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문제 정의
- 이후 미생물 시험 (건조 필름법)을 통해 대장균군은 음성반응, 일반세균은 260cfu/g임을 확인하였다. 刀豆 및 牛蒡根 70%에탄올 추출물의 대량생산시스템 구축을 위해 (주)테코스에 의뢰하였으며, 각 원료에 제조보고서를 받았다. 대량생산한 원료의 성상, 영양 성분, 유해물질 여부를 확인하기 위해 건강기능식품연구원에 의뢰하여 최종 물질의 유해성이 없음을 확인하였다.
- 따라서 刀豆 추출물 단독투여보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여에 의한 스트레스 완화 효과를 확인할 수 있었다. 刀豆와 牛 蒡根의 면역 조절에 관한 선행 연구결과는 확인할 수 없었지 만, 이번 실험을 통해 부동화 스트레스 마우스모델에 刀豆 및 牛蒡根 추출물을 경구투여한 후 변화하는 면역 관련 지표들을 확인해 보았다. 그 결과, 刀豆 추출물을 단독으로 경구투여한 마우스 그룹보다 刀豆와 牛蒡根 1:4 복합물을 투여한 마우스 그룹에서 T/B cell 및 macrophage, NK cell 등 면역세포의 수와 활성 및 IgA 생성량이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다.
- 따라서 본 연구에서는 식물 유래 추출물인 刀豆와 牛蒡根 추출물의 스트레스 매개 면역조절능력을 평가하며, 刀豆, 牛 蒡根 추출물을 혼합하였을 때 상승효과로 나타나는 스트레스 매개 면역조절 효과를 평가하고자 하였다. 나아가 刀豆와 牛 蒡根의 기능성 식품으로의 활용 가능성을 확인하여 기능성 식품의 개발에 도움이 되고자 연구하였다.
- 따라서 본 연구에서는 식물 유래 추출물인 刀豆와 牛蒡根 추출물의 스트레스 매개 면역조절능력을 평가하며, 刀豆 추출 물과 牛蒡根 추출물을 혼합하였을 때 나타나는 스트레스 매개 면역조절 상승효과를 in vivo에서 확인해보았다. 최근 Anna Jung 등에 의해 부동화 스트레스를 유도한 동물모델에서 혈장 내 Cortisol 수치가 높으며, 스트레스 완화 모델에서는 Cortisol 수치가 감소한다고 보고하였는데22) , 본 연구에서도 부동화 스트레스를 유도한 마우스모델에서 혈장 내 Cortisol 수치가 증가하였으며 刀豆 추출물 단독투여보다는 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물을 투여하였을 때 Cortisol 수치는 더욱 감소됨을 확인할 수 있었다.
- 따라서 본 연구에서는 식물 유래 추출물인 刀豆와 牛蒡根 추출물의 스트레스 매개 면역조절능력을 평가하며, 刀豆, 牛 蒡根 추출물을 혼합하였을 때 상승효과로 나타나는 스트레스 매개 면역조절 효과를 평가하고자 하였다. 나아가 刀豆와 牛 蒡根의 기능성 식품으로의 활용 가능성을 확인하여 기능성 식품의 개발에 도움이 되고자 연구하였다.
- 본 연구는 스트레스로 인한 면역기능 억제에 따른 질병을 예방하기 위해, 인체에 안전하면서 면역력을 증진시킬 수 있는 식품소재로 刀豆와 牛蒡根을 선정하여, 부동화 스트레스 마우스 모델에 刀豆와 牛蒡根과 刀豆, 牛蒡根 복합물에 의한 스트레스 인자 개선 및 면역력 증진 효과를 연구한 결과는 다음과 같다.
- 본 연구는 아직 광범위하게 다루어지지 않은 식물 유래 추출물의 스트레스 매개 면역조절능력을 평가하며, 식물 유래 추출물들을 혼합하였을 때 상승효과로 나타나는 스트레스 매개 면역조절능력을 평가하기 위해 시행되었다. 刀豆(Canavalia gladiata)는 항염증 및 항산화 작용 등에 효능이 있다고 이미 보고된 바가 있다14,15) .
- 본 연구는 아직 광범위하게 다루어지지 않은 식물유래 추출물의 스트레스 매개 면역조절능력을 평가하고자 하였다. 刀豆(Canavalia gladiata)는 콩과 한해살이 덩굴성 식물이며 원산지는 동남아시아 열대지방이다.
제안 방법
- 1. 刀豆, 牛蒡根 복합물의 HPLC 지표성분 분석에서 刀豆 유래 Chlorogenic acid와 牛蒡根 유래 Chicoric acid를 동시분석조건으로 설정하였다.
- Effects of CG or AL and its complexes on Serotonin and Cortisol level in serum in C57BL/6J mice after 21 days of chronic immobilization-stress. C57BL/6J mouse were randomly divided into 9 groups of control, receiving normal saline, receiving CG or AL and its complexes, chronically immobilized(2 h/day immobilization for 21 days). C57BL/6J non-treated group; or(IM_S-CTL) induced with chronic immobilization-stress vehicle group; or the 70%(v/v) ethanol extract of C.
- Chlorogenic acid과 Chicoric acid 표준품들은 ㈜케이오씨바 이오텍(전민동, 한국)으로부터 구입하여 사용하였다. HPLC 분석은 Waters 2695 및 996 photodiode array detector에 의하여 수행하였다. 刀豆 추출물(CG)과 牛蒡根 추출물(AL) 복합물(CG+AL)은 20 ㎎/㎖로 70% 에탄올에 용해한 후, PVDF syringe filter를 사용하여 여과한 후 분석에 사용하였다.
- 2). HPLC-PDA를 이용하여 刀豆 유래 Chlorogenic acid와 牛蒡根 유래 Chicoric acid에 대한 동시 분석조건을 설정하여 함량을 분석하였다. 검량선의 상관관계 (r2 )는 0.
- Mice spleen were removed and IL-1β , IL-6, and TNF-α mRNA gene expression analysed quantitative real-time PCR at the end of the experiment.
- Mice spleen were removed and IL-2, IL-10, IFN-γ and IL-12p35/40 mRNA gene expression analysed quantitative real-time PCR at the end of the experiment.
- Total RNA(3-5㎍)를 70℃에서 10분간 열처리하여 변성 시킨 후. Reverse transcriptase(MMLV; GI BCO, BRL)와 dNPT, olimer d(T)를 이용하여 제조회사가 제공하는 완충용 액과 방법에 따라 37℃에서 60분간 반응하여 cDNA를 제작 하였다. 합성된 cDNA(0.
- 刀豆 원물 100kg(비중 0.625)을 Knife hammer mill 분쇄기(20mm 타공판 장착)를 이용하여 10mm 이하로 조분쇄 (비중 0.55)하였다. 원물 대비 3배의 상수를 첨가하여 24시간 동안 팽윤, 연화시킨 후 colloid mill로 2회 순환하며 미분쇄하여 콩물을 제조하였다.
- HPLC 분석은 Waters 2695 및 996 photodiode array detector에 의하여 수행하였다. 刀豆 추출물(CG)과 牛蒡根 추출물(AL) 복합물(CG+AL)은 20 ㎎/㎖로 70% 에탄올에 용해한 후, PVDF syringe filter를 사용하여 여과한 후 분석에 사용하였다.Optima pak C18 column(5 ㎛, 4.
- 刀豆, 牛蒡根 복합물(CG+AL) 중 지표성분 Chlorogenic acid과 Chicoric acid의 함량분석을 위해 이들 표준품은 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 제조하고, CG+AL복합물의 농도는 20 ㎎/㎖로 하여 HPLC 분석을 시행한 후 표준품의 양과 peak area사이의 상관관계를 도출하여 검량선을 작성 하여 계산하였다(Table. 2). HPLC-PDA를 이용하여 刀豆 유래 Chlorogenic acid와 牛蒡根 유래 Chicoric acid에 대한 동시 분석조건을 설정하여 함량을 분석하였다.
- 刀豆와 牛蒡根, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물을 경구투여한 마우스에서 주요 면역기관인 spleen, LN, MLN을 추출하여 세포를 분리한 뒤 CD4(CD4 T cell marker), CD8(CD8 T cell marker), NK1.1 (NK cell marker), CD11b(macrophage marker), CD11c(dendritic cell marker) 항체로 형광 염색 하여 flow cytometry로 분석하였다. 그 결과 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물을 투여한 마우스 군에서 CD4, CD8 T cell, macrophage, dendritic cell의 수와 활성이 가장 증가 되어있는 것을 확인 하였다(Table.
- 牛蒡根 건조 원물 100kg을 순환추출기에 주정과 함께 투입하여(최종 70.5%EtOH) 19~38℃에서 24시간 동안 1차 추출한 후 23~39℃에서 24시간 동안 2차 추출하였다. 추출 여액을 분리하여 75㎛, 1㎛ cartridge 필터로 여과하였다.
- 면역형광조직염색은 슬라이드에 부착시킨 뇌 조직을 immuno-fluorescence staining kit(IF, Thermo Fisher Scientific, USA)방법에 따라 BDNF (H-117, Santa Cruz, Heidelberg, Germany)를 반응시키고 cover glass로 덮어서 고정시켰다. 대조염색으로 핵을 염색할 수 있는 DAPI로 반응시켰다. 형광 BDNF 항체로 염색된 각 단백질을 형광 현미경으로 사진 촬영을 하여 이미지화 하였다.
- 분리한 면역기관(DLN, MLN, Spleen, thymus)의 세포에서 T cell, B cell, NK cell, macrophage 등 세포의 활성 및 수 변화를 확인하기 위해 각각의 마커가 되는 세포표면 분자(CD4+, CD8+, CD69+, NK1.1+)들에 대한 항체(BD PharMingen, CA)를 반응시킨 후 유세포 형광분석기(FACS)와 Cell Quest software(BD Biosciences, CA)를 통해 면역세포의 활성을 확인하였다.
- 수득한 마우스의 혈청을 micro-96well에 코팅한 후 IgA 항체(R&D system Inc, USA)와 HRP congugated 항체 (R&D system Inc, USA)를 반응시켜 ELISA reader(Emax, Molecular Devices) 기기로 측정하였다.
- 실험 종료 후 실험동물은 Ethyl ehter으로 마취시킨 후 50 I.U heparin(APU8AF, 중외제약) 20㎕을 처리한 3 ㎖ 주사기(BD Emerald TM , USA)를 이용하여 심장 천자법으로 채혈 하여 800 ~ 1000 ㎕ 혈액을 획득하고, 면역기관 세포(Thymus, Spleen, LN, MLN)들을 분리하였다.
- 실험동물은 8주령 C57BL/6J 수컷 마우스에 확립된 조건으로 그룹별로 3마리씩 각각 관리하에 정상군 3마리, 대조군 3마리, 刀豆 70% 주정 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군 3마리, 刀豆 70% 주정 추출물 50 ㎎/㎏ 투여군 3마리, 牛蒡根 70% 주정 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군 3마리, 牛蒡根 70% 주정 추출물 50 ㎎/㎏ 투여군 3마리, 刀豆 70% 주정 추출물과 牛蒡根 70% 주정 추출물을 1:4 비율로 혼합한 복합물(100 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏) 3군 각각 3마리, 총 9군 27마리로 설정 하였다. 매일 경구 투여 후 2시간 뒤에 부동화 튜브에 넣어 2시간 동안 고정하여 매일 2시간씩 21일간 부동화 스트레스를 유발한다.
- 약물희석은 0.5% CMC(Carboxymethyl Cellulose, Sigma Aldrich, USA)로 혼탁하여 투여하고, 대조군은 0.5% CMC 용액을 동량 투여하였다. 약물투여는 경구 투여용 금속제 존대(zonde)를 이용하여 위 내로 강제 경구 투여한다.
- 55)하였다. 원물 대비 3배의 상수를 첨가하여 24시간 동안 팽윤, 연화시킨 후 colloid mill로 2회 순환하며 미분쇄하여 콩물을 제조하였다. 2㎥ 교반조에 미분쇄 刀豆와 주정을 투입하여(최종 70.
- 6 ㎜ x 250 ㎜)을 사용하여 수행되었으며, 칼럼 온도는 40℃로 유지하였고, 검출은 PDA detector를 사용하였다. 이동상은 acetonitrile(A) 및 0.1% TFA 함유 water(B)를 이용한 gradient system으로 table 1과 같이 최적화하였고, 유속은 1.0 ㎖/min, 주입량은 20 ㎕로 하였다.
- 4%EtOH) 액온 27~30℃에 47시간 동안 교반 추출하였다. 잔사를 분리하기 위해 교반 추출액을 3,800rpm 연속 원심분리기(데칸터)로 1차 원심분리 한 후, 1차 분리액을 7,800rpm 연속원심분리기(알파라발)로 직렬 원심 분리하였다. 2차 분리액을 1㎛ cartridge 필터로 여과하였다.
- 합성된 cDNA(0.1-0.2 volume)에 면역, 염증 관련 유전자의 primer와 2.5mM dNTP, Taq polymerase(0.3U/ ㎕), 10× 완충용액을 첨가하여 Applied Biosystems 7500Real-time PCR system(Applied Biosystems, USA)를 이용해 Real time quantitative PCR을 수행하였다.
- 대조염색으로 핵을 염색할 수 있는 DAPI로 반응시켰다. 형광 BDNF 항체로 염색된 각 단백질을 형광 현미경으로 사진 촬영을 하여 이미지화 하였다.이를 분석 프로그램을 통해 임의대로 3개 이상의 Hippocampus 구역의 형광감도를 Image J Disclaimer 프로그램(https:// imagej.
대상 데이터
- Baker(USA)와 ㈜대정화금에서 구입하였다.Chlorogenic acid과 Chicoric acid 표준품들은 ㈜케이오씨바 이오텍(전민동, 한국)으로부터 구입하여 사용하였다. HPLC 분석은 Waters 2695 및 996 photodiode array detector에 의하여 수행하였다.
- HPLC 분석을 위한 acetonitrile과 water는 HPLC용 특급 용매로, trifluoroacetic acid(TFA)는 분석용 등급의 용매로 각각 J.T. Baker(USA)와 ㈜대정화금에서 구입하였다.Chlorogenic acid과 Chicoric acid 표준품들은 ㈜케이오씨바 이오텍(전민동, 한국)으로부터 구입하여 사용하였다.
- 刀豆는 ㈜콩세상(충북 제천, 한국)에서 구입하여 사용하였으며, 牛蒡根은 갑당약초(충북 제천, 한국)에서 구입하여 사용하였다.
- 부동화 스트레스 유발 마우스 모델의 혈액을 수득하여 백혈구(WBC)의 수를 서울의과학연구소(Seoul medical science institute, Korea)에 의뢰하여 측정하였다.
- 수컷 C57BL/6J 쥐 8주령(20-22 g, 8 weeks, Daehan bio, Chungcheongbuk-do, Korea)를 실험 기간 동안 평균 온도 23±2℃, 습도 50±2%로 유지하였으며, 밤낮 주기(12시간 light/12시간 dark, light turn on 9am)가 조절되는 환경에 수용하였다.
데이터처리
- 각 실험군 결과 값은 Microsoft Office Excel Student's t-test를 사용하여 통계 처리하였으며, p < 0.05 이하의 수준에서 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 모든 측정 결과는 독립적인 실험에서 도출된 대표 값의 평균 (mean)과 표준편차(standard deviation; SD)로 나타내었다.각 실험군 결과 값은 Microsoft Office Excel Student's t-test를 사용하여 통계 처리하였으며, p < 0.
- 형광 BDNF 항체로 염색된 각 단백질을 형광 현미경으로 사진 촬영을 하여 이미지화 하였다.이를 분석 프로그램을 통해 임의대로 3개 이상의 Hippocampus 구역의 형광감도를 Image J Disclaimer 프로그램(https:// imagej.nih.gov/ij/index.html)으로 측정하여 통계처리 하였다.
이론/모형
- gladiata(IM_S-CG70%E 100 mg/kg and 50 ㎎/㎏), or the 70% (v/v) ethanol extract of Arctium lappa(IM_S-AL70%E 100 mg/kg and 50 ㎎/㎏), or the CG70%E plus AL70%E(1:4 ratio)(IM_S-CG+AL (1:4) 100 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, and 25 ㎎/㎏). Blood samples were collected using cardiac puncture method and IgA levels were measured by ELISA method. Data are the means±SD of four sections; *p < 0.
- gladiata(IM_S-CG70%E 100 ㎎/㎏ and 50 ㎎/㎏), or the 70%(v/v) ethanol extract of Arctium lappa(IM_S-AL70%E 100 mg/kg and 50 ㎎/㎏), or the CG70%E plus AL70%E(1:4 ratio) (IM_S-CG+AL(1:4) 100 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, and 25 ㎎/㎏). Blood samples were collected using cardiac puncture method and(A) serotonin or(B) cortisol levels were measured by ELISA method. Data are the means±SD of four sections; *p < 0.
- 채혈 후 30분 이내에 3,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하여 -20 ℃ 에 보관하였다가 분석하였다. 마우스의 분리한 혈청에서 스트레스 호르몬인 Cortisol, Serotonin 수준을 enzyme-linked immunosorbent assay로 측정하였다. 각각 항체(antibody)를 coating 완충용액(Bio vision, USA)에 희석하여 micro-96well에 coating한 후 4℃에서 overnight하였다.
- 마우스의 분리한 뇌 조직을 5% Paraformaldehyde에 담가 고정시키고, 고정된 뇌 조직을 OCT 용액에 넣어 냉동하여 조직을 고정 후 Microtome으로 얇게 박절하여 Slide glass 에부착 시킨 후 실온에서 건조시켰다. 면역형광조직염색은 슬라이드에 부착시킨 뇌 조직을 immuno-fluorescence staining kit(IF, Thermo Fisher Scientific, USA)방법에 따라 BDNF (H-117, Santa Cruz, Heidelberg, Germany)를 반응시키고 cover glass로 덮어서 고정시켰다. 대조염색으로 핵을 염색할 수 있는 DAPI로 반응시켰다.
성능/효과
- 2. 21일간 부동화로 스트레스를 유발한 마우스 모델에서 刀豆와 牛蒡根 투여군중 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 스트레스에 의한 체중감소가 억제되 었으며, 스트레스 지표물질인 혈청 중 cortisol농도가 통계학적으로 유의성 있게 억제되었고(p<0.01), 혈청중 serotonin(p<0.01)농도는 현저하게 증가되었으며.
- 3. 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군이 刀豆와 牛蒡根을 각각 투여했을 때 보다 뇌의 기억력증진과 스트레스 호르몬을 억제하는 것으로 알려진 BDNF 발현이 현저하게 증가되었다.
- 4. 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군이 刀豆와 牛蒡根을 각각 투여했을 때에 비하여 혈청 중 IgA (p<0.01)수치와 혈액 중 WBC 수(p<0.01)가 통계학적 으로 유의성 있게 증가하였다.
- 5. 부동화 스트레스유발 마우스 모델에서 분리한 면역기관 (DLN, MLN, Spleen, Thymus)에서 유세포형광 염색 분석에서 공통적으로 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군이 대조군에 비하여 CD4+ , CD8+ , CD4+ /CD69+ , CD8+ /CD69+ , NK1.1+ /CD69+ 등 세포 수 및 활성세포 들이 증가를 나타내었고, 특히, NK세포의 활성이 증가되었다. 비장세포에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 대조군에 비해 염증싸이토카인인 IL-1β (p<0.
- 3). DLN에서 B세포 활성은 정상 군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 B세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk) 에서 B세포 활성이 가장 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table. 4).
- 3). DLN에서 활성화된 CD8 + /CD69 +는 정상군에 비해 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서는 모두 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 활성화된 CD8 + /CD69 +가 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk)에서 가장 활성화된 CD8 + /CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다 (Table. 4). DLN에서 활성화된 NK1.
- 4). DLN에서 활성화된 NK1.1 + /CD69 + 는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서는 모두 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 활성화된 NK1.1 + /CD69 + 가 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_ 100mpk)에서 가장 활성화된 NK1.1 + /CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table. 3). DLN에서 B세포 활성은 정상 군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 B세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk) 에서 B세포 활성이 가장 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table.
- DLN에서는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 CD4(CD4 T cell marker) CD8(CD8 T cell marker)이 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출 물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서는 모두 부동화 대조 군(IM_S-CTL)에 비해 CD4, CD8이 증가되는 것을 확인할할 수 있었다(Table. 3). 또한 DLN에서는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 활성화된 CD4 + /CD69 + 가 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서는 모두 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에 비해 활성화된 CD4 + /CD69 + 가 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk)에서 가장 활성화된 CD4 +/CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table.
- Fig.2-A는 혈청 중 Cortisol 수준을 측정한 결과로, 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏투여군(IM_S-CG70%E_100mpk, p<0.05) 그리고 牛蒡根 추출물 50 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-AL70% E_100mpk, p<0.05)과 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk, p<0.01)에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 Cortisol 수준이 감소를 나타났다(Fig. 2).
- Fig.2-B는 혈청 중 Serotonin 수준을 측정한 결과로, 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG70%E_100mpk, p<0.05), 牛蒡根 추출물 50 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-AL70%E_100mpk, p<0.05)과 刀 豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL (1:4)_100mpk, p<0.01)과 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 50 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_50mpk, p<0.01)에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 Serotonin 수준이 증가를 나타났다(Fig. 2).
- Fig.4은 혈청 중 IgA 수준을 측정한 결과로, 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG70%E_100 ㎎/㎏, p<0.05) 그리고 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+ AL(1:4)_100mpk, p<0.01), 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 50 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_50mpk, p<0.05)에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 IgA가 증가함을 나타내었다(Fig. 4).
- Fig.5는 혈액 중 WBC 수를 측정한 결과로, 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에 비하여 모든 실험군에서 WBC 수의 증가가 유의성 있게 나타났고, 특히, 牛蒡根 추출물 100 mg/kg 투여군(IM_S-AL70%E_100mpk, p<0.001) 그리고 刀豆, 牛 蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_ 100mpk, p<0.01), 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 50 ㎎/㎏ 투여 군(IM_S-CG+AL(1:4)_50mpk, p<0.05)이 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 WBC 수가 증가를 나타났다(Fig. 5).
- 5). MLN에서 CD4 + /CD69 +Th세포 활성은 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 100 ㎎/㎏(IM_S-CG70% E_100mpk), 牛蒡根 100 ㎎/㎏(IM_S-AL70%E_100mpk), 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 25 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL (1:4)_25mpk)을 제외한 나머지 투여군에서는 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에 비해 CD4 + /CD69 + Th세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4) _100mpk)에서 가장 활성화된 CD4 + /CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다 (Table.
- 5). MLN에서 CD8 + /CD69 + Th세포 활성은 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할수 있었고, 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏(IM_S-CG_100mpk)를 제외한 나머지 투여군에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD8+/CD69+ Th세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여 군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk)에서 가장 활성화된 CD8 + / CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table.
- 5). MLN에서 NK1.1 + /CD69 + 세포 활성은 정상군에 비해 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에서 차이가 없었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서도 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 NK1.1 + /CD69 + Th 세포 활성에서 큰 차이를볼 수 없었다(Table. 5).
- MLN에서는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 CD4 T세포 활성이 감소하며 CD8 T세포 활성이 증가 되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk)에서는 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에 비해 CD4 T세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Table. 5). MLN에서 CD4 + /CD69 +Th세포 활성은 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 100 ㎎/㎏(IM_S-CG70% E_100mpk), 牛蒡根 100 ㎎/㎏(IM_S-AL70%E_100mpk), 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 25 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL (1:4)_25mpk)을 제외한 나머지 투여군에서는 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에 비해 CD4 + /CD69 + Th세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
- 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG70% E_100 ㎎/㎏)이 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비하여 BDNF 발현이 통계학적으로 유의성 있게 증가하였고(p<0.05), 刀豆, 牛 蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4) _100mpk, p<0.01)과, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 50 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_50mpk, p<0.05)에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비하여 BDNF 발현이 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였다(Fig. 3).
- 1 (NK cell marker), CD11b(macrophage marker), CD11c(dendritic cell marker) 항체로 형광 염색 하여 flow cytometry로 분석하였다. 그 결과 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물을 투여한 마우스 군에서 CD4, CD8 T cell, macrophage, dendritic cell의 수와 활성이 가장 증가 되어있는 것을 확인 하였다(Table. 4~7).
- 刀豆와 牛 蒡根의 면역 조절에 관한 선행 연구결과는 확인할 수 없었지 만, 이번 실험을 통해 부동화 스트레스 마우스모델에 刀豆 및 牛蒡根 추출물을 경구투여한 후 변화하는 면역 관련 지표들을 확인해 보았다. 그 결과, 刀豆 추출물을 단독으로 경구투여한 마우스 그룹보다 刀豆와 牛蒡根 1:4 복합물을 투여한 마우스 그룹에서 T/B cell 및 macrophage, NK cell 등 면역세포의 수와 활성 및 IgA 생성량이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다.따라서 刀豆 추출물 단독투여보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여에 의해 면역증진 효과가 다소 증진되는 것을 확인하였다.
- 비장 에서 CD8 + /CD69 + T 활성 세포 수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 모든 투여군에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD8 + /CD69 +T세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 CD8 + /CD69 + 활성 세포수가 가장 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table. 6). 비장에서 NK1.
- 즉, 刀豆 추출물 단독으로 경구투여한 마우스 그룹보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여 마우스 그룹에서 면역 활성이 증가 하는 것을 볼 수 있었다. 그러므로 위 결과들에 비추어 보았을 때 刀豆 추출물이나 牛蒡根 추출물을 단독으로 투여 하였을 때보다는 刀豆, 牛蒡根 복합물을 투여 하였을 때 면역증진효과가 클 것으로 사료된다. 따라서 질병의 치료보다는 예방 개념으로 건강 기능성 식품을 제작할 때, 刀豆와 牛蒡根의 복합물이 건강 기능성 식품 개발에 좋은 원료가될 것이라고 사료된다.
- MLN에서 CD8 + /CD69 + Th세포 활성은 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할수 있었고, 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏(IM_S-CG_100mpk)를 제외한 나머지 투여군에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD8+/CD69+ Th세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여 군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk)에서 가장 활성화된 CD8 + / CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table. 5). MLN에서 NK1.
- MLN에서 CD4 + /CD69 +Th세포 활성은 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 100 ㎎/㎏(IM_S-CG70% E_100mpk), 牛蒡根 100 ㎎/㎏(IM_S-AL70%E_100mpk), 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 25 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL (1:4)_25mpk)을 제외한 나머지 투여군에서는 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에 비해 CD4 + /CD69 + Th세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4) _100mpk)에서 가장 활성화된 CD4 + /CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다 (Table. 5). MLN에서 CD8 + /CD69 + Th세포 활성은 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할수 있었고, 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏(IM_S-CG_100mpk)를 제외한 나머지 투여군에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD8+/CD69+ Th세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수있었다.
- 비장(spleen)에서는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_SCTL)에서 CD4 + & CD8 + T 활성 세포 수가 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 모든 투여군에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD4 + & CD8 + T세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk)에서 CD8+가 가장 증가된 것을 확인할 수 있었다(Table. 6). 비장에서 CD4 + /CD69 +T 활성 세포 수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL) 에서 차이를 볼 수 없었지만, 牛蒡根 추출물 100 mg/kg와 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 25 ㎎/㎏ 투여군을 제외한 나머지 투여군에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD4 + /CD69 +T세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Table.
- 비장에서 CD11b + / CD69 + 활성 세포수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_SCTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 나머지 투여군에 서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 농도 의존적으로 CD11b + /CD69 + 세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할수 있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 CD11b + /CD69 + 활성 세포 수가 가장 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table 6).
- 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 CD4 + & CD8 + 세포 수가 가장 증가 된것을 확인할 수 있었다(Table. 7).
- 1 + /CD69 + NK세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 NK1.1과 NK1.1 + /CD69 + NK활성 세포수가 가장 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table. 6). 비장에서 CD11b + / CD69 + 활성 세포수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_SCTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 나머지 투여군에 서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 농도 의존적으로 CD11b + /CD69 + 세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할수 있었다.
- 刀豆 및 牛蒡根 70%에탄올 추출물의 대량생산시스템 구축을 위해 (주)테코스에 의뢰하였으며, 각 원료에 제조보고서를 받았다. 대량생산한 원료의 성상, 영양 성분, 유해물질 여부를 확인하기 위해 건강기능식품연구원에 의뢰하여 최종 물질의 유해성이 없음을 확인하였다.
- 반면 serotonin의 생성량은 부동화 스트레스를 유도한 마우스모델에서 감소하였으며, 刀豆 추출물 단독투여보다는 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물을 투여하였을 때 serotonin의 생성량이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 刀豆 추출물 단독투여보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여에 의한 스트레스 완화 효과를 확인할 수 있었다. 刀豆와 牛 蒡根의 면역 조절에 관한 선행 연구결과는 확인할 수 없었지 만, 이번 실험을 통해 부동화 스트레스 마우스모델에 刀豆 및 牛蒡根 추출물을 경구투여한 후 변화하는 면역 관련 지표들을 확인해 보았다.
- 그 결과, 刀豆 추출물을 단독으로 경구투여한 마우스 그룹보다 刀豆와 牛蒡根 1:4 복합물을 투여한 마우스 그룹에서 T/B cell 및 macrophage, NK cell 등 면역세포의 수와 활성 및 IgA 생성량이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다.따라서 刀豆 추출물 단독투여보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여에 의해 면역증진 효과가 다소 증진되는 것을 확인하였다. 또한 뇌 조직 면역형광염색 결과에서도 刀豆와 牛蒡根을 각각 투여했을 때 보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서 뇌의 기억력증진과 스트레스 호르몬을 억제하는 것으로 알려진 BDNF 발현이 현저하게 증가된 것으로 보아 刀豆와 牛蒡 根의 복합물에 의한 상승효과를 알 수 있었다.
- 이러한 결과로 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물은 스트레스 관련 호르몬 억제, 스트레스 억제 관련 인자 개선, 뇌의 기억력증 진과 스트레스 호르몬억제 BDNF활성, 면역세포 수 증진, 염증면역 싸이토카인 억제, 면역 활성 싸이토카인 증진 및 NK 세포활성 증진 등을 통하여 탁월한 면역증진 효능을 나타내었다.따라서 식물 유래 추출물인 刀豆와 牛蒡根 추출물의 스트레스 매개 면역조절능력을 평가하였으며, 刀豆, 牛蒡根 추출물을 혼합하였을 때 나타나는 스트레스 매개 면역조절의 상승효과를 확인할 수 있었다.
- 3). 또한 DLN에서는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 활성화된 CD4 + /CD69 + 가 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서는 모두 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에 비해 활성화된 CD4 + /CD69 + 가 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk)에서 가장 활성화된 CD4 +/CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table. 3). DLN에서 활성화된 CD8 + /CD69 +는 정상군에 비해 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆 추출물, 牛蒡根 추출물, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서는 모두 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 활성화된 CD8 + /CD69 +가 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk)에서 가장 활성화된 CD8 + /CD69 + 가 증가 된 것을 확인할 수 있었다 (Table.
- 또한 NK세포 활성인자 및 면역 T세포 활성인자인 IL-2, IL-10, IFN-γ , IL-12p35/p40 mRNA유전자 발현이 현저하게 증가되었다.
- 또한 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+ AL(1:4)_100mpk)에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 면역 T세포 활성 싸이토카인(IL-2, IL-10, IFN-γ , IL-12p35/p40) mRNA 유전자 발현이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7).
- 특히, 刀豆 추출물 단독 투여군 보다는 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100mpk 투여군에서 염증싸이토카인(IL-1beta, IL-6, TNF-α ) mRNA 유전자 발현이 현저하게 감소시키는 것으로 보아 刀豆, 牛蒡 根 1:4 복합물 투여군에서 염증반응이 가장 낮은 것을 관찰하였다. 또한 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 면역 T세포 활성 싸이토카인(IL-2, IL-10, IFN-gamma, IL-12p35/p40) mRNA 유전자 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 刀豆 추출물 단독으로 경구투여한 마우스 그룹보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여 마우스 그룹에서 면역 활성이 증가 하는 것을 볼 수 있었다.
- 따라서 刀豆 추출물 단독투여보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여에 의해 면역증진 효과가 다소 증진되는 것을 확인하였다. 또한 뇌 조직 면역형광염색 결과에서도 刀豆와 牛蒡根을 각각 투여했을 때 보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여군에서 뇌의 기억력증진과 스트레스 호르몬을 억제하는 것으로 알려진 BDNF 발현이 현저하게 증가된 것으로 보아 刀豆와 牛蒡 根의 복합물에 의한 상승효과를 알 수 있었다. 그리고 최근 Jeon YJ의 연구에서는 세포주에서 刀豆를 포함한 식품에서 IL-1beta와 TNF-α 생성량을 감소시킨다고 보고했는데23) , 본 연구에서도 刀豆 추출물이 염증성 싸이토카인인 IL-1beta, IL-6, TNF-α를 감소시키는 것으로 보아 刀豆 추출물이 염증반응을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
- 마우스 뇌 조직 Hippocampus 부위에서 면역형광염색법으로 뇌의 기억력증진과 스트레스 호르몬을 억제하는 것으로 알려진 BDNF 발현을 확인해본 결과, 정상군에 비하여 스트레스 부동화 대조군(IM_S-CTL)의 BDNF 발현이 현저하게 감소하였다. 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG70% E_100 ㎎/㎏)이 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비하여 BDNF 발현이 통계학적으로 유의성 있게 증가하였고(p<0.
- 41 ㎎/g body weigh로 다소 높았으나 통계 적인 유의차는 없었다. 모든 실험군에서 비장의 무게는 정상 군과 부동화 대조군에 비하여 낮은 수치를 나타내었으나 통계적인 유의차는 없었다. 흉선의 무게는 정상군이 2.
- IL-6의 발현은 후보 물질 투여군 중 牛蒡根 추출물 100 mg/kg 투여군(IM_S-AL70%E_100mpk)과 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 50 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4) _50mpk)을 제외한 나머지 그룹에서 감소하였지만 통계적 유의성은 볼 수 없었다. 반면 TNF-a의 발현은 후보 물질 투여군중 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG_100mpk)와 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4) _100mpk)에서 통계학적으로 유의성 있게 정상그룹 수준 정도로 회복되는 것을 확인하였다(Fig. 6).
- 최근 Anna Jung 등에 의해 부동화 스트레스를 유도한 동물모델에서 혈장 내 Cortisol 수치가 높으며, 스트레스 완화 모델에서는 Cortisol 수치가 감소한다고 보고하였는데22) , 본 연구에서도 부동화 스트레스를 유도한 마우스모델에서 혈장 내 Cortisol 수치가 증가하였으며 刀豆 추출물 단독투여보다는 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물을 투여하였을 때 Cortisol 수치는 더욱 감소됨을 확인할 수 있었다. 반면 serotonin의 생성량은 부동화 스트레스를 유도한 마우스모델에서 감소하였으며, 刀豆 추출물 단독투여보다는 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물을 투여하였을 때 serotonin의 생성량이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 刀豆 추출물 단독투여보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여에 의한 스트레스 완화 효과를 확인할 수 있었다.
- 1).분석결과 Chlorogenic acid과 Chicoric acid의 피크는 각각 12.385와 26.083 min에서 나타났으며 함량은 각각 15.252와 6.06 ㎎/g으로 나타났다.
- 6). 비장 에서 CD8 + /CD69 + T 활성 세포 수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 모든 투여군에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD8 + /CD69 +T세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 CD8 + /CD69 + 활성 세포수가 가장 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table.
- 비장(spleen)에서는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_SCTL)에서 CD4 + & CD8 + T 활성 세포 수가 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 모든 투여군에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD4 + & CD8 + T세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
- 비장세포에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 대조군에 비해 염증싸이토카인인 IL-1β (p<0.001), IL-6, TNF-α(p<0.05) mRNA 유전자 발현이 유의성 있게 억제되었으며.
- 6). 비장에서 CD11b + / CD69 + 활성 세포수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_SCTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 나머지 투여군에 서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 농도 의존적으로 CD11b + /CD69 + 세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할수 있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 CD11b + /CD69 + 활성 세포 수가 가장 증가 된 것을 확인할 수 있었다(Table 6).
- 6). 비장에서 CD4 + /CD69 +T 활성 세포 수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL) 에서 차이를 볼 수 없었지만, 牛蒡根 추출물 100 mg/kg와 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 25 ㎎/㎏ 투여군을 제외한 나머지 투여군에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD4 + /CD69 +T세포 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Table. 6). 비장 에서 CD8 + /CD69 + T 활성 세포 수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 모든 투여군에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 CD8 + /CD69 +T세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
- 6). 비장에서 NK1.1과 NK1.1 + /CD69 + NK 활성 세포 수는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 나머지 투여군에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 농도 의존적으로 NK1.1과 NK1.1 + /CD69 + NK세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그중에서 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 NK1.
- 비장에서는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_S-CTL)에서 염증 싸이토카인(IL-1beta, IL-6, TNF-α ) mRNA 유전자 발현이 증가를 확인할 수 있었고, IL-1beta의 발현은 후보 물질 투여군 중 刀豆 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG_ 100mpk)과 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏와 25 ㎎/㎏ 투여군(IM_S-CG+AL(1:4)_100mpk and 25mpk)에서 통계학적으로 유의성 있게 정상그룹 수준 정도로 회복되는 것을 확인하였다.
- 비장에서는 정상군에 비해 부동화를 시킨 부동화 대조군 (IM_S-CTL)에서 면역 T세포 활성 싸이토카인(IL-2, IFNγ , IL-12p35/p40) mRNA 유전자 발현이 감소를 확인할 수있었고, 후보 물질 투여군중에서는 부동화 대조군(IM_S-CTL) 비하여 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여 농도 의존적으로 면역 T 세포 활성 싸이토카인(IL-2, IL-10, IFN-γ , IL-12p35/p40) mRNA 유전자 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 이러한 결과로 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물은 스트레스 관련 호르몬 억제, 스트레스 억제 관련 인자 개선, 뇌의 기억력증 진과 스트레스 호르몬억제 BDNF활성, 면역세포 수 증진, 염증면역 싸이토카인 억제, 면역 활성 싸이토카인 증진 및 NK 세포활성 증진 등을 통하여 탁월한 면역증진 효능을 나타내었다.따라서 식물 유래 추출물인 刀豆와 牛蒡根 추출물의 스트레스 매개 면역조절능력을 평가하였으며, 刀豆, 牛蒡根 추출물을 혼합하였을 때 나타나는 스트레스 매개 면역조절의 상승효과를 확인할 수 있었다.
- 동결 건조를 위해 -40℃에서 10시간 동안 동결시킨 후 16시간 동안 승화 건조시키고 40℃에서 3일동안 건조시켰다. 이후 미생물 시험 (건조 필름법)을 통해 대장균군은 음성반응, 일반세균은 260cfu/g임을 확인하였다. 刀豆 및 牛蒡根 70%에탄올 추출물의 대량생산시스템 구축을 위해 (주)테코스에 의뢰하였으며, 각 원료에 제조보고서를 받았다.
- 동결 건조를 위해 -40℃에서 12시간 동안 동결시킨 후 16시간 동안 승화 건조시키고 40℃에서 3일 동안 건조시켰다. 이후 미생물 시험(건조 필름법)을 통해 대장균군은 음성반응, 일반세균은 450cfu/g임을 확인하였다.
- 또한 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 면역 T세포 활성 싸이토카인(IL-2, IL-10, IFN-gamma, IL-12p35/p40) mRNA 유전자 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 刀豆 추출물 단독으로 경구투여한 마우스 그룹보다 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 투여 마우스 그룹에서 면역 활성이 증가 하는 것을 볼 수 있었다. 그러므로 위 결과들에 비추어 보았을 때 刀豆 추출물이나 牛蒡根 추출물을 단독으로 투여 하였을 때보다는 刀豆, 牛蒡根 복합물을 투여 하였을 때 면역증진효과가 클 것으로 사료된다.
- 특히, 刀豆 추출물 단독 투여군 보다는 刀豆, 牛蒡根 1:4 복합물 100mpk 투여군에서 염증싸이토카인(IL-1beta, IL-6, TNF-α ) mRNA 유전자 발현이 현저하게 감소시키는 것으로 보아 刀豆, 牛蒡 根 1:4 복합물 투여군에서 염증반응이 가장 낮은 것을 관찰하였다.
- 흉선(thymus)에서는 정상군에 비해 부동화 대조군(IM_SCTL)에서 CD4 + & CD8 + 세포 수가 감소되는 것을 확인할 수있었고, 나머지 투여군에서 부동화 대조군(IM_S-CTL)에 비해 농도 의존적으로 CD4 + & CD8 + 세포 활성이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 그러므로 위 결과들에 비추어 보았을 때 刀豆 추출물이나 牛蒡根 추출물을 단독으로 투여 하였을 때보다는 刀豆, 牛蒡根 복합물을 투여 하였을 때 면역증진효과가 클 것으로 사료된다. 따라서 질병의 치료보다는 예방 개념으로 건강 기능성 식품을 제작할 때, 刀豆와 牛蒡根의 복합물이 건강 기능성 식품 개발에 좋은 원료가될 것이라고 사료된다.
- 하지만 이러한 효능들을 발현하는 활성 성분에 관한 연구는 미흡한 실정이다. 천연물에는 규명되지 않은 다양한 성분이 존재하기 때문에, 활성 성분을 발견하고 그 성분의 효과를 증대시킬 수 있는 연구를 진행할 필요성이 있다. 또한 우엉(Arctium lappa)은 초롱꽃목 국화과의 두해살이식물이며 약용과 식용으로 재배되고 있는 야생초이다.
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