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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 양제근 추출물과 분획의 항산화 활성과 tyrosinase 저해활성 및 세포독성을 평가하여 현재까지 이용가치가 많지 않은 양제근을 기능성 화장품 신소재로서의 개발하기 위한 기초자료를 제공하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 80 - 200㎍/㎖의 농도로 MeOH에 용해시킨 시료액 20㎕와 200 μM로 MeOH에 용해시킨 DPPH 용액 180㎕를 혼합하여 20분간 암실에서 반응시킨 후 517㎚에서 흡광도를 측정하여 50%의 radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 계산하였다.
- 양제근을 마쇄한 후 70% ethanol (EtOH)을 이용하여 80℃에서 2시간씩 3회에 걸쳐 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과 후 농축 (BUCHI, Flawil, Switzerland) 및 동결건조 (Sam Won Industry, Seoul, Korea)를 실시하여 34.
- 이중 일부를 증류수에 분산시킨 후 n-hexane, chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)을 사용하여 용매분획을 실시하였다. 용매분획으로 획득한 시료는 여과하여 농축 및 동결건조 후 분말화하였다.
- ), ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)을 사용하여 용매분획을 실시하였다. 용매분획으로 획득한 시료는 여과하여 농축 및 동결건조 후 분말화하였다. 추출물과 분획은 4℃이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
- 양제근 70% EtOH 추출물 및 분획의 phenol성 화합물의 함량은 Folin-Denis법을 이용하여 측정하였다 (Folin and Denis, 1912). Methanol (MeOH)에 용해시킨 시료액과 Folin-Denis reagent를 1 : 1로 혼합하여 상온에서 3분간 반응시킨 뒤 동량의 10% Na2CO3를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 100㎕를 취하여 700㎚에서 흡광도를 측정하였다 (BIO-TEK, Winooski, VT, USA). 표준물질 (tannic acid)을 MeOH에 0 - 500㎍/㎖의 다양한 농도로 용해시켜 시료와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 표준 검량선을 작성하고 sample의 흡광도를 검량선의 회귀방정식에 대입하여 총 phenol성 화합물 함량을 ㎎/g로 나타내었다.
- Methanol (MeOH)에 용해시킨 시료액과 Folin-Denis reagent를 1 : 1로 혼합하여 상온에서 3분간 반응시킨 뒤 동량의 10% Na2CO3를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 100㎕를 취하여 700㎚에서 흡광도를 측정하였다 (BIO-TEK, Winooski, VT, USA). 표준물질 (tannic acid)을 MeOH에 0 - 500㎍/㎖의 다양한 농도로 용해시켜 시료와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 표준 검량선을 작성하고 sample의 흡광도를 검량선의 회귀방정식에 대입하여 총 phenol성 화합물 함량을 ㎎/g로 나타내었다.
- Radical 소거능은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 항산화 활성을 비교하였다 (Blois, 1958). 80 - 200㎍/㎖의 농도로 MeOH에 용해시킨 시료액 20㎕와 200 μM로 MeOH에 용해시킨 DPPH 용액 180㎕를 혼합하여 20분간 암실에서 반응시킨 후 517㎚에서 흡광도를 측정하여 50%의 radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 계산하였다.
- 96 well plate에 L929 세포를 1 × 104 cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건에서 부착 및 안정화를 시킨 후, 농도별 시료액을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. PBS에 5㎎/㎖ 수준으로 용해된 MTT 용액을 각 well에 10㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 생성된 formazan 결정을 용해시키기 위하여 100㎕의 DMSO를 첨가하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 well의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- PBS에 5㎎/㎖ 수준으로 용해된 MTT 용액을 각 well에 10㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 생성된 formazan 결정을 용해시키기 위하여 100㎕의 DMSO를 첨가하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 well의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
대상 데이터
- 세포독성시험에 사용된 동물세포주인 L929 cell은 한국생명 공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양 받은 것을 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, WelGENE Inc., Gyeongsan, Korea)에 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% penicillinstreptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 혼합한 배지를 이용하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 양제근은 2016년 삼홍건재약업사에서 구입하여 4℃ 이하로 냉장 보관하며 실험에 사용하였다. 표품 (DSUBIC-16-0002)은 동신대학교 바이오센터에 보관되어 있다.
- 양제근을 마쇄한 후 70% ethanol (EtOH)을 이용하여 80℃에서 2시간씩 3회에 걸쳐 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과 후 농축 (BUCHI, Flawil, Switzerland) 및 동결건조 (Sam Won Industry, Seoul, Korea)를 실시하여 34.64%의 수율로 추출물을 획득하였다.
- , Gyeongsan, Korea)에 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% penicillinstreptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 혼합한 배지를 이용하여 실험에 사용하였다. 그 외 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차 (means ± SD)로 표시하였고, windows용 SPSS (Statistical Pakage for Social Science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 각 실험군 간의 통계학적 분석을 수행하였다.
- 각 군 간의 측정치 비교는 One-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성은 신뢰구간 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
이론/모형
- 양제근 70% EtOH 추출물 및 분획의 phenol성 화합물의 함량은 Folin-Denis법을 이용하여 측정하였다 (Folin and Denis, 1912). Methanol (MeOH)에 용해시킨 시료액과 Folin-Denis reagent를 1 : 1로 혼합하여 상온에서 3분간 반응시킨 뒤 동량의 10% Na2CO3를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 100㎕를 취하여 700㎚에서 흡광도를 측정하였다 (BIO-TEK, Winooski, VT, USA).
- Tyrosinase 저해 활성은 tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법을 이용하였다 (Jung et al., 1995). 농도별 시료액 20㎕와 0.
- MTT assay를 이용하여 양제근 추출물 및 분획의 세포 생존율을 측정하여 독성의 정도를 확인하였다 (Shin et al., 2003). 96 well plate에 L929 세포를 1 × 104 cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건에서 부착 및 안정화를 시킨 후, 농도별 시료액을 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- 추출물과 분획은 4℃이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 분획수율은 aqueous 분획 (AF)이 58.13%로 가장 높은 분획수율을 보여주었으며, BuOH 분획 (BF) 25.33%, EtOAc 분획 (EF) 10.54%, hexane 분획 (HF) 3.56%, CHCl3 분획 (CF) 2.45% 순으로 나타났다.
- 값을 기준으로 비교한 relative activity를 나타내었다. EF과 BF의 SC50 값이 각각 5.97㎍/㎖, 20.74㎍/㎖로 추출물보다 높은 활성을 보여주었다. 특히 EF의 SC50 수치는 relative activity에 나타난 바와 같이 116.
- 양제근 추출물과 분획의 NO 소거능 측정에서 50%의 nitric oxide를 소거하는데 필요한 시료의 농도를 산출한 SC50 값을 Table 3에 나타내었다. 70% EtOH 추출물의 NO 소거능은 262.75㎍/㎖으로 나타났으며, 분획의 경우 AF를 제외한 모든 분획이 추출물보다 높은 활성을 보였다. DPPH radical 소거활성과 유사하게 EF의 경우 추출물의 약 5배, 다른 분획의 약 2 - 3배 이상의 높은 활성을 보여주었다.
- 따라서 피부 미백제의 개발에 있어서 tyrosinase 저해 활성 실험은 유용한 일차 평가법으로 인정되고 있다 (Pavel and Muskiet, 1983; Prota, 1993). 양제근 70% EtOH 추출물의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과, 1,000㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 78.05%의 활성을 보여주었다 (Fig. 1). 이러한 결과는 맥문동 종실 추출물의 tyrosinase 저해 활성의 경우 1,000㎍/㎖농도에서 66.
- 1). 이러한 결과는 맥문동 종실 추출물의 tyrosinase 저해 활성의 경우 1,000㎍/㎖농도에서 66.5%의 저해효과를 나타낸 보고 (Choung et al., 2013)와, 더덕 추출물의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 1㎎/㎖의 농도로 시료를 처리하였을 때 7.18%의 저해 효과를 나타낸다는 보고 (Kim et al., 2013b)와 비교하여 볼 때 양제근 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 우수한 활성임을 확인할 수 있었다. 분획의 경우 EF과 BF이 추출물보다 높은 활성을 보여주었으며, 특히 EF은 실험이 실시된 모든 농도에서 현재 화장품용 미백소재로 가장 널리 사용되는 arbutin보다 높은 활성을 보여주었다.
- , 2013b)와 비교하여 볼 때 양제근 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 우수한 활성임을 확인할 수 있었다. 분획의 경우 EF과 BF이 추출물보다 높은 활성을 보여주었으며, 특히 EF은 실험이 실시된 모든 농도에서 현재 화장품용 미백소재로 가장 널리 사용되는 arbutin보다 높은 활성을 보여주었다. 또한 항산화능과 tyrosinase 저해 활성이 높은 상관관계를 나타낸다는 Kim 등 (2012)의 연구와 일치하는 결과라고 할 수 있다.
- 양제근 추출물의 L929 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과 (Fig. 2), 추출물과 HF, BF 그리고 AF은 실험을 실시한 모든 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 보여줌으로써 독성을 나타낼 가능성이 매우 낮은 것으로 확인되었다. 하지만 CF과 EF를 고농도 (2㎎/㎖)로 처리하였을 때 각각 66.
- 2), 추출물과 HF, BF 그리고 AF은 실험을 실시한 모든 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 보여줌으로써 독성을 나타낼 가능성이 매우 낮은 것으로 확인되었다. 하지만 CF과 EF를 고농도 (2㎎/㎖)로 처리하였을 때 각각 66.67%, 66.83%의 비교적 낮은 세포 생존율을 나타냄으로써 세포의 성장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 추가적인 연구를 통해 구체적인 독성의 수준을 확인하여 적정 농도의 선정이 필요할 것으로 판단되었다.
- 양제근 70% EtOH 추출물과 분획의 기초적인 생리활성을 비교한 결과, 항산화 활성을 확인하기 위해 실시한 DPPH radical 소거능과 NO 소거활성 측정에서 EF이 가장 높은 활성을 보여주었으며, 특히 DPPH radical 소거능에서는 양성대조군인 ascorbic acid 보다 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 높은 polyphenol 함량에 기인한 것으로 판단되어진다.
- 하지만 CF과 EF을 고농도로 처리하였을 때, 세포의 성장을 저해하는 결과를 보여줌으로써 향후 연구를 진행할 때 안전성이 확보될 수 있는 적정농도의 선정이 필요할 것으로 판단되어진다. 이러한 결과를 바탕으로 양제근은 천연 기능성 화장품 개발을 위한 소재로써 활용 가치가 높은 것으로 생각되었다.
후속연구
- 83%의 비교적 낮은 세포 생존율을 나타냄으로써 세포의 성장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 추가적인 연구를 통해 구체적인 독성의 수준을 확인하여 적정 농도의 선정이 필요할 것으로 판단되었다.
- 피부 미백과 관련된 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과, EF이 실험이 실시된 모든 농도에서 현재 화장품용 미백소재로 널리 사용되는 arbutin보다 높은 활성을 보여줌으로써 유효성분의 분리·정제를 고도화함으로써 새로운 미백 활성성분의 개발 가능성을 시사하고 있다.
- 피부 미백과 관련된 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과, EF이 실험이 실시된 모든 농도에서 현재 화장품용 미백소재로 널리 사용되는 arbutin보다 높은 활성을 보여줌으로써 유효성분의 분리·정제를 고도화함으로써 새로운 미백 활성성분의 개발 가능성을 시사하고 있다. 하지만 CF과 EF을 고농도로 처리하였을 때, 세포의 성장을 저해하는 결과를 보여줌으로써 향후 연구를 진행할 때 안전성이 확보될 수 있는 적정농도의 선정이 필요할 것으로 판단되어진다. 이러한 결과를 바탕으로 양제근은 천연 기능성 화장품 개발을 위한 소재로써 활용 가치가 높은 것으로 생각되었다.
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