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문제 정의
- 그러 나 현재까지 곤달비에 의한 항비만 및 항산화 효과에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내 자생 식물인 곤달비의 과학적인 기초자료 확보 및 생리활성을 알아보기 위해 항산화 및 지방세포 분화 억제에 대한 실험 을 진행하였다.
- 본 연구에서는 곤달비 추출물의 항산화 및 항비만 효과에 대한 연구를 위해 총 폴리페놀 함량, 항산화 활성 및 지방전 구세포의 지방구 형성에 미치는 영향을 알아보았다. 곤달비 추출물의 폴리페놀 함량은 55.
- 따라서 지방구 형성과 관련이 있는 PPARγ, C/EBPα, aP2 등의 발현을 억제하여 비만을 조절하기 위한 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Yun JW 2010). 이에 본 연구에서는 곤달비 추출물이 지방세포분화 전사인자의 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보았다. Fig.
제안 방법
- 3T3-L1 cell 을 6 well plate에 1×105 cell/well의 농도로 seeding하고, 100% confluency 상태에 도달하면 2일 후에 1 μg/mL insulin, 0.5 mM IBMX, 1 μM dexamethasone을 포함한 10% FBS-DMEM 을 사용하여 이틀간 분화유도를 시켰다.
- DPPH radical에 대한 곤달비 추출물의 환원력을 측정하기 위해 DMSO에 녹여 농도별로 희석한 희석액과 에탄올에 녹인 0.2 mM DPPH를 가하여 암소에서 30분 방치한 후 ELISA reader기를 통해 520 nm에서 흡광도를 측정하였다(Blois MS 1958). 또한, 7 mM ABTS와 2.
- PPARγ 및 aP2 1차 항체를 각각 1,000:1의 비율로 상온에서 1시간 동안 부착시켰고, TBST를 이용하여 5분간 3회 세척하였다.
- Preadipocyte에서 곤달비 추출물의 지방세포 분화억제 활성을 시험하기 위해 세포 내 지방구의 함량을 측정하였다. 3T3-L1 preadipocyte는 48 well cell culture plate에 6일간 분화 시켜 배지를 제거한 후, PBS를 이용하여 2회 세척하였다.
- Well당 20 μL의 MTT 용액을 첨가하여 5% CO2, 37℃ incubator에서 4시간 동안 반응시킨 후 배지를 제거하고, 생성된 formazan crystal을 DMSO 에 녹여 ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정 하였다.
- 곤달비 추출물의 3T3-L1세포에서의 독성은 MTT를 실시 하여 알아보았다. 실험결과는 Fig.
- 곤달비 추출물의 항산화력은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 실험을 통해 측정하였다. 곤달비 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 Fig.
- Cho 등(2015)의 연구에서는 국내 산림식물들의 폴리페놀 함량과 항산화 활성은 높은 연관성을 보이고 있음을 보 고하였다. 따라서 다음 실험으로 곤달비 추출물의 라디칼 소 거능과 환원력을 측정하였다.
- 2 mM DPPH를 가하여 암소에서 30분 방치한 후 ELISA reader기를 통해 520 nm에서 흡광도를 측정하였다(Blois MS 1958). 또한, 7 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulphate를 최종 농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+․을 형성시킨 후 실험에 사용하였다. 희석된 용액 에 추출물을 가하여 30분 동안 암소에 방치한 후, ELISA reader기를 통해 735 nm에서 흡광도를 측정하였다(Re 등 1999).
- 이틀 후 1 μg/mL insulin이 포함된 10% FBS가 첨가된 DMEM을 사용하여 48시간 동안 분화유도를 시켰다.
- 이틀 후 1 μg/mL insulin이 포함된 10% FBS가 첨가된 DMEM을 사용하여 48시간 동안 분화유도를 시켰다. 이틀이 지난 후 10% FBS 배지로 교체하여 48시간동안 지방구를 성숙시켰다.
- 정량한 단백질은 protein marker(Bioprince-Korea, Seoul, Korea)와 함께 12% running gel과 5% stacking gel에 80 μg 를 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 실시하였다.
- 염색이 끝난 후 1차 증류수를 이용해 2회 세척한 후 완전히 건조시켰다. 현미경을 이용해 염색된 세포를 관찰한 후, isopropanol을 이용해 녹인 다음 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 2. 곤달비 추출물의 제조 실험에 사용된 곤달비는 2015년 7월 부산광역시 대형마트 에서 구입하였으며, 동결 건조시킨 후 분쇄하였다. 곤달비 분말은 20배 부피에 해당하는 100% 메탄올을 이용해 실온에서 18시간 동안 추출하였다.
- Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), phosphate buffered saline(PBS), fetal bovine serum(FBS), bovine serum(BS), trypsin-EDTA 및 penicillin-streptomycin은 GIBCO사(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 3T3-L1 cell은 ATCC(CL-193, Manassas, VA, USA)에서 분양 받았으며, 10% BS가 함유된 DMEM을 이용 하여 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 3T3-L1 cell 을 6 well plate에 1×105 cell/well의 농도로 seeding하고, 100% confluency 상태에 도달하면 2일 후에 1 μg/mL insulin, 0.
- 실험에 사용된 곤달비 메탄올 추출물의 수율은 10.97%이 었다. 식물계에 널리 분포되어 있는 phenolic acid, flavonoids, tannin 등을 포함하는 폴리페놀은 다수의 히드록실기(-OH)를 보유하고 있는 구조적 특징을 가지고 있다.
- 항산화력 측정에 사용한 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di-phenyltetrazolium bromide(MTT), catechin, α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2'azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), Folin-Ciocalteu's reagents은 Sigma사(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) 에서 구입하였고, gallic acid는 Santa Cruz사(Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 SASTM(ver 9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 사용하여 평균과 표준편차(SD) 또는 표준오차(SE)를 산출하였고, Duncan’s multiple range test를 이 용하여 p<0.05 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 곤달비 메탄올 추출물을 통한 지방 분화와 관련된 PPARγ 및 aP2 단백질의 발현 정도를 알아보기 위해 western blot 을 실시하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Folin & Denis 1912)을 응용하여 측정하였다.
성능/효과
- 08%의 소거능을 보였다. 곤달비 메탄올 추출물의 자유라디칼 소거활성은 ABTS 라디칼의 소거활성이 DPPH 라디칼 소거활성보다 높게 나타났음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 자유 라디칼인 DPPH와 양이온 라디칼인 ABTS 라디칼의 차이로 인해 이들과 결합하는 페놀물질의 종류가 다름에 따라 라디칼의 제거능력의 차이가 발생한 것으로 사료되어진다(Wang 등 1998).
- 곤달비 추출물 처리 농도가 가장 낮은 500 μg/ mL에서 16.81%의 소거 활성을 보였으며, 가장 높은 농도인 2,000 μg/mL에서는 71.08%의 소거능을 보였다.
- 2B와 같이 나타났다. 곤달비 추출물을 처리하지 않을 경우, 3T3-L1 세포에 지방구 형성이 증가한 것을 알 수 있으며, 곤달비 추출물의 농도가 증가함에 따라 지방구 형성이 억제되는 경향을 보였다. 곤달비 추출물의 농도가 가장 높은 200 μg/mL의 처리구에서 곤달비 추출물을 처리하지 않고 분화를 유도한 대조군에 비해 약 26%까지 지 방구의 형성을 억제하는 것으로 나타났다.
- 곤달비 추출물의 농도가 가장 높은 200 μg/mL의 처리구에서 곤달비 추출물을 처리하지 않고 분화를 유도한 대조군에 비해 약 26%까지 지 방구의 형성을 억제하는 것으로 나타났다.
- 곤달비 추출물의 농도가 높아짐에 따라 라디칼의 소거 활성이 증가하였고, 실험에 사용된 가장 높은 농도(1,000 μg/mL)에서는 88.29%의 라디칼 소거능을 보였다.
- 1B와 같이 나타났다. 곤달비 추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거활성은 농도의존적인 증가를 보였다. 곤달비 추출물 처리 농도가 가장 낮은 500 μg/ mL에서 16.
- 이러한 구조적 특징에 의해 다양한 화합물과의 결합이 용이하며, 항산화, 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Scalbert & Williamson 2000; Dai & Muper 2010). 곤달비 추출물의 총 폴리페놀 함량 은 gallic acid를 표준물질로 사용하여 나타내었을 때 55.950 mg GAE/g residue로 나타났다(Table 1). 이는 Ahn 등(2015)의 연구에서 보고한 삼나물, 미역취, 다래순, 방풍나물, 참나물과 같은 산채들의 총 폴리페놀 함량과 유사한 수준의 함량을 보였다.
- 본 연구에서는 곤달비 추출물의 항산화 및 항비만 효과에 대한 연구를 위해 총 폴리페놀 함량, 항산화 활성 및 지방전 구세포의 지방구 형성에 미치는 영향을 알아보았다. 곤달비 추출물의 폴리페놀 함량은 55.950 mg GAE/g residue로 나타 났으며, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능이 우수하였다. 곤달비 추출물의 reducing power는 258.
- 따라서 본 연구를 통해 곤달비 추출물은 3T3-L1 세포 에서 지방세포분화 전사인자인 PPARγ의 발현을 감소시킴으 로써 지방구의 형성을 감소시켰고, 지방세포로의 분화가 억제되어 aP2의 발현 또한 감소한 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 이는 PPARγ 등의 지방세포분화 전사인자와 aP2와 같은 지방세포의 특징을 나타내는 단백질의 발현이 감소하면서 지방구의 축적이 억제 된 것으로 나타났다. 그러므로 우리나라에서 나물로 섭취하 는 곤달비는 항비만 효과가 뛰어날 것으로 생각되며, 비만을 비롯한 만성 질환 예방을 위한 기능성 식품의 원료로 활용될 수 있을 것으로 여겨진다
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