건조과정을 거쳐 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 배양하였다. 24 시간 배양 후 disc 주면에 생성된 생육저해환(clear zone, ㎜)의 지름을 측정하여 항균활성 및 병용효과를 확인하였다.
- PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 제조한 MTT 용액을 10 ㎕씩 각 well에 첨가하고, MTT가 환원되도록 4 시간동안 37℃, 5% CO2 조건에서 반응시켰다. 배지를 제거한 후, 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 각 well에 생성된 formazan 결정을 용해시킨 후 흡광도를 540 ㎚에서를 측정하였으며, 시료 대신 PBS를 첨가한 well의 평균 흡광도를 이용하여 세포 생존율 산출하였다.
- 마쇄한 참소리쟁이 뿌리를 70% ethanol(EtOH)을 이용하여 2 시간씩 3 회에 걸쳐 80℃에서 환류냉각추출을 실시한 후 추출액은 여과 후 농축기(BUCHI, Flawil, Switzerland) 및 동결건조기(Sam Won Industry, Seoul, Korea)를 이용하여 추출물을 획득하였으며, 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 분말화된 추출물 중 일부를 증류수에 분산시킨 후 nhexane, chloroform(CHCl3), ethyl acetate(EtOAc), n-butanol(BuOH)을 이용하여 순차적으로 용매분획을 수행하였다. 용매분획으로 획득한 시료는 여과 후 농축 및 동결건조를 이용하여 분말화 하였으며 냉장보관(4℃ 이하)하면서 실험에 사용하였다.
- 배양액을 200 ㎕를 취하여 96 well plate에 옮겨 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 PBS를 사용한 음성 대조군의 흡광도를 기준으로 생육 저해 활성을 산출하였다.
- 참소리쟁이 뿌리 추출물 및 분획과 gentamicin의 및 병용효과를 확인하기 위하여 disc diffusion assay를 이용하여 각 균주를 대상으로 항균효과를 측정하였다. 각 균주를 계대 배양한 배양액 100 ㎕를 항균시험용 평판배지에 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하여 준비하였고, 직경 6 ㎜의 paper disc에 여러 농도의 시료를 천천히 흡수시킨 뒤 용매를 휘발시키는 건조과정을 거쳐 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 배양하였다.
대상 데이터
- , Gyeongsan, Korea)을 이용하여 실험에 사용하였다. 그 외 실험에 사용된 시약들은 SigmaAldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 미생물 균주 2 종은 nutrient agar(NA) 및 broth(NB) 배지를 사용하였으며, 세포주는 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 혼합한 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, WelGENE Inc., Gyeongsan, Korea)을 이용하여 실험에 사용하였다.
- 미생물 균주 Staphylococus epidermidis(KCTC1917)와 Staphylococus aureus(KCTC3881), 동물세포주 L929 cell은 한국생명공학연구원 생물자원센터(BRC)에서 분양 받아 사용하였다. 미생물 균주 2 종은 nutrient agar(NA) 및 broth(NB) 배지를 사용하였으며, 세포주는 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 혼합한 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, WelGENE Inc.
- 본 연구에 이용한 참소리쟁이 (Rumex japonicus Houtt.)는 2016년 삼홍건재약업사에서 구입하여 냉장 보관(4℃ 이하)하며 실험에 사용하였으며, 약재 (DSUBIC-16-0002)는 동신대학교 BIO센터에 냉장 보관되어 있다.
- 분말화된 추출물 중 일부를 증류수에 분산시킨 후 nhexane, chloroform(CHCl3), ethyl acetate(EtOAc), n-butanol(BuOH)을 이용하여 순차적으로 용매분획을 수행하였다. 용매분획으로 획득한 시료는 여과 후 농축 및 동결건조를 이용하여 분말화 하였으며 냉장보관(4℃ 이하)하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 측정치 비교는 One-way analysis of variance(ANOVA)를 시행한 후 Duncan’s Multiple Range Test(DMRT)로 유의성은 신뢰구간 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
- 모든 측정값은 3 회 이상 반복하여 실험한 결과의 평균값과 표준편차(means ± SD)로 표기하였으며, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS(Statistical Pakage for Social Science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago. IL, USA)를 이용하여 수행하였다.
이론/모형
- Disc diffusion assay를 통해 우수한 항생제 병용 효과를 나타낸 시료가 S. epidermidis와 S. aureus의 생장에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해 broth dilution assay를 이용하여 항균활성을 측정하였다(Mulyaningsih et al., 2010).
- 참소리쟁이 뿌리 추출물 및 분획과 gentamicin의 세포 생존율은 세포독성 실험에 많이 이용되는 생쥐의 섬유모세포의 일종인 L929 세포주를 이용하여 MTT assay로 확인하였다(Shin et al., 2003).
성능/효과
- EF의 항균 효과를 나타내는 물질과 HF와 CF의 항생제 증강효과를 나타내는 물질이 다르다는 것을 확인 할 수 있었으며, 이러한 결과는 용매의 극성에 따른 분리로 인한 시료 간 활성 성분의 차이로 인해 나타나는 결과로 판단되었다. 추후 연구 진행 시 물질 분리 및 정제를 통해 항균 효과와 항생제 증강효과를 나타내는 물질을 규명한다면 새로운 항균 물질 개발이 가능할 것으로 생각되었다.
- Gentamicin을 단독으로 처리하였을 때에는 실험이 실시된 모든 농도에서 95.00% 이상의 세포 생존율을 보였으나, 10 ㎎/㎖ 농도의 EF을 gentamicin 1 ㎎/㎖과 병행하여 처리한 실험군의 세포 생존율이 33.96%로 세포독성이 있음을 확인할 수 있었다. 항생제 증강 효과가 우수하였던 HF을 2 ㎎/㎖ 이하의 농도로 gentamicin 1 ㎎/㎖과 병행하여 처리하였을 때, 100.
- 1a). HF을 병행 처리한 경우 고농도에서는 CF 병행 처리구보다 높은 저해활성을 보였지만 저농도에서는 약 15%의 저해활성을 나타냄으로서 gentamicin을 단독으로 처리한 실험군보다는 높았지만 CF와 병행 처리한 실험군보다는 낮은 활성을 보여주었다. S.
- Disc diffusion assay를 이용하여 참소리쟁이 뿌리 추출물과 분획의 항균활성을 Table 2에 나타내었다. S. aureus에 대한 항균활성 결과를 살펴보면, 3 ㎎/disc로 sample을 처리하였을 때 추출물은 8.83 ㎜의 생육저해환을 형성하였으며, CF과 EF이 각각 11.20 ㎜, 11.40 ㎜의 생육저해환을 형성함으로써 다른 분획보다 높은 활성을 보여주었다. S.
- 63 ㎜의 생육저해환을 형성함으로써 추출물과 다른 분획보다 높은 활성을 나타내었다. S. aureus와 S. epidermidis 두 균주에서 실험을 실시한 모든 sample은 농도 의존적인 활성을 보여주었다.
- S. aureus의 생장 저해 곡선을 살펴보면 고농도에서는 gentamicin을 단독으로 처리한 실험군이 높은 저해능을 보여주었지만 저농도에서는 급격히 활성이 낮아지는 것으로 확인되었으며 CF와 gentamicin을 병행하여 처리한 실험군에서는 저농도에서도 약 60%의 저해 활성을 나타내었다 (Fig. 1a). HF을 병행 처리한 경우 고농도에서는 CF 병행 처리구보다 높은 저해활성을 보였지만 저농도에서는 약 15%의 저해활성을 나타냄으로서 gentamicin을 단독으로 처리한 실험군보다는 높았지만 CF와 병행 처리한 실험군보다는 낮은 활성을 보여주었다.
- aureus에 높은 항균활성을 보여주었던 EF의 경우gentamicin과의 상승작용은 나타나지 않았다. S. epidermidis에 gentamicin을 1 ㎍/disc의 농도로 처리하였을 때 16.43 ㎜의 생육저해환을 형성하였으며, S. aureus의 결과와 마찬가지로 gentamicin 0.5 ㎍/disc와 HF와 CF을 1 ㎎/disc로 병행하였을 때 25.00 ㎜, 26.70 ㎜의 생육저해환을 형성하면서 상승작용을 보여주었다 (Table 3).
- HF을 병행 처리한 경우 고농도에서는 CF 병행 처리구보다 높은 저해활성을 보였지만 저농도에서는 약 15%의 저해활성을 나타냄으로서 gentamicin을 단독으로 처리한 실험군보다는 높았지만 CF와 병행 처리한 실험군보다는 낮은 활성을 보여주었다. S. epidermidis의 생장 저해 곡선도 S. aureus의 결과와 마찬가지로 저농도의 CF와 gentamicin을 병행 처리하였을 때 약 70%의 저해활성을 보여줌으로써 1.19%의 저해활성을 나타낸 gentamicin 단독 처리군보다 높은 활성을 보여주었다(Fig. 1b).
- 89%의 세포 생존율을 나타냄으로써 gentamicin을 단독 처리한 실험군보다 높은 세포 생존율을 보여줌으로써 세포 생장을 촉진하는 결과를 확인할 수 있었다. 또한 CF을 2 ㎎/㎖ 이하의 농도로 gentamicin 1 ㎎/㎖과 병행하여 처리하였을 때, 76.44 - 99.56%의 세포 생존율을 나타냄으로써 우려할 만한 독성을 나타내지는 않았다. 하지만 CF을 10 ㎎/㎖의 농도로 gentamicin 1 ㎎/㎖ 과 병행하여 처리하였을 때, 50.
- aureus의 생장에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해 broth dilution assay를 이용하여 항균활성을 측정한 결과 CF을 항생제와 병행하여 처리하였을 때 두 균 모두 낮은 농도에서도 균의 생장을 유의적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 MTT assay를 이용하여 참소리쟁이 뿌리 70% EtOH 추출물과 분획과 상용 항생제인 gentamicin(1 ㎎/㎖)을 병행하여 처리하였을 때 세포독성을 확인한 결과, HF와 CF를 2 ㎎/㎖ 이하의 농도로 처리하였을 때에는 우려할 만한 독성은 없는 것으로 확인되었다. 하지만 CF를 10 ㎎/㎖의 고농도로 처리하였을 때 50.
- , 2011). 분획의 경우 58.13%로 aqueous 분획(AF)이 가장 높은 분획수율을 나타내었으며, HF, CF, EtOAc 분획(EF), BuOH 분획 (BF)은 각각 3.56%, 2.45%, 10.54%, 25.33%의 분획수율을 보여주었다.
- 우수한 항생제 증강 효과를 나타내었던 HF과 CF이 S. epidermidis와 S. aureus의 생장에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해 broth dilution assay를 이용하여 항균활성을 측정한 결과 CF을 항생제와 병행하여 처리하였을 때 두 균 모두 낮은 농도에서도 균의 생장을 유의적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 MTT assay를 이용하여 참소리쟁이 뿌리 70% EtOH 추출물과 분획과 상용 항생제인 gentamicin(1 ㎎/㎖)을 병행하여 처리하였을 때 세포독성을 확인한 결과, HF와 CF를 2 ㎎/㎖ 이하의 농도로 처리하였을 때에는 우려할 만한 독성은 없는 것으로 확인되었다.
- 80%의 세포 생존율을 나타냄으로써 세포의 생장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 참소리쟁이 뿌리는 항생제 보조제로서의 활용 가치가 높은 것으로 생각되었다.
- 참소리쟁이 뿌리 70% EtOH 추출물 및 분획과 상용 항생제인 gentamicin의 항생제 증강 효과를 그람 음성 세균인 S. aureus와 S. epidermidis에서 disc diffusion assay를 이용하여 확인한 결과, 두 균 모두 추출물과 분획을 단독으로 처리하였을 때에는 CF과 EF이 높은 항균활성을 보여주었지만, gentamicin을 병행하여 처리하였을 때에는 HF과 CF에서 높은 항생제 증강 효과를 나타내었다.
- 참소리쟁이 뿌리 추출물 및 분획과 상용 항생제중 하나인 gentamicin을 병행하여 처리하였을 때 항균효과의 변화를 비교한 결과, S. aureus의 경우 gentamicin을 0.5 ㎍/disc의 농도로 단독 처리하였을 때 19.13 ㎜의 생육저해환을 형성하였으나, gentamicin 0.5 ㎍/disc와 HF와 CF을 1 ㎎/disc의 농도로 병행 처리하였을 때 각각 30.37 ㎜, 35.70 ㎜의 생육저해환을 형성하여 gentamicin을 단독으로 처리하였을 때보다 약 1.5 - 2 배 정도 더 높은 항균활성을 나타내었다 (Table 3). 하지만 S.
- 또한 MTT assay를 이용하여 참소리쟁이 뿌리 70% EtOH 추출물과 분획과 상용 항생제인 gentamicin(1 ㎎/㎖)을 병행하여 처리하였을 때 세포독성을 확인한 결과, HF와 CF를 2 ㎎/㎖ 이하의 농도로 처리하였을 때에는 우려할 만한 독성은 없는 것으로 확인되었다. 하지만 CF를 10 ㎎/㎖의 고농도로 처리하였을 때 50.80%의 세포 생존율을 나타냄으로써 세포의 생장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 참소리쟁이 뿌리는 항생제 보조제로서의 활용 가치가 높은 것으로 생각되었다.
- 56%의 세포 생존율을 나타냄으로써 우려할 만한 독성을 나타내지는 않았다. 하지만 CF을 10 ㎎/㎖의 농도로 gentamicin 1 ㎎/㎖ 과 병행하여 처리하였을 때, 50.80%의 세포 생존율을 보여줌으로써 세포의 생장을 저해시키는 것으로 확인되었다.
- 96%로 세포독성이 있음을 확인할 수 있었다. 항생제 증강 효과가 우수하였던 HF을 2 ㎎/㎖ 이하의 농도로 gentamicin 1 ㎎/㎖과 병행하여 처리하였을 때, 100.84 - 112.89%의 세포 생존율을 나타냄으로써 gentamicin을 단독 처리한 실험군보다 높은 세포 생존율을 보여줌으로써 세포 생장을 촉진하는 결과를 확인할 수 있었다. 또한 CF을 2 ㎎/㎖ 이하의 농도로 gentamicin 1 ㎎/㎖과 병행하여 처리하였을 때, 76.
후속연구
- 시료의 특성상 여러 활성 성분의 복합적인 작용으로 정확한 메카니즘을 확인하기에는 어려움이 있으므로 추가적으로 물질분리 및 정제를 통해 활성 성분을 규명하고 활성 메카니즘을 연구함으로써 천연 항균 소재로 개발할 수 있을 것으로 생각되었다.
- EF의 항균 효과를 나타내는 물질과 HF와 CF의 항생제 증강효과를 나타내는 물질이 다르다는 것을 확인 할 수 있었으며, 이러한 결과는 용매의 극성에 따른 분리로 인한 시료 간 활성 성분의 차이로 인해 나타나는 결과로 판단되었다. 추후 연구 진행 시 물질 분리 및 정제를 통해 항균 효과와 항생제 증강효과를 나타내는 물질을 규명한다면 새로운 항균 물질 개발이 가능할 것으로 생각되었다.
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