선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그 다음으로, 사람에게 적용할 수 있는 중화항체로 제조하기 위하여 scFv 단백질을 인간 IgG와 융합된 단백질로 발현시키고자하였다. 이를 위해 scFv 유전자를 인간 IgG (Fc) cDNA를 포함하는 발현벡터인 pCR3-IgG에 넣어 pCR3-scFvIgG를 재조합하였다(그림.
- 항원에 대한 친화력이 높은 mAb 단백질을 제조하기 위한 수단으로 scFv를 사용하는 방법이 널리 응용되고 있다[11]. 본 연구에서는 BoNT/A에 대한 친화력이 높은 항체 단백질을 만들기 위하여 VH 유전자와 VL 유전자 사이에 LINKER(Gly4Ser1)3 DNA를 포함하는, VH-LINKER(Gly4Ser1)3-VL로 된 scFv 유전자를 PCR로 증폭하였다. 그 결과 약 800 bp의 단일 조각의 DNA 밴드를 얻었는데, 이것은 scFv의 예상 크기와 일치하였다(그림 1.
- 본 연구에서는 보툴리눔 A형 독소(BoNT/A)에 높은 친화력을 가지며 또한 감염된 환자에게 중화능을 갖는 효율적인 중화항체를 만들기 위하여 토끼에서 유래한 scFv와 인간 IgG가 연결된 융합단백질을 제조하고자 하였다. 이를 위하여, 먼저 BoNT/A로 두 번 주사한 토끼에서 혈액을 얻어 토탈 RNA를 추출하였다.
- 본 연구의 목적은 보툴리눔 A형 독소(BoNT/A)를 중화하는 재조합 항체를 개발해내고 그 특성을 분석하는데 있다. 이를 위하여 먼저 항원에 대한 결합력을 높이는 방법으로 알려진 scFv 유전자[11]를 BoNT/A로 면역된 토끼의 항체로 합성하였다.
제안 방법
- 2 마리의 토끼에 500 μl의 불완전 프로인트 항원보강제(Freund's Incomplete Adjuvant)(Difco, USA)와 500 μl의 BoNT/A를 혼합한 후 각각의 토끼에 주사하였다.
- BoNT/A에 대한 scFvIgG mAb의 중화 능력을 조사하기 위하여 in vivo 실험을 수행하였다. 이 실험에는 6주령에서 8 주령의 암컷 Balb/C와 ICR 마우스 (오리엔트바이오, Korea)를 사용하였다.
- BoNT/A에 대한 scFvIgG mAb의 중화능을 시험하기 위하여 ICR 마우스를 이용하여 in vivo에서 독소 중화분석 실험을 수행하였다. BoNT/A의 생물활성도는 1.
- BoNT/A의 생물활성도는 1.0x105 LD50이었는데, 이 BoNT/A와 10μg의 ScFvIgGmAb(#1-1, #1-2)를 혼합한 후, ICR 마우스의 복강에 주입하였고 마우스의 증상발현 및 생존 여부를 최소 48시간 동안 관찰하였다(그림 5).
- 4))로 투석한 후에 in vivo 실험에 사용하였다. ELISA로 항체의 농도를 측정하였다.
- 먼저, 재조합된 pCR3-ScFvIgG 플라스미드 DNA를 리포펙타민(Lipofectamine) (Invitrogen,USA)을 사용하여 CHO-DUKX (ATCC, USA) 세포에 주입하였다. G418 (Cambrex, USA)를 처리하여 얻은 colony들을 96-well 플레이트 (Falcon 3912)의 웰 당 1개의 세포씩 배양하여 선별하였고, methotrexate(Sigma, USA)를 처리하여 안정된 단일 세포주 (stablecell line)를 확보하였다. 이 CHO-DUKX 세포는 150mm 접시(dish)에서 배양하였다.
- TMB (3,3’,5,5’- Tetra methylbenzidine) microwell peroxidase substrate system(KPL, USA)을 이용하여 색 반응 분석실험을 수행하였고, Microplate Reader (BIO-RAD)를 사용하여 655 nm파장에서 흡광도(Optical Density, O.D)를 측정하였다.
- pCANTAB5E-scFv와 EcoRI과 PstI이 각각 포함된 프라이머 7과 8 (Table 1)을 사용하여 PCR을 실시하여 scFv이 포함된 DNA 조각을 증폭한 후 EcoRI/PstI으로 절단하였다. 이 DNA 조각을 인간 IgG의 Fc(constantregion, 불변부위) cDNA가 재조합된 pCR3 벡터, 즉 pCR3-IgG에 클로닝하였다.
- scFvIgG mAb 단백질의 BoNT/A에 대한 결합 친화력(binding affinity)을 조사하고 가장 높은 결합력을 나타내는 scFvIgG mAb를 생산하는 단일 세포를 선별하기 위하여 발현된 scFvIgG가 포함된 배양액을 사용하여 ELISA를 수행하였는데, 그 과정은 아래와 같다. BoNT/A (Miprolab, Germany)를 96-well 플레이트의 웰 당 1 μg/ml이 포함되도록 희석용액(dilution buffer)(2.
- scFvIgG mAb를 포함하고 있는 세포 배양액을 100μl 씩 따서 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 30분 동안 반응하였다. scFvIgG의 결합여부는 퍼록시데이즈가 결합된(인간 IgG 단백질에 대항하는) 염소의 항체(peroxidase conjugated goat anti-human IgG) (KPL, USA)로 반응하여 조사하였다. TMB (3,3’,5,5’- Tetra methylbenzidine) microwell peroxidase substrate system(KPL, USA)을 이용하여 색 반응 분석실험을 수행하였고, Microplate Reader (BIO-RAD)를 사용하여 655 nm파장에서 흡광도(Optical Density, O.
- 1%Tween 20)로 씻어낸 후, peroxidase conjugated goatanti-human IgG(KPL, USA)를 1:10,000으로 희석하여 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응하였다. 결합되지 않은 항체는 PBST로 씻어서 제거하였고, 결합된 항체는 DAB peroxidase development kit (Vector Lab, Inc.,USA)를 이용하여 시각화하였다.
- 5 % Tween 20, 1 X PBS)에 희석하여100 μl 씩 넣고 4 °C에서 16시간 동안 반응하여 코팅하였다. 그 다음에는 차단 용액(blocking buffer) (1 %FBS, 5 % sucrose, 0.05 % sodium azide)을 첨가하여 실온에서 1시간 30분 동안 반응하여 차단하였다. scFvIgG mAb를 포함하고 있는 세포 배양액을 100μl 씩 따서 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 30분 동안 반응하였다.
- 이 CHO-DUKX 세포는 150mm 접시(dish)에서 배양하였다. 그 다음으로, 세포배양액을 모아서 scFvIgG 유전자가 클로닝된 CHO-DUKX세포로부터 분비된 scFVIgG 단백질을 HiTrap protein A (Amersham Pharmacia, UK)를 사용하여 정제하였다. 이때 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)(Amersham Pharmacia, UK)를 이용하였고, 정제된 분획(fraction)을 모두 모아 Amicon Ultra 30 kDa 제한 필터(cut-off filter) (Millipore, USA)를 사용하여 단백질 용액을 농축하였다.
- 0x105 LD50(50% lethal dose)으로 확인하였다. 그룹 당 5 마리씩의 ICR 마우스를 사용하여 총 4개의 그룹(PBS only, BoNT/A, BoNT/A+scFvIgG (CH#1-1),BoNT/A+scFvIgG (CH#1-2))을 실험하였다. BoNT/A독소(1.
- 이를 위하여 먼저 항원에 대한 결합력을 높이는 방법으로 알려진 scFv 유전자[11]를 BoNT/A로 면역된 토끼의 항체로 합성하였다. 다음, 사람에게 적용할 수 있는 중화 항체로 개발하기 위해 scFv를 인간 IgG와 융합시킨 scFvIgG를 재조합한 후, scFvIgG 항체 단백질을 정제하였다. 이 정제된 단백질의 특성분석은 ELISA와 Western blotting을 통해 수행하였으며, 그리고 BoNT/A에 대한 중화능은 in vivo 실험으로 확인하였다.
- 첫 면역 8주 후, 토끼를 희생시키고 즉시 혈액을 모아 토탈 RNA(total RNA)를 추출하였다. 랜덤 헥사머(random hexamers)와 역전사효소(superscript reverse transcriptase) (Promega,USA)를 사용하여 토탈 RNA로부터 cDNA library를 합성하였다. 이 cDNA로부터 프라이머 3부터 6 (Table 1)을 이용하여 항체단백질의 무거운 사슬의 가변부위(VH,variable region of heavy chain) 유전자와 항체단백질의 가벼운 사슬의 가변부위(VL, variable region of lightchain) 유전자를 PCR (polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)로 증폭하여 얻었다.
- 이 실험에는 6주령에서 8 주령의 암컷 Balb/C와 ICR 마우스 (오리엔트바이오, Korea)를 사용하였다. 먼저 BoNT/A (Miprolab,Germany)에 의해 모두 죽는 범위를 설정하기 위하여 BoNT/A를 단계별로 희석한 후 ICR 마우스에 주입하여 사망 유무를 조사하였다. BoNT/A의 생물활성도는 1.
- 재조합된 scFvIgG 단백질의 발현을 확인하고 이 단백질의 중화능을 분석하기 위하여 항체 친화 크로마토그래피를 이용하여 scFvIgG 단백질을 정제하였는데, 그 과정은 다음과 같다. 먼저, 재조합된 pCR3-ScFvIgG 플라스미드 DNA를 리포펙타민(Lipofectamine) (Invitrogen,USA)을 사용하여 CHO-DUKX (ATCC, USA) 세포에 주입하였다. G418 (Cambrex, USA)를 처리하여 얻은 colony들을 96-well 플레이트 (Falcon 3912)의 웰 당 1개의 세포씩 배양하여 선별하였고, methotrexate(Sigma, USA)를 처리하여 안정된 단일 세포주 (stablecell line)를 확보하였다.
- 멤브레인을 5 % 탈지유가 포함된 PBS에 담구고 4 °C에서 16시간 반응하여 (비특이적인 결합을) 차단하였다.
- 멤브레인을 5 % 탈지유가 포함된 PBS에 담구고 4 °C에서 16시간 반응하여 (비특이적인 결합을) 차단하였다. 멤브레인을 PBST(137mM NaCl,10mM Na2HPO4, 2.7mM KCl, 1.8mM KH2PO4, 0.1%Tween 20)로 씻어낸 후, peroxidase conjugated goatanti-human IgG(KPL, USA)를 1:10,000으로 희석하여 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응하였다. 결합되지 않은 항체는 PBST로 씻어서 제거하였고, 결합된 항체는 DAB peroxidase development kit (Vector Lab, Inc.
- 재조합된 scFvIgG mAb 단백질을 발현하는 안정된세포주를 구축하고 BoNT/A에 결합력이 뛰어난 단백질을 얻기 위하여, 먼저 플라스미드 pCR3-scFvIgG를CHO-DUKX 세포에 주입하여 안정된 단일 세포주인 CH#1을 확보하였다. 이 CH#1 세포를 단일클론(monoclonal)으로 제작하기 위하여 G418을 처리하여생긴 콜로니(colony)를 96-well 플레이트에 웰 당 세포하나씩 옮겨서 배양하였고 ELISA를 실시하여 BoNT/A에 결합 능력이 높은 단백질을 생산해내는 세포주를 선별하였다. 그 결과 BoNT/A에 결합력이 가장 뛰어난 scFvIgG mAb 단백질을 분비하는 세포주는 CH#1-1과CH#1-2이었다.
- lane 3). 이 DNA 조각을 pCANTAB5E phagemid vector에 클로닝함으로써 scFv DNA library를 구축하였다.
- 이를 위하여, 먼저 BoNT/A로 두 번 주사한 토끼에서 혈액을 얻어 토탈 RNA를 추출하였다. 이 RNA로 RT-PCR을 수행하여 항 토끼 항체단백질의 VH와 VL에 대한 cDNA library를 확보하였다. 이 실험에는 프라이머 3에서 6 (Table 1)을 사용하였고 VH 유전자와 VL 유전자를 포함하는 DNA 조각을 증폭한 결과는 그림 1에서 보여주고 있다.
- 랜덤 헥사머(random hexamers)와 역전사효소(superscript reverse transcriptase) (Promega,USA)를 사용하여 토탈 RNA로부터 cDNA library를 합성하였다. 이 cDNA로부터 프라이머 3부터 6 (Table 1)을 이용하여 항체단백질의 무거운 사슬의 가변부위(VH,variable region of heavy chain) 유전자와 항체단백질의 가벼운 사슬의 가변부위(VL, variable region of lightchain) 유전자를 PCR (polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)로 증폭하여 얻었다. 확보한 VH 유전자와 VL 유전자를 VH-LINKER(Gly4Ser1)3 –VL의 단일 유전자, 즉 scFv(single-chain variable domain fragment, 단일 사슬로 이뤄진 가변부위) 유전자로 만들기 위하여 VH유전자와 VL 유전자 및 pCANTAB5E phagemid kit(Amersham Pharmacia, UK)의 연결 DNA (Linker DNA)를 주형으로 사용하고, 프라이머 1에서 6 (Table1)을 이용하여 PCR을 실시하였다.
- 다음, 사람에게 적용할 수 있는 중화 항체로 개발하기 위해 scFv를 인간 IgG와 융합시킨 scFvIgG를 재조합한 후, scFvIgG 항체 단백질을 정제하였다. 이 정제된 단백질의 특성분석은 ELISA와 Western blotting을 통해 수행하였으며, 그리고 BoNT/A에 대한 중화능은 in vivo 실험으로 확인하였다.
- 그 다음으로, 세포배양액을 모아서 scFvIgG 유전자가 클로닝된 CHO-DUKX세포로부터 분비된 scFVIgG 단백질을 HiTrap protein A (Amersham Pharmacia, UK)를 사용하여 정제하였다. 이때 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)(Amersham Pharmacia, UK)를 이용하였고, 정제된 분획(fraction)을 모두 모아 Amicon Ultra 30 kDa 제한 필터(cut-off filter) (Millipore, USA)를 사용하여 단백질 용액을 농축하였다. 농축된 단백질은 PBS(137mM NaCl,10mM Na2HPO4, 2.
- 본 연구의 목적은 보툴리눔 A형 독소(BoNT/A)를 중화하는 재조합 항체를 개발해내고 그 특성을 분석하는데 있다. 이를 위하여 먼저 항원에 대한 결합력을 높이는 방법으로 알려진 scFv 유전자[11]를 BoNT/A로 면역된 토끼의 항체로 합성하였다. 다음, 사람에게 적용할 수 있는 중화 항체로 개발하기 위해 scFv를 인간 IgG와 융합시킨 scFvIgG를 재조합한 후, scFvIgG 항체 단백질을 정제하였다.
- 본 연구에서는 보툴리눔 A형 독소(BoNT/A)에 높은 친화력을 가지며 또한 감염된 환자에게 중화능을 갖는 효율적인 중화항체를 만들기 위하여 토끼에서 유래한 scFv와 인간 IgG가 연결된 융합단백질을 제조하고자 하였다. 이를 위하여, 먼저 BoNT/A로 두 번 주사한 토끼에서 혈액을 얻어 토탈 RNA를 추출하였다. 이 RNA로 RT-PCR을 수행하여 항 토끼 항체단백질의 VH와 VL에 대한 cDNA library를 확보하였다.
- 그 다음으로, 사람에게 적용할 수 있는 중화항체로 제조하기 위하여 scFv 단백질을 인간 IgG와 융합된 단백질로 발현시키고자하였다. 이를 위해 scFv 유전자를 인간 IgG (Fc) cDNA를 포함하는 발현벡터인 pCR3-IgG에 넣어 pCR3-scFvIgG를 재조합하였다(그림. 2.
- 후보 플라스미드 DNA를 EcoRI/Xba I 으로 절단하여 삽입 DNA(insert DNA)의 크기를 확인하였다. 재조합된 DNA의 염기서열 분석을 마크로젠(Korea)에 의뢰하였다. 플라스미드 pCR3-IgG는 인간 IgG의 Fc의 cDNA를 포유동물세포 발현 벡터인 플라스미드 pCR3 (Invitrogen, USA)에 클로닝한 것이다(Park, unpublished).
- (a)). 재조합된 scFvIgG DNA를 분석하기 위하여 플라스미드 DNA를 추출하였고, EcoRI과 XbaI으로 절단하여 약 1,560 bp의 DNA 밴드를 확인하였다(그림. 2.
- 재조합된 scFvIgG mAb 단백질을 발현하는 안정된세포주를 구축하고 BoNT/A에 결합력이 뛰어난 단백질을 얻기 위하여, 먼저 플라스미드 pCR3-scFvIgG를CHO-DUKX 세포에 주입하여 안정된 단일 세포주인 CH#1을 확보하였다. 이 CH#1 세포를 단일클론(monoclonal)으로 제작하기 위하여 G418을 처리하여생긴 콜로니(colony)를 96-well 플레이트에 웰 당 세포하나씩 옮겨서 배양하였고 ELISA를 실시하여 BoNT/A에 결합 능력이 높은 단백질을 생산해내는 세포주를 선별하였다.
- 재조합된 scFvIgG 단백질의 발현을 확인하고 이 단백질의 중화능을 분석하기 위하여 항체 친화 크로마토그래피를 이용하여 scFvIgG 단백질을 정제하였는데, 그 과정은 다음과 같다. 먼저, 재조합된 pCR3-ScFvIgG 플라스미드 DNA를 리포펙타민(Lipofectamine) (Invitrogen,USA)을 사용하여 CHO-DUKX (ATCC, USA) 세포에 주입하였다.
- 정제된 단백질을 10 % SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 하여 단백질의 크기를 조사하였다. 전기영동하여 분리된 단백질을 멤브레인 (polyvinylidene fluoride transfer membrane) (Pall.
- 첫 면역 1주 후, 동일한 혼합액으로 토끼에 다시 한 번 더 주사하였다. 첫 면역 8주 후, 토끼를 희생시키고 즉시 혈액을 모아 토탈 RNA(total RNA)를 추출하였다. 랜덤 헥사머(random hexamers)와 역전사효소(superscript reverse transcriptase) (Promega,USA)를 사용하여 토탈 RNA로부터 cDNA library를 합성하였다.
- 확보한 VH 유전자와 VL 유전자를 VH-LINKER(Gly4Ser1)3 –VL의 단일 유전자, 즉 scFv(single-chain variable domain fragment, 단일 사슬로 이뤄진 가변부위) 유전자로 만들기 위하여 VH유전자와 VL 유전자 및 pCANTAB5E phagemid kit(Amersham Pharmacia, UK)의 연결 DNA (Linker DNA)를 주형으로 사용하고, 프라이머 1에서 6 (Table1)을 이용하여 PCR을 실시하였다. 합성된 scFv 유전자를 포함하는 DNA 조각을 제한효소 SfiI/NotI으로 절단한 후 pCANTAB5E 벡터에 클로닝하여 pCANTAB5E-scFv를 재조합하였다.
- 5 ml이 되도록 PBS와 혼합하여 사용하였다. 혼합액을 마우스의 복강에 주입한 후, 죽거나 생존한 마우스의 개체 수 및 생존시간을 조사하였다.
- 확보한 VH 유전자와 VL 유전자를 VH-LINKER(Gly4Ser1)3 –VL의 단일 유전자, 즉 scFv(single-chain variable domain fragment, 단일 사슬로 이뤄진 가변부위) 유전자로 만들기 위하여 VH유전자와 VL 유전자 및 pCANTAB5E phagemid kit(Amersham Pharmacia, UK)의 연결 DNA (Linker DNA)를 주형으로 사용하고, 프라이머 1에서 6 (Table1)을 이용하여 PCR을 실시하였다.
- 이 DNA 조각을 인간 IgG의 Fc(constantregion, 불변부위) cDNA가 재조합된 pCR3 벡터, 즉 pCR3-IgG에 클로닝하였다. 후보 플라스미드 DNA를 EcoRI/Xba I 으로 절단하여 삽입 DNA(insert DNA)의 크기를 확인하였다. 재조합된 DNA의 염기서열 분석을 마크로젠(Korea)에 의뢰하였다.
대상 데이터
- 이때 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)(Amersham Pharmacia, UK)를 이용하였고, 정제된 분획(fraction)을 모두 모아 Amicon Ultra 30 kDa 제한 필터(cut-off filter) (Millipore, USA)를 사용하여 단백질 용액을 농축하였다. 농축된 단백질은 PBS(137mM NaCl,10mM Na2HPO4, 2.7mM KCl, 1.8mM KH2PO4(pHis7.4))로 투석한 후에 in vivo 실험에 사용하였다. ELISA로 항체의 농도를 측정하였다.
- BoNT/A에 대한 scFvIgG mAb의 중화 능력을 조사하기 위하여 in vivo 실험을 수행하였다. 이 실험에는 6주령에서 8 주령의 암컷 Balb/C와 ICR 마우스 (오리엔트바이오, Korea)를 사용하였다. 먼저 BoNT/A (Miprolab,Germany)에 의해 모두 죽는 범위를 설정하기 위하여 BoNT/A를 단계별로 희석한 후 ICR 마우스에 주입하여 사망 유무를 조사하였다.
- 이 실험에서 사용한 토끼는 뉴질랜드산 흰 토끼로 약3 Kg, 15주령의 암컷을 구입하였고(Samtako, Korea), BoNT/A는 Miprolab (Germany)사에서 구입하여 사용하였다. 보툴리눔 독소를 토끼에 주사하기 직전에 먼저 면역전 혈청을 모았다.
- 이 결과는 삽입된 scFvIgG DNA의 예상 크기와 일치하는 것이다. 총 18개의 플라스미드 DNA의 염기서열 분석을 의뢰하였다 (마크로젠, Korea). 그 중 15개의 플라스미드 DNA에는 기존에 밝혀진 염기서열(Synthetic construct single chain Fv antibody fragment, AY307933, gi:43730092)과 동일한 scFv DNA가 들어있다는 것을 알 수 있었다.
성능/효과
- 그 결과, PBS를 주입한 군은 모두 생존하였고, BoNT/A를 주입한 군은 15시간 이내에 모두 사망하였으며, BoNT/A+ScFvIgG (#1-1)를 주입한 군의 경우 36시간 이내에 모두 사망하였다. 이와 반면에 BoNT/A+ScFvIgG (#1-2)를 주입한 군의 경우 36시간 이내에 2마리만 사망하였고, 3마리는 40 ̴48시간까지 생존하였다.
- 총 18개의 플라스미드 DNA의 염기서열 분석을 의뢰하였다 (마크로젠, Korea). 그 중 15개의 플라스미드 DNA에는 기존에 밝혀진 염기서열(Synthetic construct single chain Fv antibody fragment, AY307933, gi:43730092)과 동일한 scFv DNA가 들어있다는 것을 알 수 있었다. 나머지 3개의 플라스미드 DNA는 모두 VH 유전자와 VL 유전자가 아직까지 밝혀지지 않은 새로운 염기서열을 포함하고 있다는 것을 알 수 있었다.
- 그 중 15개의 플라스미드 DNA에는 기존에 밝혀진 염기서열(Synthetic construct single chain Fv antibody fragment, AY307933, gi:43730092)과 동일한 scFv DNA가 들어있다는 것을 알 수 있었다. 나머지 3개의 플라스미드 DNA는 모두 VH 유전자와 VL 유전자가 아직까지 밝혀지지 않은 새로운 염기서열을 포함하고 있다는 것을 알 수 있었다. 그림 2에서는 그 중 하나인 플라스미드 #1의 결과를 보여주고 있다.
- 마우스를 이용한 in vivo 독성 중화능 실험을 수행한 결과 10μg의 scFvIgG 항체는 BoNT/A(100,000LD50)의 독성이 주입된 마우스를 완전히 방어하지는 못했으나 마우스의 생존 기간을 현저히 연장시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 얻은 재조합 항체, scFvIgG mAb의 특성을 ELISA와 Western blot으로 분석한 결과, scFvIgGmAb는 농도 의존적으로 BoNT/A와 반응하는 것을 알 수 있었고, BoNT/A와 특이적으로 결합한다는 것을 확인하였다. 마우스를 이용한 in vivo 독성 중화능 실험을 수행한 결과 10μg의 scFvIgG 항체는 BoNT/A(100,000LD50)의 독성이 주입된 마우스를 완전히 방어하지는 못했으나 마우스의 생존 기간을 현저히 연장시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 이 실험에는 프라이머 3에서 6 (Table 1)을 사용하였고 VH 유전자와 VL 유전자를 포함하는 DNA 조각을 증폭한 결과는 그림 1에서 보여주고 있다. 아가로즈 젤 전기영동으로 410 bp의 VH 유전자와 340 bp의 VL 유전자를 포함하는 DNA를 얻었는데, 예상과 그 크기가 일치하였다.(그림 1.
- 마우스를 이용한 in vivo 독성 중화능 실험을 수행한 결과 10μg의 scFvIgG 항체는 BoNT/A(100,000LD50)의 독성이 주입된 마우스를 완전히 방어하지는 못했으나 마우스의 생존 기간을 현저히 연장시킨다는 것을 알 수 있었다. 이 결과들은 scFvIgG mAb는 BoNT/A를 중화하는 효능을 가지고 있음을 제시하며, 보툴리즘을 치료할 수 있는 생물치료제로 개발될 수 있는 잠재력도가지고 있음을 보여준다. 그것은 또한 보툴리눔 독성의 감염여부를 판단하는데 활용될 수 있으며 보툴리눔 독소를 정제하는 데에도 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이 세포들을 배양하여 배양액을 모은 다음, 세포 배양액으로 분비된 scFvIgG 단백질을 protein A 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 scFvIgG 단백질로 SDS-PAGE를 실시하여 55 kDa의 단일 밴드를 관찰하였고, peroxidase conjugated goatanti-human IgG antibody를 사용하여 Western blotting을 실시한 결과, 단일 밴드를 확인할 수 있었다(그림 3.).
- ). 정제된 scFvIgG 단백질의 항체 특이성을 ELISA로 분석하였는데, scFvIgG mAb는 높은 농도에서는 농도 의존적으로 (BoNT/A와) 반응하는 것을 보였다. 이것은 BoNT/A의 polyclonal antibody (NIBSC, UK)와 유사하게 반응한다는 것을 알 수 있었다(그림 4.
후속연구
- 이 결과들은 scFvIgG mAb는 BoNT/A를 중화하는 효능을 가지고 있음을 제시하며, 보툴리즘을 치료할 수 있는 생물치료제로 개발될 수 있는 잠재력도가지고 있음을 보여준다. 그것은 또한 보툴리눔 독성의 감염여부를 판단하는데 활용될 수 있으며 보툴리눔 독소를 정제하는 데에도 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.