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문제 정의
- 본 연구에서는 OECD guideline 428에 제시되고 있는 방법을 바탕으로 하여 표준물질인 benzoic acid와 caffeine을 이용하여 피부흡수 시험방법의 다양한 조건을 설정하고, 피부 3 종류(hairless mouse full skin, human cadaver epidermis, KeraSkinTM)에 따른 투과 정도를 비교하고자 했으며, 시험물질의 수용성, 지용성 성질에 따른 투과 정도와 시험물질의 제형에 따른 투과 정도를 비교, 평가하고자 하였다.
- 본 연구에서는 OECD guideline 428에서 제시하고 있는 방법을 바탕으로 수용성인 caffeine과 지용성인 benzoic acid에 대한 피부 투과정도를 피부 3 종류(hairless mouse full skin, human cadaver epidermis, KeraSkinTM)를 이용하여 비교 평가 하였으며, 또한 가이드라인에서 제시된 시험조건을 일부 조정 하였을 때의 투과차이를 비교 분석하여 최적의 시험조건을 제시하고자 실시하였다.
제안 방법
- Donor chamber와 receptor chamber 사이에 각질층이 위로 오도록 피부를 고정하고, receptor chamber에 receptor fluid를 5 ml 채운 다음, 30분 간 안정화를 시켰다. 온도는 32 ± 2°C로 유지하고, 투과된 시험물질이 골고루 혼합되도록 장비의 stirrer 회전속도(rpm)는 600으로 유지하였다.
- Hairless mouse full skin을 얻기 위해, 7주령의 수컷 hairless mouse를 (주)오리엔트바이오(경기도, Korea)로부터 분양받아 1주간 온도 22 ± 3°C, 습도 50 ± 5%, 명암주기 12시간 밤과 낮 단위로 조절되는 표준사육시설에서 적응시킨 후 부검하여 피부를 적출하였다.
- 다양한 조건에 따른 결과를 비교하기 위해, 시험물질은 수용성인 caffeine과 지용성인 benzoic acid와 사용하였고, 두 농도의 물질, 세 종류 피부, 세 종류 수용액, donor chamber의 cap 여부 및 시료채취 후 분석시간에 따른 결과를 비교하였다. 그 결과를 통해 최종 실험에서는 각 두 시험물질에 대해 2% 농도의 크림제형을 이용하였고, 피부는 hairless mouse full skin, 수용액은 ethanol/water (1:1, v:v), donor chamber의 cap은 씌우지 않은 상태로, 분석시기는 시료채취 후 3일 이내로 설정하여 실험을 실시하였다.
- 다양한 조건에 따른 결과를 비교하기 위해, 시험물질은 수용성인 caffeine과 지용성인 benzoic acid와 사용하였고, 두 농도의 물질, 세 종류 피부, 세 종류 수용액, donor chamber의 cap 여부 및 시료채취 후 분석시간에 따른 결과를 비교하였다. 그 결과를 통해 최종 실험에서는 각 두 시험물질에 대해 2% 농도의 크림제형을 이용하였고, 피부는 hairless mouse full skin, 수용액은 ethanol/water (1:1, v:v), donor chamber의 cap은 씌우지 않은 상태로, 분석시기는 시료채취 후 3일 이내로 설정하여 실험을 실시하였다.
- 단위시간당 일정 면적을 투과하는 물질의 양인 투과속도(flux, μg/hr·cm2) 값을 계산 하였으며, flux 값을 시험물질의 초기농도를 나눠준 값인 투과계수(Kp, cm/hr) 값도 계산하였다11).
- 본 연구에서, 피부흡수 대체시험법의 다양한 조건에 대하여 비교·평가하여 guideline 방법 외에 농도 및 피부종류, cap 여부, receptor fluid, 분석기간 등 추가적인 조건을 설정하였고, 시험물질의 수용성, 지용성 성질 및 제형에 따른 투과 정도를 확인하였다.
- 샘플은 분석 전까지 -80°C 냉동보관 하였고, LC-MS/MS로 분석하여 피부 내 잔류량을 분석하였다.
- 시간대별로 채취한 receptor fluid와 피부에서 용출한 샘플에서 각 시험물질의 양을 LC-MS/MS로 조건(Table 3)에 맞게 정량하여 피부를 통과한 누적투과량을 시간별로 계산하였다. 시료들은 모두 0.
- 시료 채취 시간은 도포 후 1, 2, 4, 7, 10, 24시간으로 하였으며, receptor fluid에서 추출한 샘플은 분석 전까지 -80°C에 보관하였다가 LC-MS/MS로 분석하여 농도를 분석하였다.
- 시료들은 모두 0.2 μm syringe filter를 이용하여 부유물을 제거시킨 후 LCMS/MS로 분석하였다.
- 실험에 사용한 피부 두께는 흡수에 영향을 줄 수 있으므로 실험 직전 digital vernier calipers(PK 1012SU, Mitutoyo, Japan)를 사용하여 동일 부위 3회 반복 측정하였다.
- 피부 무결성 측정을 위해 Tewameter를 이용하여 경피수분손실량(transepidermal water loss, TEWL)을 동일 부위에 10회 반복 비침습 방법으로 측정하였으며, 평균값을 구한 피부 중에 10 mg/m2/h 이상 피부는 손상된 것으로 판단하여 실험에서 제외하였다19).
- 피부흡수 시험물질로 사용한 수용성 물질인 caffeine과 지용성 물질인 benzoic acid는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여(Table 1) distilled water(DW) 및 olive oil에 각각 2%, 5%의 농도로 녹여 solution형태로 시험하였으며, 또한 oil in water(O/W) type의 cream base(Table 2)에 시험물질을 각 2%, 5%의 농도로 제조하여 흡수양상을 비교하였다.
대상 데이터
- Human cadaver epidermis는 ㈜한스바이오메드(경기도, 한국)로부터 구입하여 실험 전까지 -20°C 냉동고에 보관하였고, 실험 직전 상온에서 서서히 녹여 실험에 사용하였다.
- OECD guideline 428에서 권고되고 있는 시험물질은 benzoic acid, caffeine, testosterone 세 가지로14), 본 실험에서는 분석의 편리성을 고려하여 지용성 물질인 benzoic acid와 수용성 물질인 caffeine을 선택하였다. 피부흡수 대체시험법에서 실험에 사용할 피부는 실험 전에 피부 구조의 무결성을 입증하여야 하며, 그 방법으로는 교류 전기 저항 측정, 삼중수를 이용한 투과성 확인, 3H-sucrose를 첨가하여 적합성 평가를 확인하는 방법 등이 있다14).
- 1). Receptor fluid는 시험물질이 잘 녹고, 분석에 영향을 주지 않는 용액으로 결정하며14), 본 연구에서는 PBS, saline, ethanol/water (1:1, v/v)를 사용하였다.
- 경피흡수 실험에 사용한 Franz diffusion cell(Lab fine, Korea) 장치는 receptor volume이 5 ml인 것을 사용하였으며, 경피수분손실량의 측정은 Tewameter(CM825, CK electronic GmbH, Germany)를 사용하였다. 분석은 LC-MS/MS(Waters ACQUITY UPLC, Micromass Quattro microTM API, Applied Biosystems, USA) 방법을 이용하였으며, 분석컬럼은 Cazenda ODS C18(Imtakt, 3 µm, 2.
- 사용한 Franz diffusion cell은 Franz method에 따른 static diffusion cell 형태로20), 내경이 10 mm이고 장치 자체의 온도와 stirrer의 회전속도(rpm, revolution per minute)의 조절이 가능하며, donor chamber 및 receptor chamber로 이루어져 있다. Donor chamber는 cap의 개폐가 가능하며, receptor fluid 용량은 5 ml이고, sampling port를 통해 마이크로 피펫이나 syringe를 이용하여 시료를 채취가 가능하다.
- 인공피부인 KeraskinTM은 ㈜MCTT(서울, 한국)에서 구입하였고, 전배양을 거친 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- SPSS 21.0 for windows(SPSS Inc., USA) 통계프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며, 분석시기에 따른 결과 비교에 있어서는 repeated measures ANOVA를 실시하였다. 각 그룹 간의 차이를 검정하기 위하여 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후분석을 실시하였다.
- Values with different superscripts are significantly different(p < 0.05) by ANOVA and Duncan's multiple range test.
- Values with different superscripts in the same column are significantly different (p < 0.05) by ANOVA and Duncan's multiple range test.
- Values with different superscripts in the same skin are significantly different (p < 0.05) by ANOVA and Duncan's multiple range test.
- 각 그룹 간의 차이를 검정하기 위하여 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후분석을 실시하였다.
이론/모형
- 분석은 LC-MS/MS(Waters ACQUITY UPLC, Micromass Quattro microTM API, Applied Biosystems, USA) 방법을 이용하였으며, 분석컬럼은 Cazenda ODS C18(Imtakt, 3 µm, 2.0 × 100 mm, Japan)을 사용하였다.
성능/효과
- OECD guideline 428에 제시된 시험방법 외에 자세하고 다양한 조건을 비교하여 설정된 조건으로 최종실험을 거쳤으며, 그 결과 지용성 시험물질이 수용성 시험물질 보다 더 많은 투과를 보였고, 수용성 물질이 낮은 투과량을 보인다는 기존의 연구와 일치하며, 피부는 친수성을 띄는 시험물질의 확산에 있어서 저항성을 갖는 것이 확인되었다24). 또한 각 시험물질의 제형에 있어서 solution 제형과 cream 제형을 비교하였는데, oil > O/W emulsion > ointmen > cream의 순서로 투과가 보고된 연구11)와 유사한 결과를 확인할 수 있었다.
- 피부흡수 대체시험법에서 실험에 사용할 피부는 실험 전에 피부 구조의 무결성을 입증하여야 하며, 그 방법으로는 교류 전기 저항 측정, 삼중수를 이용한 투과성 확인, 3H-sucrose를 첨가하여 적합성 평가를 확인하는 방법 등이 있다14). 본 실험에서는 경피수분손실량을 측정하였으며, 10 이상의 값은 피부가 손상된 것으로 판단하여 실험에서 제외시킬 수 있는데19), 측정 결과 모두 10 이하의 값을 얻었으며 실험에 사용할 수 있었다.
- 4의 saline을, 지용성 시험물질일 때는 ethanol/water(1:1, v:v)가 OECD guideline 428에서 제시되고 있다14). 본 실험에서는 이를 비교 및 확인하고자 하여 여러 종류의 receptor fluid를 동시에 실험하였으며, 수용성, 지용성 성질에 상관없이 모두 ethanol/water(1:1, v:v)가 시험물질이 가장 용해가 잘 되는 것으로 보여진다. 그러나 극지용성 시험물질은 ethanol/water (1:1, v:v)에 용해되지 않을 수도 있으므로 시험물질에 따라 고려해보아야 한다고 생각된다.
- 와 일치하는 것으로 확인하였다. 분석과정을 고려하여 농도를 설정하고, 피부에 자극을 주지 않는 농도로 결정하는 것이 좋을 것으로 판단된다. 피부종류에 따른 투과에 있어서 KeraSkinTM은 피부 두께가 가장 두꺼운 반면 가장 높은 투과를 나타냈는데, 이는 인공피부모델이므로 실제 피부에 비해 피부의 각층이 단순화 되어있으므로 투과량이 높은 것으로 추측된다.
- 분석기간에 있어서는 채취한 시료의 용액을 똑같이 나누어 -80°C에 보관하였고, 보관하고 있는 기간이 길어지면 검출량 분석에 영향이 있을 것으로 추측이 되어 실험을 실시하였고, 그 결과 시간이 지날수록 검출량이 줄어드는 것으로 나타났다.
- 사용피부의 무결성을 판단하기 위해, hairless mouse full skin(7.29 ± 1.64 g/hr·m2), human cadaver epidermis (8.16 ± 1.66 g/hr·m2) 및 KeraSkinTM(5.27 ± 0.70 g/hr·m2)의 경피수분손실량을 측정한 결과, 세 피부에서 모두 10 이하의 값을 보여 실험에 사용적합으로 판단되었다.
- 세 종류의 피부 두께를 측정한 결과 KeraSkinTM(0.42 ± 0.01 mm) > hairless mouse full skin(0.23 ± 0.01 mm) > human cadaver epidermis(0.07 ± 0.01 mm)의 순서로 두께 값을 보였다.
- 세 피부 종류 모두에서 각 시험물질의 농도 의존적으로 투과량이 증가하였고, flux와 Kp 값에서도 농도 의존적으로 값이 증가하였다. 피부종류에 따른 투과양상에서는 모든 시험물질 군에서 KeraSkinTM > hairless mouse full skin > human cadaver epidermis의 순서로 투과량이 많은 것을 알 수 있었다(Table 4).
- 값도 유의성 있는 증가를 보였다. 시료채취 후 분석기간에 따른 결과에 있어서는 시간이 지날수록 유의성 있게 감소됨이 관찰되었다. Donor chamber의 cap 사용 여부에 따라서는 큰 영향을 나타내지 않았다(Table 5).
- 시험물질을 도포한 hairless mouse full skin(두께 0.23 mm) 부위(도포 면적 0.785 cm2) 내에 잔류하는 시험물질 양을 분석하였을 때, benzoic acid가 caffeine에 비해 잔류량이 더 높았고, solution이 cream보다 약 3배 높은 잔류량을 보였다(Table 8).
- 앞의 실험에서 설정된 조건을 적용하여 benzoic acid와 caffeine 두 가지 물질의 solution과 cream 제형의 투과를 비교해 본 결과, benzoic acid solution > caffeine solution > benzoic acid cream > caffeine cream의 순서로 많은 투과량을 보였다(Fig. 2).
- 피부는 공기 중에서의 노출이 많을 것이고, 피부흡수 대체시험법은 실제 노출경로와 유사하게 실험을 진행해야 한다고 생각하여 cap을 씌우는 것과 안 씌운 것을 비교해 보았는데, 본 실험에서 사용한 시험물질은 휘발성 성질이 없었으므로 cap 여부에 따른 영향을 보이지 않았다. 그러나 추후 휘발성 물질을 사용하거나 실험 과정에 있어서 시험물질이 손실이 될 것이라 생각되는 것에 한해서는 cap을 씌워서 손실을 막는 것이 좋을 것으로 판단된다.
- 피부종류에 따른 투과양상에서는 모든 시험물질 군에서 KeraSkinTM > hairless mouse full skin > human cadaver epidermis의 순서로 투과량이 많은 것을 알 수 있었다(Table 4).
후속연구
- 피부는 공기 중에서의 노출이 많을 것이고, 피부흡수 대체시험법은 실제 노출경로와 유사하게 실험을 진행해야 한다고 생각하여 cap을 씌우는 것과 안 씌운 것을 비교해 보았는데, 본 실험에서 사용한 시험물질은 휘발성 성질이 없었으므로 cap 여부에 따른 영향을 보이지 않았다. 그러나 추후 휘발성 물질을 사용하거나 실험 과정에 있어서 시험물질이 손실이 될 것이라 생각되는 것에 한해서는 cap을 씌워서 손실을 막는 것이 좋을 것으로 판단된다.
- 본 연구에서, 피부흡수 대체시험법의 다양한 조건에 대하여 비교·평가하여 guideline 방법 외에 농도 및 피부종류, cap 여부, receptor fluid, 분석기간 등 추가적인 조건을 설정하였고, 시험물질의 수용성, 지용성 성질 및 제형에 따른 투과 정도를 확인하였다. 본 연구에서 설정된 조건이 추후에 있을 최적의 조건 확립 연구에 기여할 수 있을 것으로 보이며, 본 시험법을 이용하여 다양한 시험물질 및 피부 등을 이용한 피부흡수 대체시험법 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 이에 대한 확인시험과 국제적인 검증연구가 필요하며 그로 인해 국내에서도 피부흡수 대체시험법이 활성화될 것으로 기대된다.
- 본 연구에서 설정된 조건이 추후에 있을 최적의 조건 확립 연구에 기여할 수 있을 것으로 보이며, 본 시험법을 이용하여 다양한 시험물질 및 피부 등을 이용한 피부흡수 대체시험법 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 이에 대한 확인시험과 국제적인 검증연구가 필요하며 그로 인해 국내에서도 피부흡수 대체시험법이 활성화될 것으로 기대된다.
- 분석기간에 있어서는 채취한 시료의 용액을 똑같이 나누어 -80°C에 보관하였고, 보관하고 있는 기간이 길어지면 검출량 분석에 영향이 있을 것으로 추측이 되어 실험을 실시하였고, 그 결과 시간이 지날수록 검출량이 줄어드는 것으로 나타났다. 추후 연구에 있어서 같은 날짜에 실험한 시료는 같은 기간 안에 분석을 실시하는 것이 좋을 것으로 판단되며, 또한 최대한 빠른 시간 내에 분석을 실시하는 것이 보다 더 정확한 검출량을 알 수 있을 것이다.
- 또한 각 시험물질의 제형에 있어서 solution 제형과 cream 제형을 비교하였는데, oil > O/W emulsion > ointmen > cream의 순서로 투과가 보고된 연구11)와 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 피부 내 잔류량 측정에 있어서는 투과량이 많은 지용성 물질이 더 많은 잔류량을 보였고, 피부 내에 잔류하고 있는 시험물질은 추후 시간이 지나면 피부를 통과할 것으로 판단된다.
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