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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에서 분리된 E. amylovora 균주들을 이용하여 스트립 형태의 진단키트를 만들고, 이 진단키트와 이미 유럽에서 상용화된 진단키트의 국내 화상병 병원균에 대한 특이성, 민감성을 확인하고, 과수 화상병 발생 현장에서 진단에 적용하여 이들 항혈청 진단 스트립의 과수 화상병의 현장진단에 적용 가능성을 검증하였다.
- 본 연구에서는 병원세균 항혈청을 이용하여 제작한 스트립 형태의 화상병 진단키트의 국내분리 화상병 병원균에 대한 특이성 및 검출민감성을 확인하고, 이 진단키트의 화상병 현장진단 사용 가능성을 조사하였다. Ea AgriStrip과 EB strip은 본 연구에 사용한 모든 Ea 균주에 양성반응을, 모든 Pss 균주에 음성 반응을 보여주었고, 11개의 Ep 균주 중에서 1개 균주가 2가지 스트립에서 다른 반응을 보여주었다.
제안 방법
- Ea AgriStrip 검정은 일회용 플라스틱 큐벳(cuvette)에 세균현탁액 또는 추출액 200 ml을 넣고 스트립을 그 큐벳에 세워 검정 하였고, EB strip의 경우 추출액 100 ml을 스트립의 아래 부분의 시료처리 부위에 점적하여 검정하였다.
- Ea AgriStrip과 EB strip의 국내에서 분리된 화상병균(Ea), 가지검은마름병균(Ep), 그리고 사과나무 가지마름병균(Pss)에 대한 특이성을 세균현탁액을 이용하여 확인하였다.
- EB strip 검정을 위해서는 Gorris 등(1996)의 항산화마쇄완충액(antioxidant maceration buffer)을 사용하였다. NA에서 배양한 세균 콜로니를 추출완충액에 현탁 후 분광광도계를 사용하여 세균의 밀도를 조정한 후 검정에 사용하였다. 병반 시료 중에서 세균 ooze 는 ooze 자체를 일회용 플라스틱 스틱 백금이로 얻어 추출완충액에 현탁하여 검정에 사용하였다.
- Ea AgriStrip 검정은 일회용 플라스틱 큐벳(cuvette)에 세균현탁액 또는 추출액 200 ml을 넣고 스트립을 그 큐벳에 세워 검정 하였고, EB strip의 경우 추출액 100 ml을 스트립의 아래 부분의 시료처리 부위에 점적하여 검정하였다. 검정 시작 후 각 스트립의 control line과 test line에 반응밴드가 나타나는지 관찰하고, 검정 30분 후 최종 판정하였다.
- 4 ml, Agar 15 g/l)에 그어 배양하였다. 그 후 Ea 또는 Ep와 유사한 콜로니로부터 세균을 얻어 Ea 특이 프라이머인 PEANT1/2 (Powney 등, 2011)와 Ep 특이 프라이머인 EpSPF/EpSPR (Shrestha 등, 2007)를 이용한 PCR을 수행하여 동정하였다.
- 농촌진흥청 국립농업과학원 농산물안전성부 작물보호과로부터 화상병이 확진된 직후 통보를 받아 매몰 전에 해당 과수원을 방문하여 현장진단을 수행하였다. 현장진단을 수행한 과수원 및 수행한 날짜는 Table 3에 정리되어 있다.
- 1). 또한 비교하기 위해 병징을 보이지 않은 건전한 나무의 신초가지나 줄기를 채취하였다. 2016년 12월 21일에 수행한 세종시 부강면의 과수원의 경우 화상병 발생 의심신고가 접수되어 화상병 발생이 확진되기 전에 방문하여 다양한 시료를 채취하여 현장진단을 실시하였다.
- 세균현탁액과 병징을 가진 다양한 시료로부터 병원균을 추출하여 스트립 검정에 사용하였다. Ea AgriStrip 검정을 위해서는 BIOREBA AG사가 제공하는 추출완충액을 모든 시료조제에 사용하였다.
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진단 스트립의 병 발생 현장에서 검증.
- 현장진단을 수행한 과수원 및 수행한 날짜는 Table 3에 정리되어 있다. 해당 과수원을 방문하여 다양한 시료를 채취하고, 그 시료로부터 세균추출액을 조제하여 항혈청 스트립 검정을 수행하였다. 현장진단 후에 검정에 사용한 세균추출액은 실험실로 옮겨 병원균을 분리하고, 동정하여 현장진단 결과를 확인하였다.
- 해당 과수원을 방문하여 다양한 시료를 채취하고, 그 시료로부터 세균추출액을 조제하여 항혈청 스트립 검정을 수행하였다. 현장진단 후에 검정에 사용한 세균추출액은 실험실로 옮겨 병원균을 분리하고, 동정하여 현장진단 결과를 확인하였다. 확진된 과수원을 방문할 경우 방제복 및 장갑을 착용하고 모든 작업을 수행하였다.
- 현장진단 후에 검정에 사용한 세균추출액은 실험실로 옮겨 병원균을 분리하고, 동정하여 현장진단 결과를 확인하였다. 확진된 과수원을 방문할 경우 방제복 및 장갑을 착용하고 모든 작업을 수행하였다. 2016년 12월과 2017년 1월에 진단한 경우를 제외하고 과수 생육기의 과수원에서는 다양한 병징으로부터 시료를 채집하였다.
대상 데이터
- 또한 비교하기 위해 병징을 보이지 않은 건전한 나무의 신초가지나 줄기를 채취하였다. 2016년 12월 21일에 수행한 세종시 부강면의 과수원의 경우 화상병 발생 의심신고가 접수되어 화상병 발생이 확진되기 전에 방문하여 다양한 시료를 채취하여 현장진단을 실시하였다. 방제복을 포함한 과수원 현장에 사용한 모든 물품은 멸균백(autoclave bag)에 넣어 실험실로 가져온 후 멸균하여 폐기하였다.
- 2016년 12월 13일 확진된 안성시 서운면(Anseong, Seoun 1)의 배 과수원에서 현장진단 결과 2가지 스트립에서 병든 시료의 세균추출액에 대해서만 모두 양성으로 나타났으며, 그 추출액으로부터 Ea가 분리되었다(Table 3). 2016년 12월 21일에 화상병 발생이 의심되는 세종시 부강면 배 과수원(Sejong,Bugang)의 경우 채집한 모든 현장시료의 세균추출액에 대해서 2가지 진단 스트립에 음성반응이었으며, 추출액에서 Ea, Ep가 모두 분리되지 않았다. 이 포장은 추후 농진청 작물보호과에서 화상병이 아닌 것으로 확진되었다.
- 확진된 과수원을 방문할 경우 방제복 및 장갑을 착용하고 모든 작업을 수행하였다. 2016년 12월과 2017년 1월에 진단한 경우를 제외하고 과수 생육기의 과수원에서는 다양한 병징으로부터 시료를 채집하였다. 가지나 열매에 생긴 세균 ooze, 마름증상을 가진 신초 가지(shoot), 조금 굵은 가지의 궤양(stem canker), 병든 유과(fruit), 병징이 진행 중인 잎과 잎자루(leaf), 그리고 나무의 큰 줄기의 궤양부위(trunk canker)로부터 시료를 채취하였다(Fig.
- 2016년-2017년 동안 4곳의 화상병 발생 과수원(배 과수원 2곳, 사과 과수원 2곳), 1곳의 화상병 발병의심 과수원(배 과수원), 그리고 1곳의 가지검은마름병 발생 과수원(사과 과수원)의 총 6개 과수원에서 2가지 스트립의 현장진단 능력을 조사하였다. 현장진단의 예시로 2017년 6월 8일 천안시 서북면(Cheonan, Seobuk)의 화상병이 발생한 사과나무 과수원에서 수행한 현장진단의 결과를 정리하였다.
- 이 포장은 추후 농진청 작물보호과에서 화상병이 아닌 것으로 확진되었다. 2017년 1월 11일에 확진된 안성시 서운면 배 과수원(Anseong, Seoun 2)의 현장시료의 세균추출액에 대해서 2가지 스트립은 음성반응을 보였는데, 이 추출액으로부터 실험실에서 Ea가 분리되었다. 2017년 5월 17일 확진된 안성시 미양면 사과나무 과수원(Anseong, Miyang)과 천안시 서북면(Cheonan, Seobuk) 사과나무 과수원에서는 병든 시료의 세균추출액에 대해서만 스트립 검정에서 양성반응이었으며, 또한 이 추출액으로부터 병원균 Ea도 분리되었다.
- E. amylovora 검출용 Ea AgriStrip (Cat. No.153081, BIOREBA AG)은 제작회사로부터 complete kit를 구입하여 사용하였다. 본 연구에서 제작한 EB (Erwinia blight) strip은 (주)메디안 디노스틱(Chuncheon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.
- 세균현탁액과 병징을 가진 다양한 시료로부터 병원균을 추출하여 스트립 검정에 사용하였다. Ea AgriStrip 검정을 위해서는 BIOREBA AG사가 제공하는 추출완충액을 모든 시료조제에 사용하였다. EB strip 검정을 위해서는 Gorris 등(1996)의 항산화마쇄완충액(antioxidant maceration buffer)을 사용하였다.
- syringae pv. syringae (Pss) 8 균주를 사용하였다(Table 1). 사용한 모든 세균은 순수분리하여 NA (nutrient agar; Becton, Dikinson & Co.
- 2016년 12월과 2017년 1월에 진단한 경우를 제외하고 과수 생육기의 과수원에서는 다양한 병징으로부터 시료를 채집하였다. 가지나 열매에 생긴 세균 ooze, 마름증상을 가진 신초 가지(shoot), 조금 굵은 가지의 궤양(stem canker), 병든 유과(fruit), 병징이 진행 중인 잎과 잎자루(leaf), 그리고 나무의 큰 줄기의 궤양부위(trunk canker)로부터 시료를 채취하였다(Fig. 1). 또한 비교하기 위해 병징을 보이지 않은 건전한 나무의 신초가지나 줄기를 채취하였다.
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과수원의 선정 및 시료 채집.
- 본 연구에서 제작한 EB (Erwinia blight) strip은 (주)메디안 디노스틱(Chuncheon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다. 농촌진흥청에서 분양 받은 2균주(YKB 12316, YKB 12320)와 2016년 안성시 서운면 사과나무의 화상병 병징으로부터 분리한 CBNU 2155 균주를 항원으로 사용하였으며, 항혈청의 조제 및 스트립의 제작은 Braun-Kiewnick 등(2011)의 방법에 따랐다.
- NA에서 배양한 세균 콜로니를 추출완충액에 현탁 후 분광광도계를 사용하여 세균의 밀도를 조정한 후 검정에 사용하였다. 병반 시료 중에서 세균 ooze 는 ooze 자체를 일회용 플라스틱 스틱 백금이로 얻어 추출완충액에 현탁하여 검정에 사용하였다. 병반을 가진 시료의 경우 마른증상의 새순의 잔가지(shoot, 올해 신초로 생장한 가지 선단 부위)의 경우 절단한 가지 자체를 사용하고, 가지의 직경이 조금 굵은 가지(stem)의 경우 궤양의 경계부위를 면도칼로 벗겨낸 수피를, 잎(leaf)의 경우 잎자루와 변색이 진행되는 부위를, 열매(fruit)의 경우 열매 자체를, 굵은 직경의 수간부위(trunk)의 궤양의 경우 겉껍질을 벗겨 낸 후 안쪽의 갈색으로 변색된 형성층 조직을 얻었다.
- 현재 이 병이 발생한 과수로부터 직경 100 m 이내의 모든 나무를 베어 매몰하고, 주변 2 km까지 화학적 방제를 실시하며, 5 km 주변까지 병 발생을 주기적으로 모니터링하고 있다(Park 등, 2017). 본 병은 발생 첫해인 2015년에 43개의 과수원에서 발생하였고, 2016년에는 안성과 천안의 2015년 발생지역 근처의 17개 과수원에서 발생이 확인되었다.
- 153081, BIOREBA AG)은 제작회사로부터 complete kit를 구입하여 사용하였다. 본 연구에서 제작한 EB (Erwinia blight) strip은 (주)메디안 디노스틱(Chuncheon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다. 농촌진흥청에서 분양 받은 2균주(YKB 12316, YKB 12320)와 2016년 안성시 서운면 사과나무의 화상병 병징으로부터 분리한 CBNU 2155 균주를 항원으로 사용하였으며, 항혈청의 조제 및 스트립의 제작은 Braun-Kiewnick 등(2011)의 방법에 따랐다.
- 2016년-2017년 동안 4곳의 화상병 발생 과수원(배 과수원 2곳, 사과 과수원 2곳), 1곳의 화상병 발병의심 과수원(배 과수원), 그리고 1곳의 가지검은마름병 발생 과수원(사과 과수원)의 총 6개 과수원에서 2가지 스트립의 현장진단 능력을 조사하였다. 현장진단의 예시로 2017년 6월 8일 천안시 서북면(Cheonan, Seobuk)의 화상병이 발생한 사과나무 과수원에서 수행한 현장진단의 결과를 정리하였다. 이 과수원에서 화상병 병징을 가진 사과나무로부터 세균 ooze(bacterial ooze), 잔가지 마름(shoot blight), 줄기 궤양(stem canker), 잎자루 및 잎(leafstalk)의 4가지 병징 시료와 병징을 가지지 않은 사과나무의 줄기로부터 얻은 1개의 건전 시료로부터 세균추출액을 얻어 검정한 결과 병든 시료로부터 얻은 세균추출액에 대해서만 2가지 스트립이 양성반응을 보였다(Fig.
이론/모형
- Ea AgriStrip 검정을 위해서는 BIOREBA AG사가 제공하는 추출완충액을 모든 시료조제에 사용하였다. EB strip 검정을 위해서는 Gorris 등(1996)의 항산화마쇄완충액(antioxidant maceration buffer)을 사용하였다. NA에서 배양한 세균 콜로니를 추출완충액에 현탁 후 분광광도계를 사용하여 세균의 밀도를 조정한 후 검정에 사용하였다.
성능/효과
- 본 연구에서 현장진단을 수행한 6곳의 결과를 종합 정리하였다(Table 3). 2016년 12월 13일 확진된 안성시 서운면(Anseong, Seoun 1)의 배 과수원에서 현장진단 결과 2가지 스트립에서 병든 시료의 세균추출액에 대해서만 모두 양성으로 나타났으며, 그 추출액으로부터 Ea가 분리되었다(Table 3). 2016년 12월 21일에 화상병 발생이 의심되는 세종시 부강면 배 과수원(Sejong,Bugang)의 경우 채집한 모든 현장시료의 세균추출액에 대해서 2가지 진단 스트립에 음성반응이었으며, 추출액에서 Ea, Ep가 모두 분리되지 않았다.
- 본 연구에서는 병원세균 항혈청을 이용하여 제작한 스트립 형태의 화상병 진단키트의 국내분리 화상병 병원균에 대한 특이성 및 검출민감성을 확인하고, 이 진단키트의 화상병 현장진단 사용 가능성을 조사하였다. Ea AgriStrip과 EB strip은 본 연구에 사용한 모든 Ea 균주에 양성반응을, 모든 Pss 균주에 음성 반응을 보여주었고, 11개의 Ep 균주 중에서 1개 균주가 2가지 스트립에서 다른 반응을 보여주었다. Ep 1 균주의 Ea AgriStrip 과 EB strip에서 다른 반응은 Ea와 Ep가 매우 유사함에도 불구하고 2가지 균에 대한 다클론(poyclonal) 항체는 균주별로 다르다는 것은 보여주는 것이다.
- 두 스트립 모두 사과나무 가지마름병 병원균인 Pss에 대해서는 모두 음성반응을 보였다(Table 1). 검출민감도를 조사한 결과 Ea AgriStrip과 EB strip 모두 세균밀도가 106 cells/ml까지 선명한 양성반응의 밴드를 보여주었고, 105 cells/ml에 의해서는 매우 희미한 양성밴드가 나타났다(Fig. 2).
- 나머지 실험에 사용한 가지검은마름병균(Ep)과 화상병균 (Ea) 모든 균주들은 두가지 스트립에 대해 양성반응을 보였다 (Table 1). 두 스트립 모두 사과나무 가지마름병 병원균인 Pss에 대해서는 모두 음성반응을 보였다(Table 1). 검출민감도를 조사한 결과 Ea AgriStrip과 EB strip 모두 세균밀도가 106 cells/ml까지 선명한 양성반응의 밴드를 보여주었고, 105 cells/ml에 의해서는 매우 희미한 양성밴드가 나타났다(Fig.
- Ea AgriStrip을 개발한 논문 (Braun-Kiewnick 등, 2011)에서 한국에서 분리된 3개의 Ep 균주에 대한 특이성에 대해 +/-로 표기하고, 약한 양성 또는 일관성 없는 검출(weekly positive or unreliable detection)이라고 판정하였다. 따라서 Ea와 Ep 균주들 사이의 표면항원에 차이가 있음이 이미 인지되었는데, 본 연구에서도 Ep 균주들 사이의 표면항원에 차이가 있음을 확인해주고 있다. Ea AgriStrip의 제조사가 제공하는 사용 매뉴얼에는 Ea AgriStrip이 Ea에 뿐만 아니라 Ep에 대해서 양성반응함을 명시하고 있다.
- 본 연구의 결과는 이미 상업화되어 사용중인 Ea AgriStrip 과 본 연구에서 개발한 EB strip 사이에 사용한 모든 균주에 대한 특이성, 검출민감도 및 현장진단에서 진단 결과에서 큰 차이가 없음을 보여주고 있다. 본 연구에 사용한 항혈청을 이용한 2가지 진단키트의 낮은 검출민감도와 Ea와 Ep을 구별하지 못하는 특이성의 한계는 이 병의 현장진단에 추가적인 수단이 필요함을 의미한다.
- 한편 진단 스트립을 이용한 현장 진단의 경우 특별한 기구없이 발생의심 과수원에서 1시간 이내에 진단이 가능한 장점이 있다. 본 연구의 전체 결과는 Ea AgriStrip과 EB strip이 겨울철 병원균의 밀도가 낮은 시료에서 병원균을 검출하지 못하는 경우가 있음에도 불구하고 과수 생육기에 화상병의 현장진단을 위해 충분히 사용될 수 있음을 보여주고 있다. 또한 가지검은마름병에 대한 양성반응의 경우 이 병이 아직까지 병든 나무를 매몰해야 하는 법적 관리병으로, 이 병원균에 대한 양성반응이 이들 진단 스트립의 화상병 현장 진단에 사용의 제약이 될 수 없을 것으로 판단된다.
- 양성반응이 나타나는데 소요되는 시간, 양성밴드의 강도, 그리고 검정 스트립의 배경색은 병든 시료의 종류와 추출액에 들어있는 Ea의 밀도와 관계 있는 것으로 나타났다. 즉 세균 ooze 를 희석한 추출액의 경우 배경 색이 매우 깨끗하고 비교적 양성밴드의 강도가 높고, 빠르게 나타났다.
- 현장진단의 예시로 2017년 6월 8일 천안시 서북면(Cheonan, Seobuk)의 화상병이 발생한 사과나무 과수원에서 수행한 현장진단의 결과를 정리하였다. 이 과수원에서 화상병 병징을 가진 사과나무로부터 세균 ooze(bacterial ooze), 잔가지 마름(shoot blight), 줄기 궤양(stem canker), 잎자루 및 잎(leafstalk)의 4가지 병징 시료와 병징을 가지지 않은 사과나무의 줄기로부터 얻은 1개의 건전 시료로부터 세균추출액을 얻어 검정한 결과 병든 시료로부터 얻은 세균추출액에 대해서만 2가지 스트립이 양성반응을 보였다(Fig. 3, Table 2). 또한 병든 시료로부터 얻은 세균추출액으로부터 Ea가 분리되었다(Fig.
- 3). 이러한 병반 시료 별 차이가 있음에도 불구하고 다양한 화상병 병징 세균 추출액에 대해서는 본 연구에 사용한 2가지 스트립은 모두 양성반응을 보여주었다.
- 양성반응이 나타나는데 소요되는 시간, 양성밴드의 강도, 그리고 검정 스트립의 배경색은 병든 시료의 종류와 추출액에 들어있는 Ea의 밀도와 관계 있는 것으로 나타났다. 즉 세균 ooze 를 희석한 추출액의 경우 배경 색이 매우 깨끗하고 비교적 양성밴드의 강도가 높고, 빠르게 나타났다. 그러나 오래된 조직 추출액에서는 배경의 색이 강하게 나타났다(Fig.
- 화상병 발생 과수원에서 현장진단에 적용한 결과 화상병이 확진된 4 곳의 과수원 중에서 2017년 1월 11일에 수행된 현장진단(안성시 서운면, Anseong, Seoun 2)을 제외하고는 다양한 병징 세균추출액에서 검정시작 30분 이내에 양성반응을 보여주었다. 2017년 1월 11일에 조사한 안성시 서운면의 배 과수원의 경우 건전한 배나무의 모든 잎은 낙엽되었고, 화상병이 걸린 가지의 잎은 낙엽되지 않고 가지에 붙어 있었으며, 모든 가지는 말라 있었다.
- 화상병과 유사한 가지검은마름병이 발생한 경기도 광주의 포장에서는 병반 추출액에 대해 2가지 진단 스트립 모두 양성 반응을 나타내었지만, 병원균 분리에서 Ep가 분리되었는데, 이 결과는 본 연구에 사용한 2가지 진단 스트립으로는 화상병과 가지검은마름병을 구분할 수 없음을 보여주고 있다.
후속연구
- 본 연구의 결과는 이미 상업화되어 사용중인 Ea AgriStrip 과 본 연구에서 개발한 EB strip 사이에 사용한 모든 균주에 대한 특이성, 검출민감도 및 현장진단에서 진단 결과에서 큰 차이가 없음을 보여주고 있다. 본 연구에 사용한 항혈청을 이용한 2가지 진단키트의 낮은 검출민감도와 Ea와 Ep을 구별하지 못하는 특이성의 한계는 이 병의 현장진단에 추가적인 수단이 필요함을 의미한다. 즉 검출민감도가 혈청 스트립보다 월등 하게 우수하고, Ea와 Ep를 구별할 수 있는 LAMP법이 현장진단에 추가로 사용된다면 화상병과 가지검은마름병을 훨씬 더 정확하게 진단할 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구에 사용한 항혈청을 이용한 2가지 진단키트의 낮은 검출민감도와 Ea와 Ep을 구별하지 못하는 특이성의 한계는 이 병의 현장진단에 추가적인 수단이 필요함을 의미한다. 즉 검출민감도가 혈청 스트립보다 월등 하게 우수하고, Ea와 Ep를 구별할 수 있는 LAMP법이 현장진단에 추가로 사용된다면 화상병과 가지검은마름병을 훨씬 더 정확하게 진단할 수 있을 것으로 생각된다. Buhlmann 등(2013) 은 Ea와 Ep를 구별할 수 있으며, 검출민감도가 매우 우수한 Ea 특이적 LAMP를 보고하였다.
- 현재 발생의심 시료를 농촌진흥청에 보내고, 농촌진흥청으로부터 확진 공문 수령 후 매몰처분을 하고 있는데, 의심 병징의 발견과 확진 사이 시간이 소요된다. 항혈청 기반 스트립의 현장진단에서 양성반응은 확진 전에 즉시에 임시조치를 취할 수 있도록 해주어 병징 발견과 확진 사이에 생길 수 있는 이 병의 전반을 차단할 수 있게 해주며, 또한 많은 의심시료가 농촌진흥청으로 보내지기 전에 1차로 스크린(screen)하는데 매우 유용할 것으로 판단된다.
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