선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 기존에 보고된 항노화 효능을 가진 보름달 물해파리 유래 펩타이드인 LVH의 피부흡수율을 높이기 위하여 팔미틱산을 사용하여 pal-LVH를 합성하였고, 합성된 pal-LVH와 LVH의 항산화, 상처 치유 능력, 주름개선 및 피부 침투와 관련된 효능 평가를 비교함으로써 새로운 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다.
- 천연생물자원으로부터 추출된 기능성 펩타이드들은 강력한 활성 및 비교적 낮은 부작용으로 인하여 그 가치가 매우 높으나, 세포조직 내로의 낮은 투과율은 개선되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 주름개선 효능이 있는 보름달 물해파리 유래 펩타이드인 LVH의 피부 침투 효과를 보다 효율적으로 증진시키고자, 일반적으로 사용되는 방법인 팔미틱산을 결합시킨 pal-LVH를 합성하였다. 그리고 실제로 이러한 합성이 원래의 펩타이드의 효능에 영향을 미치는지 알아보기 위해 두 펩타이드에 대해 세포독성, 항산화, 항노화, 주름개선에 대해 비교 평가하였다.
제안 방법
- 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma- Aldrich Co, St. Louis, MO, USA)가 발생시키는 자유 라디칼에 대한 소거능을 이용하여 시료의 항산화 효과를 평가하였다 [15]. 에탄올에 용해시킨 0.
- HaCaT 세포에 두 가지 펩타이드를 1, 10, 100 μM의 농도로 처리하여 24시간 후에 MTT와 Thermo사의 PrestoBlue® Cell Viability Reagent를 사용하여 세포 독성을 측정하였다.
- 에서 보는 바와 같이 LVH 및 pal-LVH는 HPLC-UV에서 각각 단일 peak으로 검출되어 반응 물질 및 합성 후 존재하는 다른 물질로부터 매우 잘 분리되었다. MALDI-TOF를 이용하여 분자량 분석을 통하여 이들 물질들이 LVH와 pal-LVH인지 확인하였다. 사용된 matrix는 CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)이며, 얻어진 질량분석 스펙트럼을 Fig 1.
- 4에 나타내었다. PBS와 EGF (0.1ppm)는 각각 음성 대조군과 양성 대조군으로 사용하였다.
- 물질 처리 후 0시간대에 cell image를 현미경 사진으로 찍고 20시간 동안 추가 배양 후 배지를 제거하고 4% paraformaldehyde을 이용하여 고정하고 PBS로 3번 세척하였다. Wound healing이 된 정도는 현미경으로 사진을 찍어 National Institutes of Health (NIH)에서 제공하는 프리웨어인 Image J 프로그램을 이용하여 계산하였다 [18]. 양성 대조군은 100ng/mL EGF를 사용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 주름개선 효능이 있는 보름달 물해파리 유래 펩타이드인 LVH의 피부 침투 효과를 보다 효율적으로 증진시키고자, 일반적으로 사용되는 방법인 팔미틱산을 결합시킨 pal-LVH를 합성하였다. 그리고 실제로 이러한 합성이 원래의 펩타이드의 효능에 영향을 미치는지 알아보기 위해 두 펩타이드에 대해 세포독성, 항산화, 항노화, 주름개선에 대해 비교 평가하였다. 그 결과, pal-LVH는 LVH와 마찬가지로 1∼100 μM의 다양한 농도에서 세포 독성을 보이지 않았고, 항산화 효능이 없는 것으로 보고된 LVH와 마찬가지로 pal-LVH는 DPPH 소거 능력은 거의 없는 것으로 보아 항산화에는 효과적이지 않았다.
- 펩타이드를 합성하기 위한 일반적인 방법인 고체상합성법을 통하여 기존에 보고된 주름개선에 효과가 있는 보름달 물해파리 유래 펩타이드인 LVH를 합성하였다. 그리고 이 펩타이드에 피부 침투 능력을 극대화하기 위하여, 지방산의 일종인 팔미틱산을 사용하여 pal-LVH로 합성하였다 [Fig. 1. A.].
- 준비된 시료들을 15 μL씩 patch 내에 적하 시킨 후 시험 대상자의 전박 안쪽 부위에 착색이나 피부 손상이 없는 부위에 24시간 동안 첩포검사를 수행하였다. 도포 시간이 지난 후 patch를 제거하고 피부 자극 정도를 연구자가 육안으로 평가하였다.
- 주름개선 효과와 관련이 있는 collagen은 세포 내에서 procollagen으로 합성된 후 세포 외로 분비되어 중합된다. 따라서 LVH와 pal-LVH의 주름개선 효과는 procollagen의 일종인 PCOLCE 유전자의 mRNA 발현양을 통하여 확인하였다. 양성대조군은 EGF (10 ng/mL), 음성대조군은 PBS를 사용하였다.
- 또한 PrestoBlue® Cell Viability Reagent (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA,USA)를 사용하여 세포독성을 제조사의 매뉴얼에 따라 분석하였다.
- 배양 후 SuperPrepTM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Osaka, Japan)를 이용하여 매뉴얼에 따라 합성한 cDNA를 template로 사용하여 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Toyobo Co.,Osaka, Japan) 시약과 Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden,German)를 이용하여 RT-PCR (real time polymerase chain reaction)을 수행하였다.
- 상처회복능을 측정하기 위하여 HaCaT 세포를 이용하여 wound healing assay을 실시하였고, 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다. PBS와 EGF (0.
- 준비된 시료들을 15 μL씩 patch 내에 적하 시킨 후 시험 대상자의 전박 안쪽 부위에 착색이나 피부 손상이 없는 부위에 24시간 동안 첩포검사를 수행하였다.
- 펩타이드를 합성하기 위한 일반적인 방법인 고체상합성법을 통하여 기존에 보고된 주름개선에 효과가 있는 보름달 물해파리 유래 펩타이드인 LVH를 합성하였다. 그리고 이 펩타이드에 피부 침투 능력을 극대화하기 위하여, 지방산의 일종인 팔미틱산을 사용하여 pal-LVH로 합성하였다 [Fig.
- 기존에 보고된 바에 의하면 LVH는 피부에 자극을 주지 않았다. 하지만 팔미틱산의 첨가로 인하여 pal-LVH가 피부에 알레르기 원으로 작용하는지 알아보기 위하여 남성 2명과 여성 2명에 대해서 첩포검사를 진행하였다.
- 합성된 LVH와 pal-LVH가 세포 성장 및 증식에 미치는 영향을 비교하기 위해 세포독성 테스트를 실시하였다. HaCaT 세포에 두 가지 펩타이드를 1, 10, 100 μM의 농도로 처리하여 24시간 후에 MTT와 Thermo사의 PrestoBlue® Cell Viability Reagent를 사용하여 세포 독성을 측정하였다.
- 에 의하여 묘사된 palmitic acid와 펩타이드를 합성하는 방법을 사용하였다 [13]. 합성된 LVH와 pal-LVH는 HPLC system(2695 Alliance, Waters, Milford, MA, USA)에 의해 단일물질로 정제되었고, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight, Voyager,Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 분자량을 측정하여 정성 분석하였다.
- ]. 합성된 두 펩타이드는 HPLC를 이용하여 정제하였다 [Fig. 1. B. D.].
- 항산화 능력을 비교 평가하기 위해서 DPPH를 이용한 라디칼 소거 능력을 측정하였다. 비타민 C는 양성 대조군으로 사용하였고, 그 결과를 Fig.
대상 데이터
- 사용된 matrix는 CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)이며, 얻어진 질량분석 스펙트럼을 Fig 1.
- 세포는DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco,Carlsbad, CA, USA), 10% FBS (Fetal Bovine Serum,Gibco, Carlsbad, CA, USA), 1% Penicillin-Streptomycin(Gibco, Carlsbad, CA, USA)의 배지에서 37°C, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
- ,Osaka, Japan) 시약과 Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden,German)를 이용하여 RT-PCR (real time polymerase chain reaction)을 수행하였다. 실험에 사용한 primer는procollagen C-endopeptidase enhancer (PCOLCE)의 경우 Hs_PCOLCE_1_SG QuantiTect Primer Assay(Qiagen, Hilden, German) primer와 Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 경우 Hs_GAPDH_1_SG QuantiTect Primer Assay(Qiagen,Hilden, German) primer를 사용하였고, GAPDH를 사용하여 normalization 하였다.
- Wound healing이 된 정도는 현미경으로 사진을 찍어 National Institutes of Health (NIH)에서 제공하는 프리웨어인 Image J 프로그램을 이용하여 계산하였다 [18]. 양성 대조군은 100ng/mL EGF를 사용하였다.
- 양성대조군은 1% SLS (sodium lauryl sulfate)를 사용하였고, 그 결과를 Fig. 6에 나타내었다. 그림에서 보는 바와 같이 양성대조군인 1% SLS의 경우 홍반 반응이 나타남을 확인하였지만, 음성 대조군 (blank, water, DMSO),10 uM LVH 와 pal-LVH 모두 홍반반응이 나타나지 않았다.
- 따라서 LVH와 pal-LVH의 주름개선 효과는 procollagen의 일종인 PCOLCE 유전자의 mRNA 발현양을 통하여 확인하였다. 양성대조군은 EGF (10 ng/mL), 음성대조군은 PBS를 사용하였다.
- 인간 각질형성 세포주 (HaCaT)는 Huons (Seongnam-si,Korea)로부터 분양받았으며, 인간 섬유아세포 (detroit551)는 ATCC (American Type Culture Collection,Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 세포는DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco,Carlsbad, CA, USA), 10% FBS (Fetal Bovine Serum,Gibco, Carlsbad, CA, USA), 1% Penicillin-Streptomycin(Gibco, Carlsbad, CA, USA)의 배지에서 37°C, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
- 임상실험에 참가하는 인원은 화장품 인체적용시험 및 효력시험 가이드라인 [19]에 의거하여 성인 남녀 중 피부질환 및 급 만성 질환이 없는 성인을 대상으로 진행하였다. 시험 부위는 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조했다.
이론/모형
- 또한 pal-LVH는 LVH를 합성한 후 Rijkers et al.에 의하여 묘사된 palmitic acid와 펩타이드를 합성하는 방법을 사용하였다 [13]. 합성된 LVH와 pal-LVH는 HPLC system(2695 Alliance, Waters, Milford, MA, USA)에 의해 단일물질로 정제되었고, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight, Voyager,Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 분자량을 측정하여 정성 분석하였다.
- 보름달 물해파리 유래 펩타이드인 LVH는 Lu et al.에사용된 고체상 합성법을 통해 합성하였다 [12]. 또한 pal-LVH는 LVH를 합성한 후 Rijkers et al.
성능/효과
- 1 μM 이하의 저농도에서는 LVH와 마찬가지로 PCOLCE의 발현을 증가시켜 주름개선에 효과적임을 확인할 수 있었다.
- Fig.3을 보면 대조군의 경우 10 μM의 낮은 농도에서 DPPH의 자유라디칼 소거능이 92.28% (±1.26)로 나타났지만, 이와는 다르게 100 μM의 고농도를 처리하였음에도 불구하고, LVH와 pal-LVH 펩타이드의 자유라디칼 소거능이 각각 2.65% (±0.68), 4.21% (±1.62)로 나타나 DPPH 자유라디칼 소거능이 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.
- PBS과 EGF의 경우 상처 복구율이 각각 31.9% (±6.68),59.3% (±8.76)를 보였으나, LVH와 pal-LVH의 경우 5ppm 이하의 저농도에서는 상처 치유 효능이 각 각 10% 이하로 나타나 효능이 음성 대조군 보다 낮은 것을 확인 할 수 있었다.
- 결과적으로 1 μM 이하의 저농도에서는 LVH보다는 다소 낮지만 pal-LVH도 음성 및 양성 대조군인 EGF보다 우수한 주름개선 효과를 보이는 것으로 보아 팔미틱산의 첨가가 LVH의 주름개선 효과에 크게 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
- 그 결과, pal-LVH는 LVH와 마찬가지로 1∼100 μM의 다양한 농도에서 세포 독성을 보이지 않았고, 항산화 효능이 없는 것으로 보고된 LVH와 마찬가지로 pal-LVH는 DPPH 소거 능력은 거의 없는 것으로 보아 항산화에는 효과적이지 않았다.
- 62)로 나타나 DPPH 자유라디칼 소거능이 거의 없는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 LVH와 마찬가지로 pal-LVH는 항산화 능력은 없는 것을 확인할 수 있었다.
- 세포 독성을 검사한 결과 두 펩타이드 모두 다양한 농도에서 세포독성이 없음을 확인하였고, 실험 군과 대조군 모두 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 피부 침투능력을 극대화하기 위하여 합성된 pal-LVH는 LVH와 마찬가지로 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
- 1 μM 이하의 저농도에서는 LVH와 마찬가지로 PCOLCE의 발현을 증가시켜 주름개선에 효과적임을 확인할 수 있었다. 또한, 피부 자극 테스트에서 육안 평가를 종합 한 결과 LVH와 같이 pal-LVH도 비자극성으로 판정되었다. 이들 결과는 기존의 기능성 펩타이드로 알려진 LVH와 팔미트산을 이용하여 합성된 pal-LVH가 원래의 효능에 영향을 주지 않는다는 것을 지시한다.
- 에 나타내었다. 세포 독성을 검사한 결과 두 펩타이드 모두 다양한 농도에서 세포독성이 없음을 확인하였고, 실험 군과 대조군 모두 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 피부 침투능력을 극대화하기 위하여 합성된 pal-LVH는 LVH와 마찬가지로 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
- 양성대조군인 EGF는 음성대조군인 PBS에 비해 PCOLCE mRNA 발현이 1.65 (±0.15) 배 증가한 반면, 1μM의 LVH와 pal-LVH의 경우 각각 2.32 (±0.16), 1.95(±0.32) 배 증가한 것을 확인할 수 있었다 [Fig. 5].
- 5]. 이는 LVH와 pal-LVH 두 펩타이드 모두 양성대조군으로 사용한 EGF보다 주름개선에 우수한 효능을 보임을 알 수 있었다.
- 또한, 피부 자극 테스트에서 육안 평가를 종합 한 결과 LVH와 같이 pal-LVH도 비자극성으로 판정되었다. 이들 결과는 기존의 기능성 펩타이드로 알려진 LVH와 팔미트산을 이용하여 합성된 pal-LVH가 원래의 효능에 영향을 주지 않는다는 것을 지시한다. 또한 이것은 일반적으로 피부 침투율을 높이기 위해서 사용되는 팔미트산의 유도체화는 기존의 펩타이드 효능에는 영향을 주지 않는다는 Choi의 보고와 일치하고 있다[11].
- 즉, LVH와 pal-LVH 모두 고농도에서 뛰어난 상처치유능력을 보였다. 이를 통하여 LVH의 피부 침투 능력을 극대화하기 위한 팔미트산의 유도체화는 LVH의 상처치유능력에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.
- 그림에서 보는 바와 같이 양성대조군인 1% SLS의 경우 홍반 반응이 나타남을 확인하였지만, 음성 대조군 (blank, water, DMSO),10 uM LVH 와 pal-LVH 모두 홍반반응이 나타나지 않았다. 이를 통해 pal-LVH도 LVH와 마찬가지로 피부에 대해 안전하다는 것을 확인할 수 있었다.
- 44)로 유의하게 뛰어난 상처 치유능을 보였다. 즉, LVH와 pal-LVH 모두 고농도에서 뛰어난 상처치유능력을 보였다. 이를 통하여 LVH의 피부 침투 능력을 극대화하기 위한 팔미트산의 유도체화는 LVH의 상처치유능력에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.
- 에 나타내었다. 질량분석 스펙트럼에서 보는 바와 같이 LVH와 pal-LVH의 [M+H]+가 각각 368과 607로서 정확하게 일치하였다.
- 특히,50ppm의 농도의 LVH와 pal-LVH를 처리하였을 경우, 80.58% (±10.31), 75.38% (±1.44)로 유의하게 뛰어난 상처 치유능을 보였다.
후속연구
- 그러나 실제 임상시험과 기존의 보고된 보름달 물해파리 유래 펩타이드인 LVH의 상처치유 및 주름 개선을 유발하는 정확한 메커니즘 입증은 아직까지 밝혀져야 할 과제로 남아있다. 따라서 다양한 융합 연구를 통하여 주름개선 및 상처 회복 관련 기능성 화장품, 의약품개발 등에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.