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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 유기농 치즈 부산물을 활용한 기능성 바이오 소재 개발을 위하여 endo type 및 exo type 효소의 최적 가수분해 조건을 선정함으로써, 유청 단백 가수분해물을 통한 고부가가치 식품기술 개발 및 적용의 기초 자료를 제공하고자 한다.
- 본 연구에서는 유기농 치즈 부산물을 활용하기 위하여endo type 및 exo type 효소의 최적 가수분해 조건을 선정하고자 하였다. 유청 단백 가수분해를 위한 endo type 효소 4종, alcalase, neutrase, protamex, foodpro alcaline protease 및 exo type 효소 2종, flavourzyme, prozyme 2000P을 사용하여 최적기질농도와 최적 효소 비율을 측정하였고, 가수분해정도는 액체크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
제안 방법
- 교반기를 이용하여 교반하였으나, 10% 이상의 기질 농도에서는 효소 반응을 할 수 없을 정도로 용해 물성이 좋지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 효소 반응을 위해서는 10% 이상의 기질 농도는 적합하지 않으므로, 10% 기질 농도를 대상으로 최적의 효소 비율을 결정하기 위한 실험을 진행하였다. Alcalse 효소 반응을 통하여 생리활성 가수분해물을 제조한 Zhu 등(2006)의 연구에서도 유청단백 기질의 농도를 10%로 하여 유청 단백 가수분해물의 항산화력을 측정한 것으로 보나(Zhu 등 2006), 10% 기질 농도를 최적 기질 농도로 선정하는 것에 무리가 없다고 판단하였다.
- 선발된 효소는 식품가공에 사용할 수 있는 효소들로 식품공전, 식품첨가물공전 등 국내법에 근거하여 선별하였으며, 안정적인 공급이 가능한 제조사의 제품으로 선별하였다. 또한, 효소의 활성과 수율 및 생산성을 고려하여 열 안정성 및 pH 안정성과 같이 효소의 기초적인 특징을 고려하여 선별하였다.
- 2%로 조정하였고, 반응온도 50℃로 설정하여 1차 반응시간 4시간, 2차 반응시간은 10시간으로 설정하여 반응을 수행하였다. 반응완료 후 가수분해 정도를 측정하여 최적 효소 비율을 선정하였다.
- 본 연구에서는 유기농 치즈 부산물을 활용하기 위하여endo type 및 exo type 효소의 최적 가수분해 조건을 선정하고자 하였다. 유청 단백 가수분해를 위한 endo type 효소 4종, alcalase, neutrase, protamex, foodpro alcaline protease 및 exo type 효소 2종, flavourzyme, prozyme 2000P을 사용하여 최적기질농도와 최적 효소 비율을 측정하였고, 가수분해정도는 액체크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 1차효소 반응을 통한 최적의 endo type 효소는 alcalse로 선정하였고, 2차 효소 반응 결과, exo type 효소로는 flavourzme으로 선정하였다.
- licheniformis 유래 foodpro alcaline protease(DuPont Industrial Biosciences, Wilmington, DE, USA) 등 4종을 이용하여 반응 시간에 따른 pH 변화를 측정하였다. 즉, 앞서 제조한 유청 단백 가수분해물 slurry에 각각의 endo type 가수분해효소를 기질농도 대비 2%(w/v)를 첨가하여 반응온도 50~55℃에서 10시간 동안 반응하여 pH를 측정하였다.
- 최적의 기질농도를 설정하기 위하여 50℃ 온도의 정제수에 유청 단백을 10, 20 및 30%(w/v)의 농도가 되도록 하여 1시간 동안 200~300 rpm 조건에서 교반하였다. 그리고 선정한 최적 기질농도(10%, w/v)를 통해 최적 효소 비율을 설정하였다.
- 본 실험에 사용한 유청단백질은 (주)네오크레마에서 제공받아 사용하였다. 치즈부산물로부터 분리된 유청 단백을 가수분해하기 위한 효소를 선별하기 위하여 특성이 다른 2가지, endo type과 exo type의 효소를 탐색하였다. Endo type protease 3종과 exo type protease 효소 2종을 선별하여 endo-exo 효소의 순서로 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 유청단백질은 (주)네오크레마에서 제공받아 사용하였다. 치즈부산물로부터 분리된 유청 단백을 가수분해하기 위한 효소를 선별하기 위하여 특성이 다른 2가지, endo type과 exo type의 효소를 탐색하였다.
- Endo type protease 3종과 exo type protease 효소 2종을 선별하여 endo-exo 효소의 순서로 실험을 수행하였다. 선발된 효소는 식품가공에 사용할 수 있는 효소들로 식품공전, 식품첨가물공전 등 국내법에 근거하여 선별하였으며, 안정적인 공급이 가능한 제조사의 제품으로 선별하였다. 또한, 효소의 활성과 수율 및 생산성을 고려하여 열 안정성 및 pH 안정성과 같이 효소의 기초적인 특징을 고려하여 선별하였다.
- 유기농 치즈부산물로부터 분리된 유청 단백(whey protein)을 50℃정도의 정제수에 10%(w/w) 되도록 녹여 slurry를 제조하였다. 온도를 80~85℃까지 승온하면서 NaOH를 이용하여 pH 8.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS program(ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계 처리하였으며, 모든 측정 항목에 대한 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)를 산출하였다. 실험군 간의 유의성은 ANOVA test 후, 구체적인 사후검증은 p<0.
- , Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계 처리하였으며, 모든 측정 항목에 대한 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)를 산출하였다. 실험군 간의 유의성은 ANOVA test 후, 구체적인 사후검증은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 실시하였다.
이론/모형
- 가수분해 반응 종료 후의 가수분해도는 액체크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 분석에 사용한 column은 내경 7.
성능/효과
- 1차 효소 반응 실험 결과를 토대로 선정한 alcalase를 유청가수분해물 slurry에 첨가하여 50~55℃에서 4시간 동안 반응시킨 효소분해 1차 산물을 대상으로 2차 효소 반응 실험을 한 결과, flavourzyme이 prozyme 2000P보다 우수한 가수분해활성을 나타냈다(Fig. 2).
- 유청 단백 기질 농도에 따라 용해한 액상을 확인한 결과(Fig. 3), 농도가 20 및 30%인 농도에서는 유청 단백질의 응집이 발생하는 것을 확인하였다. 교반기를 이용하여 교반하였으나, 10% 이상의 기질 농도에서는 효소 반응을 할 수 없을 정도로 용해 물성이 좋지 않음을 확인할 수 있었다.
- 3), 농도가 20 및 30%인 농도에서는 유청 단백질의 응집이 발생하는 것을 확인하였다. 교반기를 이용하여 교반하였으나, 10% 이상의 기질 농도에서는 효소 반응을 할 수 없을 정도로 용해 물성이 좋지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 효소 반응을 위해서는 10% 이상의 기질 농도는 적합하지 않으므로, 10% 기질 농도를 대상으로 최적의 효소 비율을 결정하기 위한 실험을 진행하였다.
- 유청 단백 가수분해를 위한 endo type 효소 4종, alcalase, neutrase, protamex, foodpro alcaline protease 및 exo type 효소 2종, flavourzyme, prozyme 2000P을 사용하여 최적기질농도와 최적 효소 비율을 측정하였고, 가수분해정도는 액체크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 1차효소 반응을 통한 최적의 endo type 효소는 alcalse로 선정하였고, 2차 효소 반응 결과, exo type 효소로는 flavourzme으로 선정하였다. 최적의 1차와 2차 효소 반응을 위한 유청 단백 기질의 농도는 10%로 나타났다.
- 2%의 비율로 나타났으며, 이는 alcalase 2%, flavourzyme 1% 가수분해물에 비하여 저분자량의 크로마토그래피 페턴을 나타냈다. 따라서, 10%의 유청단백 기질농도에 endo type 효소인 alcalase를 0.5%의 농도로 10시간 동안 가수분해한 후, exo type 효소인 flavouryme을 0.2%의 농도로 4시간 동안 가수분해하는 것이 최적 조건이라고 판단하였으며, 이는 산업적으로 유기농 치즈 부산물을 이용하여 기능성 바이오 소재를 개발 및 적용하기 위한 유용한 정보가 되리라고 사료된다. 또한, 최적 조건에서 최적 효소에 의해 생성된 가수분해물의 분자량별 정제 연구가 필요할 것이라고 판단된다.
- 선정한 4개의 효소 중에서 alcalase는 반응시간 2시간이 되는 시점까지 pH가 가장 빠른 속도로 감소하는 것으로 나타났고, 그 이후 시간부터는 반응 종료 시점까지 일정 pH가 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 반응속도가 빠르게 진행됨에 따라 가수분해 정도가 증가되어 분해된 펩타이드에 의하여 pH가 감소할 수 있음을 알 수 있다.
- 또한, endo type 효소 중에서는 alcalse를 반응시켰을 때, 저분자량의 가수분해물이 생성된다고 보고하였다. 이와 같은 결과와 다른 연구자들의 보고 내용을 종합하여 고려하였을 때, alcalse와 flavouryme를 가수분해 최적 효소로 선정한 것이 바람직하다고 판단된다.
- 그 결과, 1차효소 반응을 통한 최적의 endo type 효소는 alcalse로 선정하였고, 2차 효소 반응 결과, exo type 효소로는 flavourzme으로 선정하였다. 최적의 1차와 2차 효소 반응을 위한 유청 단백 기질의 농도는 10%로 나타났다. 또한, 최적 효소 비율은 alcalase 0.
- 2와 유사하게 나타났다. 효소 농도에 따른 pattern을 보면 농도에 따른 pattern 차이가 크지 않으며, alcalase 2%, flavouryme 1%의 가수분해 결과보다 alcalase 0.5%, flavouryme 0.2%의 가수분해 결과에서 retention time, 30분 이후의 저분자량이 더 많음을 알 수 있다. 효소의 농도에 따른 가수분해 정도가 유의적으로 큰 차이를 보이지 않았고, 식품산업에 응용하기 위한 가공비와 생산성을 고려한다면 alcalase와 flavourzyme을 각각 기질 대비 0.
- 2%의 가수분해 결과에서 retention time, 30분 이후의 저분자량이 더 많음을 알 수 있다. 효소의 농도에 따른 가수분해 정도가 유의적으로 큰 차이를 보이지 않았고, 식품산업에 응용하기 위한 가공비와 생산성을 고려한다면 alcalase와 flavourzyme을 각각 기질 대비 0.5%와 0.2%로 선정하는 것이 최적 효소 비율이라고 판단하였다.
후속연구
- 2%의 농도로 4시간 동안 가수분해하는 것이 최적 조건이라고 판단하였으며, 이는 산업적으로 유기농 치즈 부산물을 이용하여 기능성 바이오 소재를 개발 및 적용하기 위한 유용한 정보가 되리라고 사료된다. 또한, 최적 조건에서 최적 효소에 의해 생성된 가수분해물의 분자량별 정제 연구가 필요할 것이라고 판단된다.
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