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문제 정의
- 새덕이 정유는 독특한 향 특성뿐만 아니라 병원균 성장 억제 활성, 여드름 유발 박테리아에 의한 염증 억제 활성, 미백효능을 가지는 것으로 밝혀졌지만, DPPH radical 소거활성을 제외한 다른 항산화 활성에 대한 연구가 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 새덕이 잎의 활용가치를 높이고자 새덕이 잎으로부터 정유를 추출하여, 새덕이 잎 정유의 구성 성분에 대한 기초 자료를 제공하고, 다양한 항산화 활성을 평가하여 산업적 이용가능성 및 부가 가치를 확인하였다.
- 본 연구에서는 국내에 식재되어 있는 녹나무과 참식나무속인 새덕이의 잎 부위로부터 정유를 추출하여 주요 성분을 GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectroscopy)로 분석하여 구성성분에 대한 기초자료를 획득하고, 항산화 활성 정도를 조사하여 새덕이 잎 정유의 이용성 및 부가적 가치를 확인하고자 한다.
- 새덕이 잎 정유의 항산화 활성을 알아보기 위해 DPPH assay를 수행하였다. 본 연구에서는 새덕이 잎 정유의 성분이 radical을 뺏거나 전자를 공여하는 등의 radical 소거 기작을 통해 free radical의 전자적 안정감을 주는 항산화 소재로 이용이 가능한지를 알아보았다(Kim et al., 2011B). 천연 항산화제로 널리 알려져 있는 ascorbic acid를 대조구로 한 새덕이 잎 정유의 radical 소거능에 대한 결과는 Fig.
제안 방법
- 10 ℓ 둥근 플라스크에 약 1 kg의 새덕이 잎과 6 ℓ의 증류수를 첨가하고 가열용 맨틀(MS-DM608 heating mantle, MTOPS®, Yangju, Korea)을 이용하여 가열하였으며, 가열 온도는 102 ± 1℃로 설정하였다.
- ABTS radical 소거활성 측정은 Re et al. (1999)의 방법을 변형하여 사용하였다. ABTS가 과황산칼륨(potassium persulfate)에 의해 전자를 잃게 되면 짙은 청녹색을 띄지만, 항산화 물질의 전자공여능으로 그 색이 옅어진다.
- ABTS 메탄올 희석용액 190 μℓ와 메탄올로 희식시킨 새덕이 잎 정유(100, 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/mℓ) 10 μℓ를 혼합하여 30분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
- Blank로 에탄올을 사용하였으며, gallic acid (Sigma-aldrich Co. LLC, St. Louis, USA)를 에탄올(ethanol)에 희석하여 0∼100 μℓ/mℓ의 농도로 제조하고 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하였다.
- DPPH free radical의 50%를 소거시키는데 필요한 정유의 농도인 EC50 (the term half maximal effective concentration) 값도 조사하였다.
- 95%)로 분석되었다. 다음으로 새덕이 잎 정유의 항산화 활성을 검증하기 위해 총 페놀함량, DPPH radical 소거활성, ABTS radical 소거활성 및 FRAP 분석을 수행하였다. 새덕이 잎 정유의 총 페놀함량은 136.
- 먼저, 메탄올에 6개의 다른 농도(100, 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/mℓ)로 용해시킨 새덕이 잎 정유 800 μℓ를 메탄올로 용해시킨 0.15 mM DPPH solution 200 μℓ (Sigma-aldrich Co. LLC, St. Louis, MO, USA)와 혼합한 다음 암실에서 30분간 상온 방치하였다.
- 5% Na2CO3 용액 400 μℓ를 가하여 암실에서 1시간 동안 상온 반응시켰다. 반응이 끝난 시료를 분광 광도계(EpochTM Multi-Volume multi-sample spectrophotomer system, Biotek, Winooski, USA)를 사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank로 에탄올을 사용하였으며, gallic acid (Sigma-aldrich Co.
- Louis, MO, USA)와 혼합한 다음 암실에서 30분간 상온 방치하였다. 분광 광도계(EpochTM Multi-Volume multi-sample spectrophotomer system, Biotek, Winooski, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank로는 메탄올을 사용하였으며, 대조화합물로는 ascorbic acid를 사용하였다.
- 새덕이 잎 정유 성분 분석은 GC/MS 장비(Trace 1310/ISQ-LT, Thermo Fisher Scientific, USA)로 수행하였다. 컬럼은 DB-5MS 모세관 컬럼(길이 60 m, 내부직경 0.
- 6), 증류수에 용해시킨 20 mM FeCl3⋅6H2O, 40 mM HCl에 용해시킨 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)을 각각 10 : 1 : 1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37℃에서 10분간 가온한 뒤 사용하였다. 새덕이 잎 정유 시료와 FRAP 시약을 혼합하여 암실에서 30분간 상온 반응시켜 준 뒤, 분광 광도계(EpochTM Multi-Volume multi-sample spectrophotomer system, Biotek, Winooski, USA)를 사용하여 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP value는 Iron(II) sulfate heptahydrate (FeSO4⋅7H2O)를 표준물질로 하여 얻은 표준검량선으로부터 계산하였으며, 2가철 당량(Fe(II) equivalent, μM/g)으로 산출하였다.
- 새덕이 잎 정유의 구성성분 분석 및 정량 분석은 GC/MS 분석을 통해 조사하였으며, 그 결과는 Fig. 1과 Table 1에 나타내었다. 녹나무과 참식나무속인 새덕이의 잎 정유는 주로 monoterpnene과 sesquiterpene으로 구성되어 있는 것으로 나타났다.
- 새덕이 잎 정유의 항산화 활성 정도를 측정하기 위해 ABTS assay를 수행하였다. ABTS radical 소거활성은 산화유도제인 과황산칼륨과 반응하여 형성된 ABTS 양이온이 시료의 항산화 물질에 의해 제거될때 일어나는 탈색 반응을 이용하여 물질의 항산화 능력을 측정하는 방법이다.
- 시료에 존재하는 물질들 중 표준물질이 확보되지 않은 물질들(cis-ocimene, elemol, germacrene-D, γ-elemene, τ-muurolol, γ-eudesmol, germacrene-B, β-farnesene, α-cadinol, τ-cadinol, β-cubebene, α-muurolene, β-muurolene, γ-muurolene, δ-cadinol, veridiflorol, α-fenchene)의 정성은 시료의 TIC(total-ion chromatogram)에서 S/N 비율 100 이상의 피크들의 질량스펙트럼을 NIST 11 (National Institute of Standards and Technology, USA) mass spectral library와 비교하여 수행하였다.
- 시료에 존재하는 화합물들의 정량은 각 피크의 질량스펙트럼을 정성한 다음 내부표준물질 피크의 면적과 목적 화합물 피크의 면적비율과 농도간의 직선적 상관성을 이용한 내부표준물질 정량법을 통하여 정량하였다.
- 내부 표준물질 용액은 n-헵탄올(n-heptanol)과 n-테트라데칸산메틸에스터(n-tetradecanoate methyl ester)를 메탄올(methanol)과 디클로로메탄(dichloromethane)의 혼합액(3 : 1, v/v)에 녹여 제조하였다. 액상의 시료를 내부 표준물질 용액으로 균질화하여 분석 시료액을 제조하였으며, 정량을 위한 외부 표준물질 용액은 표준물질을 취하여 내부 표준물질 용액으로 균질화해 표준물질 원액을 제조하였으며, 분석 시 농도는 1-1,000 ppm 수준이 되도록 제조하였다.
- 시료에 존재하는 물질들 중 표준물질이 확보되지 않은 물질들(cis-ocimene, elemol, germacrene-D, γ-elemene, τ-muurolol, γ-eudesmol, germacrene-B, β-farnesene, α-cadinol, τ-cadinol, β-cubebene, α-muurolene, β-muurolene, γ-muurolene, δ-cadinol, veridiflorol, α-fenchene)의 정성은 시료의 TIC(total-ion chromatogram)에서 S/N 비율 100 이상의 피크들의 질량스펙트럼을 NIST 11 (National Institute of Standards and Technology, USA) mass spectral library와 비교하여 수행하였다. 이때 NIST librarysearch 프로그램의 match 값이 가장 높은 것을 선택하여 monoterpene류와 sesquiterpene류를 중점적으로 확인하였고 피크들의 RT (retention time)와 비교 확인된 화합물명을 목록화하였다.
- Louis, USA)를 에탄올(ethanol)에 희석하여 0∼100 μℓ/mℓ의 농도로 제조하고 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하였다. 이러한 검량선을 이용하여 갈산 당량가(equivalent gallic acid, mg GAE/g)로 정유 시료의 총 페놀함량을 산출하였다.
- 질량스펙트럼은 EI-positive 스캔 범위 35∼550 m/z로 0.2scans⋅s-1의 속도로 TIC를 획득하였다.
- , 2002). 총 페놀함량 분석은 phosphomolybdic acid와 반응하면 청색으로 발색되는 Folin-Ciocalteau 시약을 사용하였으며, 그 값은 갈산 당량가(gallic acid equivalent, mg GAE/g)로 표시하였다(R2 = 0.9959). 새덕이 잎 정유의 총 페놀함량을 측정한 결과, 새덕이 잎 정유의 총 페놀함량은 136.
- 화합물의 검출은 질량분석기로 하였고 인터페이스와 이온소스의 온도는 각각 250℃로 하였다. 질량스펙트럼은 EI-positive 스캔 범위 35∼550 m/z로 0.
대상 데이터
- 분광 광도계(EpochTM Multi-Volume multi-sample spectrophotomer system, Biotek, Winooski, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank로는 메탄올을 사용하였으며, 대조화합물로는 ascorbic acid를 사용하였다. 모든측정은 3회 반복 수행하였다.
- 본 연구에서 사용된 시험재료는 새덕이(Neolitsea aciculata (Blume) Koidz) 잎으로, 2016년 3월경 제주도 서귀포시에 위치한 국립산림과학원 난대아열대산림연구소 시험림에서 채취하였으며, 채취한 잎은 곧바로 4℃ 이하에서 냉장 보관하였고, 정유 추출을 시작하기 전에 잘게 자른 후 시험 재료로 사용하였다.
- ABTS 메탄올 희석용액 190 μℓ와 메탄올로 희식시킨 새덕이 잎 정유(100, 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/mℓ) 10 μℓ를 혼합하여 30분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 시료를 녹인 용매인 메탄올을 대조군으로 하였으며, 식(1)에 의하여 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 모든 측정은 3회 반복 수행하였다.
- 컬럼은 DB-5MS 모세관 컬럼(길이 60 m, 내부직경 0.25 mm, 코팅필름 두께 0.25 μm; Agilent)을 사용하였다.
이론/모형
- DPPH radical 소거활성은 Brand-Williams의 방법(Brand-Williams et al., 1995)을 개량하여 DPPH에 대한 전자공여활성(electron donating ability, EDA)으로 나타내었다. 먼저, 메탄올에 6개의 다른 농도(100, 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/mℓ)로 용해시킨 새덕이 잎 정유 800 μℓ를 메탄올로 용해시킨 0.
- FRAP 측정은 Benzie-Strain (Benzie and Strain, 1999)의 방법을 따랐다. FRAP 시약은 300 mM acetate buffer (pH 3.
- FRAP값은 Benzie-Strain의 방법에 따라 측정하였으며, 그 값은 2가철 당량(Fe(II) equivalent, μM/g)으로 산출하였다.
- 새덕이 잎 정유의 항산화 활성을 알아보기 위해 DPPH assay를 수행하였다. 본 연구에서는 새덕이 잎 정유의 성분이 radical을 뺏거나 전자를 공여하는 등의 radical 소거 기작을 통해 free radical의 전자적 안정감을 주는 항산화 소재로 이용이 가능한지를 알아보았다(Kim et al.
- 정유(essential oil) 추출은 hydrodistillation법으로 추출하였다. 10 ℓ 둥근 플라스크에 약 1 kg의 새덕이 잎과 6 ℓ의 증류수를 첨가하고 가열용 맨틀(MS-DM608 heating mantle, MTOPS®, Yangju, Korea)을 이용하여 가열하였으며, 가열 온도는 102 ± 1℃로 설정하였다.
- 총 페놀함량(total phenolic content)은 Folin-Denis법(Gutfinger, 1981)을 개량하여 측정하였다. 새덕이 잎 정유 100 μℓ에 2N Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich Co.
성능/효과
- Hydrodistillation 법을 이용하여 새덕이 잎에서 정유를 추출한 결과, 0.28 ± 0.09%의 수율을 나타내었다.
- Hydrodistillation법을 통해 얻은 새덕이 잎 정유를 GC/MS를 이용하여 성분 분석을 한 결과, 정유는 주로 sesquiterpene류와 monoterpene류로 구성되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 새덕이 잎 정유의 주요 구성성분은 cis-ocimene (11.
- 녹나무과 참식나무속인 새덕이의 잎 정유는 주로 monoterpnene과 sesquiterpene으로 구성되어 있는 것으로 나타났다. Monoterpene류가 약 28.3%, sesquiterpene류가 약 48.2%를 차지하였으며, sesquiterpene류가 monoterpene류의 화합물에 비해 약 1.7배 함유비율이 높은 것으로 나타났다. Lim et al.
- 1과 Table 1에 나타내었다. 녹나무과 참식나무속인 새덕이의 잎 정유는 주로 monoterpnene과 sesquiterpene으로 구성되어 있는 것으로 나타났다. Monoterpene류가 약 28.
- (2016)은 로즈마리 잎 정유의 경우 EC50 값이 2,775 μg/mℓ라고 밝혔다. 따라서 새덕이 잎 정유의 free radical 소거능은 타임레드, 서양톱풀, 자스민, 로즈마리 잎 정유보다 우수한 것으로 나타났다.
- 새덕이 잎 정유의 DPPH radical 소거능은 타임레드, 서양톱풀 자스민 등의 정유보다 우수한 것으로 나타났으며, ABTS radical 소거능이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 새덕이 잎 정유가 페니로얄 정유와 비교하여 FRAP 활성, 즉 환원능이 더 우수한 것으로 나타났다. 새덕이 잎 정유의 주요 구성성분과 항산화 활성의 관계성에 대해서는 단일 물질에 대한 항산화 활성 검증 실험이 필요하다.
- 또한, 새덕이 잎 정유의 주요 구성성분은 cis-ocimene (11.00%), trans-ocimene(9.65%), elemol (9.15%), β-elemene (8.75%), germacrene-D (7.55%), trans-caryophyllene (5.90%), γ-elemene (5.40%), τ-muurolol (4.95%)로 분석되었다.
- 새덕이 잎 정유는 농도 의존적으로 DPPH free radical 소거능이 증가하는 것으로 나타났으며, DPPH radical을 50% 소거하는데 필요한 효과 농도인 EC50 값은 639.33 μg/mℓ로 나타났다(Table 2).
- 새덕이 잎 정유의 100, 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/mℓ 농도에서 ABTS radical 소거활성은 각각 6.47%, 7.71%, 16.19%, 19.33%, 21.34% 및 31.80%로 증가하는 경향이 나타났다.
- 13 mg GAE/g으로 나타났다. 새덕이 잎 정유의 DPPH radical 소거능은 타임레드, 서양톱풀 자스민 등의 정유보다 우수한 것으로 나타났으며, ABTS radical 소거능이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 새덕이 잎 정유가 페니로얄 정유와 비교하여 FRAP 활성, 즉 환원능이 더 우수한 것으로 나타났다.
- 새덕이 잎 정유의 주성분은 cis-ocimene (11.00%), trans-ocimene (9.65%), elemol (9.15%), β-elemene (8.75%), germacrene-D (7.55%), trans-caryophyllene (5.90%), γ-elemene (5.40%), τ-muurolol (4.95%)으로 분석되었다.
- 새덕이 잎 정유의 총 페놀함량을 측정한 결과, 새덕이 잎 정유의 총 페놀함량은 136.7 ± 0.13 mg GAE/g으로 나타났다.
- (2012)은 페니로얄 정유의 FRAP 값이 약 7 μM/g이라고 하였다. 이러한 결과를 통해 새덕이 잎 정유가 페니로얄 정유보다 환원능이 우수하고, 더 나은 항산화능을 가진다고 사료된다.
후속연구
- 본 연구의 결과를 통해 녹나무과 참식나무속 식물인 새덕이의 잎 정유는 식품 혹은 화장품 등의 산화 억제를 위한 첨가물 형태로 다양한 분야에 적용이 가능할 것으로 보여진다.
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