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문제 정의
- 본 연구의 목적은 원유로부터 유청 단백질인 α-LA, β-LG과 BSA을 분리하고 alcalase 효소를 이용하여 가수분해시킨 후 생성되는 peptide의 양상을 조사하고, 향후 생성된 peptide의 다양한 생리활성 기능을 연구하기 위한 기초 자료를 제공하는데 있다.
제안 방법
- 50% ammonium sulfate를 처리하여 얻은 상등액을 Mono-Q 5/50 GL column을 이용하여 linear gradient anion-exchange chromatography를 수행하여 BSA와 β-LG을 분리하였다.
- Fig. 1의 lane 3에서 peak ②는 BSA와 β-LG이 혼합되어 있는 것으로 확인되어 ②를 회수하여 Anion-exchange chromatography(segmented gradient)를 수행했다.
- 1의 lane 3에서 peak ②는 BSA와 β-LG이 혼합되어 있는 것으로 확인되어 ②를 회수하여 Anion-exchange chromatography(segmented gradient)를 수행했다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 Mono-Q 5/50 GL column을 이용하여 anion exchange chromatography(A)를 수행하여 분리하였다. Anion exchange chromatography를 수행한 결과는 step gradient에서 0.
- Fig. 3에서 보는 바와 같이 50% ammonium sulfate를 처리하여 얻은 상등액을 Mono-Q 5/50 GL column을 이용하여 anion-exchange chromatography를 수행하여 BSA와 β-LG을 분리하였다.
- 4 M NaCl에서 peak가 보이지 않았다. 따라서 0.2 M NaCl에서 peak ① ②로 분리된 것을 단일 peak로 분리하기 위해서 linear gradient를 실시하였다. Fig.
- 또한 Hi Prep 26/60 Sephacryl S-100 column gel filtration chromatography에서 BSA와 β-lactoglobulin이 혼합되어 있는 분획을 Mono-Q 5/50 GL column anion exchange chromatography를 수행하여 BSA를 분리하였다.
- 분리된 유청 단백질, α-LA, β-LG, BSA를 40℃에서 alcalase로 180분 동안 가수분해시키고 분해된 산물을 tricine gel을 사용하여 전기영동을 하였고 HPLC로 분해 양상을 관찰하였다.
- 6으로 조절하고 16,000×g에 15분 동안 원심분리 하여 casein과 유청으로 분리하였다. 분리된 유청을 분자량 10,000 dalton인 투석막으로 24시간 투석하여 유당과 무기물 성분을 제거하고 동결 건조하여 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 원유 1 리터로부터 동결 건조하여 5.
- 분리한 유청 단백질을 50% amonium sulfate 처리하여 침전물과 상등액으로 분리하고, 침전물은 Hi Prep 26/60 Sephacryl S-100 column gel filtration chromatography 를 이용하여 β-LG과 α-LA을 분리하였다.
- Anion-exchange chromatography 조건은 동결 건조한 유청 분말에 50% ammonium sulfate를 처리하여 4℃ 냉장고에 24시간 방치 후 원심분리하여 침전물과 상징액을 분리하여 동결건조 후 정제에 사용하였다. 상징액은 Mono-Q 5/50 GL column(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 HPLC(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 장치에 장착 후 anion-exchange chromatography를 수행하였다. 정제 조건은 50% ammonium sulfate 처리한 유청 단백질 침전물 10 mg/mL(2 mL)를 주입시키고, NaCl 0.
- 분리된 유청 단백질, α-LA, β-LG, BSA를 40℃에서 alcalase로 180분 동안 가수분해시키고 분해된 산물을 tricine gel을 사용하여 전기영동을 하였고 HPLC로 분해 양상을 관찰하였다. 유청 단백질의 전기영동 패턴의 확인은 Laemmli(1970)의 방법을 변형하여 SDS-PAGE에 의해 측정하였다. SDS-PAGE는 12% acrylamide gel, 10% SDS를 함유한 1.
- 상징액은 Mono-Q 5/50 GL column(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 HPLC(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 장치에 장착 후 anion-exchange chromatography를 수행하였다. 정제 조건은 50% ammonium sulfate 처리한 유청 단백질 침전물 10 mg/mL(2 mL)를 주입시키고, NaCl 0.1, 0.2, 0.3 0.4, 1.0 M step gradient와 0.1~0.25 M linear gradient 두 가지 방법으로 분리하였고, elution buffer는 0.05 M Tris buffer, pH 6.5, 유속은 1 mL/min로 하고, 분획 양은 1 mL/tube로 하였다.
- Gel filtration chromatography 조건은 동결 건조한 유청 분말에 50% Ammonium sulfate를 처리하여 4℃ 냉장고에 24시간 방치 후 원심 분리하여 침전물과 상징액을 분리하여 동결건조 후 정제에 사용하였다. 침전물을 Hi Prep 26/60 Sephacryl S-100 column(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 FPLC 장치에 장착시키고 gel filtration chromatography를 수행하였다. 정제 조건은 50% ammonium sulfate 처리한 유청 단백질 침전물 10 mg/mL(2 mL)를 주입시키고 elution buffer는 0.
대상 데이터
- 유청 단백질의 전기영동 패턴의 확인은 Laemmli(1970)의 방법을 변형하여 SDS-PAGE에 의해 측정하였다. SDS-PAGE는 12% acrylamide gel, 10% SDS를 함유한 1.5 M Tris(pH 8.8)와 0.5 M Tris(pH 6.8),10% ammonium persulfate(APS)를 조제하여 사용하였다. Gel은 0.
- 충남대학교 농업생명과학대학 동물자원연구센터에서 홀스타인 젖소로부터 착유한 신선한 원유를 사용하였다. 신선한 원유 1 L 를 탈지유로 제조한 후에 0.
이론/모형
- β-LG, α-LA과 BSA의 분리 정제는 Neyestani 등(2003)이 제시한 방법으로 수행하였다.
- 2%(w/v) commassie brilliant blue R-250 (Sigma Co, USA)을 함유한 acetic acid/methanol/water(1:1:5, v/v/v)용액으로 염색하였으며, 탈색은 acetic acid/methanol/ water(1:3:6, v/v/v) 용액으로 하였다. Standard marker로는 pre-stained broad range standard (Bio-Rad, USA)를 사용하였다.
성능/효과
- (A)는 단일 peak를 나타내는 반면에 (B)는 β-LG 가수분해물 전체로 다양한 형태의 peak가 나타났음을 알 수 있었고, β-LG 가수분해물의 분자량 3 kD 이상인 (C)는 크고 작은 peak가 여러 개 나타났고, β-LG 가수분해물의 분자량 3 kD 이하인 (D)는 (C)에 비해 peak 수가 적게 나타났는데 β-LG 가수분해물 전체적으로는 다양한 peptide의 생성이 잘 이루어졌다.
- 2에서 보는 바와 같이 Mono-Q 5/50 GL column을 이용하여 anion exchange chromatography(A)를 수행하여 분리하였다. Anion exchange chromatography를 수행한 결과는 step gradient에서 0.1 M NaCl에서 peak ①, 0.2 M NaCl에서 peak ②가 나타났고, 0.3 M NaCl에서 peak 하나, 0.4 M NaCl에서 peak 하나는 아주 약하게 나타났다. 전기영동(B) 결과에 나타난 바와 같이 Lane 1은 50% ammonium sulfate 처리한 침전물로 BSA, β-LG, α-LA 이 주성분을 이루고 있다.
- 대조구인 (A)는 불순물이 거의 없는 단일 peak를 나타내는 반면에 (B)는 BSA 전체 가수분해물로 비슷한 크기의 다양한 peak가 생성되었음을 알 수 있었다. BSA 가수분해물의 분자량 3 kD 이상인 (C)와 BSA 가수분해물의 분자량 3 kD 이하인 (D)는 (B)에 비해 다양한 형태의 peak가 나타난 것으로 보아 분자량이 작은 peptide가 잘 생성된 것으로 확인되었다. Fig.
- 6, 7, 8, 9에 나타난 바와 같다. HPLC 결과를 보면 180분 동안 가수분해 시킨 가수분해물은 대조구에 비해 여러 종류의 peak가 나타남으로써 분자량이 작은 peptide가 많이 생성되었음을 확인 할 수 있었다. Fig.
- 3에서 보는 바와 같이 50% ammonium sulfate를 처리하여 얻은 상등액을 Mono-Q 5/50 GL column을 이용하여 anion-exchange chromatography를 수행하여 BSA와 β-LG을 분리하였다. linear gradient anion-exchange chromatography를 수행한 결과 0.05 M NaCl에서 peak ①, 0.15 M NaCl에서 peak ②, 0.20 M에서 peak ③이 나타났다. 전기영동 결과에 나타난 바와 같이 Lane 1은 50% ammonium sulfate 처리한 침전물로 BSA, β-LG, α-LA이 주성분을 이루고 있다.
- 대조구인 BSA과 β-LG를 비교해 보면 alcalase 효소의 반응시간이 경과하면서 BSA과 β-LG이 잘 분해됨을 알 수 있다.
- 대조구인 유청단백질과 α-LA 를 비교해 보면 alcalase 효소의 반응시간이 경과하면서 유청단백질과 α-LA이 잘 분해됨을 알 수 있다.
후속연구
- 분리된 유청 단백질인 BSA, β-LG과 α-LA은 alcalase 효소처리를 하여 다양한 저분자 peptides를 얻었다. 이러한 결과는 기능성 유제품 개발에 필요한 기초자료 제공과 신제품 개발에 크게 기여 할 것으로 사료된다.
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