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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내 적송에서 추출한 PineXol®을 이용하여 Aβ25-35에 노출된 PC-12 신경세포에서 세포독성과 단백질 발현을 확인함으로써 퇴행성 질환의 억제 활성을 구명하고자 하였다.
- 백서의 부신피질 크롬친화성 세포종(pheochromocytoma)인 PC-12 신경세포에서 알츠하이머병의 원인으로 알려진 신경 독소 단백질인 Aβ에 의한 세포 독성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 PineXol®이 신경보호 효과가 있다는 선행연구결과를 토대로, 백서의 부신피질 크롬친화성 세포종인 PC-12 신경세포에서 Aβ25-35로 유도된 세포자멸사를 통하여 PineXol®의 보호효과를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 의 농도가 10, 20, 30, 40, 그리고 50 μM인 배양액에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 배양된 후 CCK-8 assay kit 용액을 첨가하고, 2시간 후 microplate reader를 사용하여 흡광도(450 nm)를 측정하였으며, 측정된 값은 비처리군 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
- Aβ25-35 처리에 따른 PC-12 신경세포의 세포 생존율을 측정하기 위해서 96-well plate에 8×103 cells/well의 농도로 각각 세포를 분주한 후, Aβ25-35 의 농도가 10, 20, 30, 40, 그리고 50 μM인 배양액에서 24시간동안 배양하였다.
- Aβ25-35 처리에 따른 PineXol®의 보호효과를 확인하기 위하여, Aβ25-35 30 μM의 처리하기 2시간 전 PineXol® 100 μg/mL를 처리하였으며, 이 후 Aβ25-35 30 μM을 24시간 처리 후 CCK-8 assay을 이용하여 측정한 결과는 Fig. 3과 같다.
- Aβ25-35 처리에 의한 PC-12 신경 세포사의 양상을 규명하기 위해 광학 현미경을 통해 세포의 외형적 변화와 핵 형태의 변화를 관찰하였다(Fig. 4).
- PC-12 신경세포에 PineXol®과 Aβ25-35을 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 걷어내고 DPBS로 2회 세척을 하였으며, 단백질 추출액을 첨가한 후, 4℃에서 30분 동안 처리하였다.
- PC-12 신경세포에 PineXol®을 2시간동안 전처리시킨 후 Aβ25-35를 30 μM의 농도로 처리하여 24시간 배양한 후, Cytotoxicity LDH assay kit(Dojindo Co., LTD, Japen)를 사용하여 흡광도(490 nm)를 측정한 후 세포막 손상을 확인하였다.
- PineXol®의 총 폴리페놀 함량의 측정은 Folin-Ciocalteu method(Maksimović 2005 등)의 방법을 변형하여 측정하였다.
- PineXol®의 총 플라보노이드 함량의 측정은 p-dimethylaminocinnamaldehyde(DMACA) 방법(Drosou 2015 등)을 변형하여 측정하였다.
- Western blot의 밴드는 Bio-1D(VILBER Lourmat SAS, Marne-la-Vallée., France)를 이용하여 관찰하였다.
- 이 후 추출된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였으며, PVDF membrane에 전이시켰다. 그 다음 5% fat-free milk로 전처리하고, 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-SOD-1)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, ECL western blotting detection reagent(iNtRON Biotechinology Co., Ltd, Korea)를 이용하여 목적 단백질을 검출하였다. Western blot의 밴드는 Bio-1D(VILBER Lourmat SAS, Marne-la-Vallée.
- 즉, PineXol® 10 mg/mL의 농도로 제조한 시료 10 mL에 DMACA 시약 200 mL를 첨가하고, 잘 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 반응이 완료된 시료의 흡광도를 640 nm에서 측정하였고, 총 플라보노이드 함량 분석은 카테킨(catechin)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 구하였다.
- 본 실험에서 사용한 Aβ25-35를 PC-12 신경세포에 24시간 처리 후 CCK-8을 측정한 결과는 Fig. 2와 같으며, 본 연구에서는 Aβ25-35 30 μM의 농도로 PC-12 신경세포에 처리하였다.
- 본 연구에서는 아밀로이드 베타 단백질(Aβ25-35, 30 μM)을 처리하기 2시간 전에 1% FBS가 들어있는 DMEM 배양액으로 교환하였다.
- 9 N Folin-Ciocalteu 시약 50 mL를 넣고 잘 혼합시킨 후, 20% sodium carbonate solution 150 mL를 첨가하여 암실에서 2시간 동안 반응시킨 후 흡광도(750 nm)를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. PineXol®의 총 플라보노이드 함량의 측정은 p-dimethylaminocinnamaldehyde(DMACA) 방법(Drosou 2015 등)을 변형하여 측정하였다.
대상 데이터
- PineXol®은 뉴트라팜(주) (NutraPharm Co., LTD, Gangneung, S. Korea)로부터 제공받아 사용하였으며, Aβ25-35 처리 2시간 전 각각의 농도에 따라서 3차 증류수에 희석한 후, 0.2 μm 실린지 필터를 이용하여 여과 후 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 PC-12 신경세포는 백서의 부신피질 크롬친화성 세포종(pheochromocytoma)으로부터 유래한 세포주로서 한국세포주은행에서 구입하였으며, 콜라겐(collagen)을 코팅한 100mm dish와 96 well plate에 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY)에 10% FBS (Fetal bovine serum)와 1% penicillin과 streptomycin를 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 본 연구에서는 아밀로이드 베타 단백질(Aβ25-35, 30 μM)을 처리하기 2시간 전에 1% FBS가 들어있는 DMEM 배양액으로 교환하였다.
- 이에 본 연구에서는 PC-12 신경세포의 생존에 영향을 끼치지 않는 100 μg/mL의 농도에서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 각 항목에 따라 평균±표준편차로 표시하였다.
- 통계적 분석은 SPSS 20.0 K를 이용하여 one way ANOVA를 시행하였으며, p<0.05의 경우를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- Aβ25-35의 세포독성으로 인하여 PC-12 세포 내 다양한 신호전달이 활성화되는데, 세포자멸사에서 중요한 역할을 하는 Bcl-2 family 단백질의 발현을 Western blot을 통하여 확인하였다(Fig. 6ⓐ).
- The cells were then treated with 30 μM Aβ25-35 for 24 h. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The data shown are means±S.
성능/효과
- Aβ25-35 처리 시 대조군과 비교하여 LDH 방출량이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, PineXol® 100 mg/mL 전처리군의 경우, LDH의 방출량이 대조군보다 높게 측정되었지만, Aβ25-35 처리군보다 낮은 것을 확인할 수 있었다(p<0.05).
- PC-12 신경세포에서 세포자멸사를 유도하기 위해 aging된 Aβ25-35 30 μM을 24시간 처리한 결과, 세포 생존율에서 대조군과 유의적인 감소가 나타나는 것을 CCK-8 assay를 통하여 확인하였으며, PineXol® 100 μg/mL 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 세포 생존율에서 유의적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
- PineXol® 농도 100~1,000 μg/mL에서 세포 생존율을 확인해 본 결과, 200 μg/mL에서부터 PC-12 신경세포의 생존율이 대조군과 비교 시 유의적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며(p<0.05), 1,000 μg/mL의 농도에서는 세포 생존율이 42%까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- PineXol® 전 처리에 따른 PC-12 신경세포에서 세포막 보호 효과를 확인하였다.
- 그 결과, PineXol® 전처리군의 경우, PC-12 세포사를 Aβ25-35 처리군과 비교 시 27%가량 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(p<0.05).
- 단백질 발현을 확인해본 결과, PineXol® 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 Bcl2 단백질의 발현은 높았으며, Bax의 단백질 발현은 보다 낮게 나타났다.
- 더욱이 세포자멸사를 촉진시키는 Bax 단백질의 경우, PineXol® 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 (Fig. 6ⓒ), 체내 활성 산소를 제거한다고 알려진 sod-1 단백질의 경우, PineXol® 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 높은 단백질 발현 양상을 보였다(Fig. 6ⓓ).
- 또한, PineXol® 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 LDH 방출량이 유의적으로 낮은 것으로 확인되었으며, 이는 Aβ25-35에 의해 유발된 신경세포막 손상으로부터 PineXol®이 가지고 있는 생리활성 물질들로 인해서 세포막 보호효과를 가졌을 것으로 사료된다.
- 본 연구에 사용된 PineXol®의 총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량은 각각 829.84±5.36 GAE mg/g과 86.71±0.44 CAT mg/g으로 확인되었다(Table 1).
- 세포 자멸사를 억제하는 Bcl-2 단백질 발현은 대조군과 비교 시 Aβ25-35 처리군에서 감소를 보였으며, PineXol® 전처리군에서는 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6ⓑ).
- 세포의 형태학적 관찰 결과, PineXol®을 전처리군에서는 Aβ25-35처리군에서 나타나는 세포의 모습인 신경돌기의 소실이 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다.
- 특히 항산화와 관련 단백질인 Sod-1 단백질의 발현이 높은 것으로 확인됨으로써, PineXol®이 가진 활성물질들로 인하여 Aβ25-35 신경 독성 물질로부터 신경세포의 손상을 억제하고, 신경세포를 보호하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이에 PineXol®이 가진 페놀성 화합물로 인하여 Aβ25-35에 처리에 따른 세포 독성에 보호효과가 있을 것으로 기대된다.
- 이와 같은 결과로 볼 때, 신경질환의 약용 후보물질로서 PineXol®의 유용한 가능성을 제시할 수 있다고 판단된다.
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