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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 식품학적 가치는 충분히 있으나 주로 관상용이나 한방치료에만 국한되는 뜰보리수 열매의 이용성을 증대시키기 위한 일환으로 뜰보리수 열매의 자연 식초 발효 중 이화학적 특성 및 효능평가와 더불어 발효기간에 따른 기능성 화합물들의 함량 변화와 연관성을 살펴보았다.
가설 설정
- 2)ND, not detected.
제안 방법
- Flavanol 분석은 TSKgel ODS-100Z column(4.6×250 mm,5 μm, Tosoh Corp. Tokyo, Japan)과 HPLC(Agilent 1200series, Agilent Co.)을 이용하여 분석되었다.
- Phenolic acid 분석은 XTerraTM RP C8 column(4.6×250mm, 5 μm, Waters Corp. Milford, MA, USA)과 HPLC(Agilent1200 series, Agilent Co.)을 이용하여 분석되었다.
- Pancreatic lipase는 중성지방을 분해하는 효소로 작용한다. 그러나 이 현상이 지속될 경우 체중 증가와 더불어 당뇨, 동맹경화,심혈관질환 등의 위험에 노출될 수 있으므로(32) 본 연구에서는 지방분해 효소 저해활성을 측정하였다. 한편, 탄수화물 분해효소 저해활성에 관여하는 물질은 polyphenol성 화합물 중 flavonols 화합물로 알려져 있으며(33) 지방 분해효소 저해활성 역시 polypehnol성 화합물에 유래된 결과들이 보고되어 있다(16).
- 반응액에 100 mM Na2CO3 750 μL로 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하고 저해율을 계산하였다.
- 25 mL를 첨가하여 혼합한 다음 상온에서 1시간 동안 정치시켜 발색시켰다. 발색된 청색을 분광광도계(Spectronic 2D)를 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 phenolics 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
- 보리수 열매 식초 발효 중의 초산균수 측정은 발효액을 멸균증류수로 10배 희석하고 yeast extract(1%), CaCO2(4%), ethanol(1.5%)이 함유된 YCE 한천배지에 도말한 후 30℃에서 72시간 동안 배양한 후 clear zone이 형성된 집락을 계수하여 초산균수를 측정하였다. 효모균수 측정은 발효액을 멸균증류수로 10단 희석법으로 적당히 희석하고 potato dextrose 한천배지(PDA)에 chlorophenicol 100 μg/mL이 함유된 배지에 speared plate method로 도말한 후 30℃에서 72시간 동안 배양하여 형성된 집락을 계수하여 효모균 수를 측정하였다.
- 환원당은 Miller의 DNS법(13)을 사용하여 분석하였다. 식초 발효액을 원심분리기로 원심분리한 후 상등액을 3차 증류수로 50배 희석한 후 시료 0.1 mL에 DNS 시약을 1mL 첨가하여 100℃의 끓는 물에서 10분 동안 발색시킨 후 얼음물에서 급속히 냉각하여 분광광도계(Spectronic 2D,USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선과 비교하였다. 검량선 작성을 위한 표준물질로는 포도당을 사용하였다.
- 알코올 측정은 증류법으로 발효 중에 있는 시료 100 mL에 물 100 mL를 가하여 희석시킨 후 증류시켜 80 mL을 회수한 후 증류수 20 mL를 넣어 100 mL로 표선을 맞춘 다음 알코올계로 측정하였다.
- 유기산 분석은 TSKgel ODS-100V column(4.6×250 mm,5 μm, Tosoh Corp., Tokyo, Japan)과 HPLC(Agilent 1200series, Agilent Co., Forest Hill, Australia)을 이용하여 분석되었다.
- 8% trichloroacetic acid를 각각 1 mL를 가하여 100℃에서 20분간 가열하여 발색후 냉각시키고 520 nm에서 흡광도를 측정하였다(15). 음성 대조구 실험은 시료 대신에 완충액을 사용하였고, 라디칼 소거능은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율(%)로 나타내었다.
- 그 후 분광광도계(Spectronic 2D)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준물질은 rutin을 이용하여 작성한 표준 검량곡선으로부터 값을 산출하였다.
- 효모균수 측정은 발효액을 멸균증류수로 10단 희석법으로 적당히 희석하고 potato dextrose 한천배지(PDA)에 chlorophenicol 100 μg/mL이 함유된 배지에 speared plate method로 도말한 후 30℃에서 72시간 동안 배양하여 형성된 집락을 계수하여 효모균 수를 측정하였다.
대상 데이터
- ABTS radical(ABTS＋•)은 732 nm에서 흡광도값이 0.7±0.02가 되도록 에탄올로 희석하여 사용하였다.
- 에서 구입하였다. HPLC-grade H2O, methanol,acetonitrile 그리고 glacial acetic acid는 Fisher Scientific(Fairlawn, NJ, USA)에서 구입하였다. Folin–Cicalteuphenol, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), potassium ferricyanide, trichloroacetic acid(TCA), 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTs), 2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine(TPTZ), p-nitrophenol- α-D-glucopyranoside(p-NPG), p-nitrophenol-butyrate(p-NPB) α-glucosidase(TypeI: from Bakers Yeast), α-amylase(Human saliva), lipase(Type II: porcine pancreas)또한 Sigma Chemical Co.
- 보리수 열매 식초는 경상남도 거제시 남부면 소재 수림농장에서 담금한 후 10일이 경과한 시료를 60일간 채취하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 미생물 배양용 배지는Difco사 제품(USA)을 사용하였다.
- 보리수 열매 식초는 경상남도 거제시 남부면 소재 수림농장에서 담금한 후 10일이 경과한 시료를 60일간 채취하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 미생물 배양용 배지는Difco사 제품(USA)을 사용하였다. 12개 표준 phenolic acid 화합물(gallic acid, p-hydroxylbenzoic acid, protocatechuicacid, vanillic acid, p-coumraic acid, caffeic acid, ferulic acid,tannic acid, salicylic acid, trans-cimmamic acid 및 chlorogenicacid) 및 3개 표준 flavanol 화합물(rutin, qucercetin 및 kaempferol), 7개의 flavan-3-ol 표준 화합물(catechin,epicatechin, epigallocatechin, catechin gallate, epicatechingallate, gallocatechin gallate, 및 epigallocatechin gallate)은Sigma Chemical Co.
- 시료 20 μL를주입하였고 UV 검출기(Agilent 1200 series, Agilent Co.)의 270 nm에서 측정하였다(1)
- 시료는 20 μL로 주입하였고 UV 검출기(Agilent 1200 series, Agilent Co.)의 280 nm에서 측정하였다(1)
- 시료는 20 μL를주입하였고 UV 검출기(Agilent 1200 series, Agilent Co.)210 nm에서 측정하였다.
- 반응액에 100 mM Na2CO3 750 μL로 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하고 저해율을 계산하였다. 음성 대조구로 완충액을 사용하였다(15). 각 실험은 3회 반복하여 수행하였다.
이론/모형
- Lee 등(5)의 방법을 따라 라디칼 소거활성을 측정하였다. 1.
- 수용성 phenolics는 Folin-Ciocalteu법(14)으로 측정하였다. 각각의 식초 발효액을 원심분리기로 원심분리한 상등액을 50배 혹은 100배 희석한 후 0.
- 환원당은 Miller의 DNS법(13)을 사용하여 분석하였다. 식초 발효액을 원심분리기로 원심분리한 후 상등액을 3차 증류수로 50배 희석한 후 시료 0.
성능/효과
- α-Amylase 저해활성은 1.22%로 발효 10일째에 거의 활성을 보이지 않았으나 점차적으로 증가하여 발효 60일째에는 52.12%의 우수한 저해활성을 보였다(Fig. 2B).
- 1과 같았다. 3 종의 라디칼 소거활성은 발효 20일째 급격히 증가하였고 이후에도 지속적으로 증가하는 경향을 보였다.
- 1A). ABTS 라디칼 소거활성은 발효 기간에 따라 각각 27.56%(발효 10일), 62.18%(발효 20일), 76.12%(발효 40일) 및 79.27%(발효 60일)로 DPPH보다 약간 더 우수한 라디칼 소거활성을 보였다(Fig. 1B). Hydroxyl(·OH) 라디칼 소거활성 역시 DPPH 및ABTS와 마찬가지로 발효 과정 중 꾸준히 증가하는 경향을 나타내었고 발효 60일째 68.
- Flavonols 화합물 중 3종의 catechin gallocatechin gallate 및 catechin gallate는 발효 과정 중 검출되지 않았다. Epigallocatechin과 epicatechin은 발효가 진행됨에 따라 조금씩 함량이 증가하였고, 발효60일째 각각 24.84 mg/mL 및 37.42 mg/mL를 함유하고 있었고, epigallocatechin gallate와 epicatechin gallate는 반대로 함량이 감소하여 각각 24.53 mg/mL 및 115.97 mg/mL를 함유하고 있었다. 발효 전 기간에 걸쳐 주요 flavonols 화합물은 epicatechin gallate 이었으나 발효 과정 중 감소하는 결과를 나타내어 발효 60일째 총 flavonols 함량은 202.
- Hydroxyl(·OH) 라디칼 소거활성 역시 DPPH 및ABTS와 마찬가지로 발효 과정 중 꾸준히 증가하는 경향을 나타내었고 발효 60일째 68.72%의 소거활성을 보였다(Fig. 1C).
- 2B). Pancreatic lipase 저해 활성 역시 발효 10일째에는 거의 없었고 발효40일째 49.21%를 나타내었고 발효 60일째에는 53.66%의 지방분해 효소 저해활성을 나타내었다(Fig. 2C)
- 한편, 탄수화물 분해효소 저해활성에 관여하는 물질은 polyphenol성 화합물 중 flavonols 화합물로 알려져 있으며(33) 지방 분해효소 저해활성 역시 polypehnol성 화합물에 유래된 결과들이 보고되어 있다(16). 따라서 본 결과에서 뜰보리수 열매 혹은 이로부터 발효된 식초에 함유된 flavonols 및 phenolic acids 화합물에 기인하여 탄수화물과 지방 분해효소 저해활성이 나타나는 것으로 추측되었다.
- Cho와 Joo(1) 및 Joo 등(26)은 과실주 발효 시 esterase 효소 작용에 의해 gallic acid가 증가하는 것으로 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 따라서 본 연구에서 생리활성 물질의 변화는 발효 원료 및 발효 과정 중 생성되는 산이나 미생물 유래 당 혹은 지방 가수분해효소 등에 의해 결합형 polyphenol성 화합물이 유리형으로 전환된 것으로 추정되어졌다.
- 뜰보리수 열매 식초의 발효 기간별 유기산 함량 변화를 살펴본 결과 Table 3과 같았다. 발효 10일부터 60일까지의 주요 유기산은 acetic acid와 lactic acid의 함량이 가장 높았으며, glutaric aid는 발효 과정 중 검출되지 않았다. Oxalic acid는 발효 40일까지 0.
- 11log CFU/mL)보다 약간 더 많은 것으로 나타나 초산발효와 알코올 발효가 동시에 진행된 것으로 추정하였다. 발효 40일째에는 초산균보다는 효모 생균수가 좀 더 많았으나 발효60일째에는 효모의 경우 감소하는 추세를 나타내 사멸기로 들어섰고 초산균은 정지기에 들어선 것으로 추정되었다.
- 97 mg/mL를 함유하고 있었다. 발효 전 기간에 걸쳐 주요 flavonols 화합물은 epicatechin gallate 이었으나 발효 과정 중 감소하는 결과를 나타내어 발효 60일째 총 flavonols 함량은 202.76mg/mL를 함유하고 있었다(Table 5).
- 22 mg/mL(발효60일)로 발효 과정 중 서서히 증가하였다. 수용성 flavonoids함량은 각각 0.12 mg/mL(발효 10일), 0.13 mg/mL(발효 20일), 0.13 mg/mL(발효 40일) 및 0.14 mg/mL(발효 60일)로발효 과정 중 크게 변화는 없는 것으로 나타났다(Table 4).
- 6%로 가장 높았다. 알코올 함량은 발효 10일째 2.6%에서 20일째까지 증가하여 6.6%로 최대치를 나타내었고, 이후 감소하여 발효 60일째 2.0%로 나타났다(Table 1)
- Kang 등(27)은 항산화 활성의 지표 물질은 phenolic acid와 flavonoid 화합물이라 하였으며, phenolic 화합물의 농도가 상승할수록 증가한다고 보고하였다(3). 이러한 연구 결과로 볼 때 본 연구에서는 flavonols 중에서는 epicatechingallate와 phenolic acids 중에서는 gallic acid의 영향을 받아 우수한 라디칼 소거활성을 나타낸 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 Hong 등(7)의 복분자 식초, Park 등(28)의 현미 배 식초, Verzalloni 등(29)의 발사믹 식초 연구에서 많은 양의 안토시아닌 및 phenolic 물질들이 항산화 활성 증가에 크게 영향을 미친다는 결과와 일치함을 알 수 있다.
- 뜰보리수 열매 식초의 자연 발효 중 초산균수와 효모균 수 변화는 Table 2와 같았다. 초산균수는 발효 10일째 4.32log CFU/mL에서 증가하여 발효 60일째 5.4 log CFU/mL 있었고, 효모균수는 발효 10일째 3.23 log CFU/mL에서 증가하여 발효 40일째 5.8 log CFU/mL로 최대치를 나타낸 후 발효 60일째에는 5.5 log CFU/mL로 감소하였다(Table 2)
- 2와 같았다. 탄수화물 및 지방분해효소 저해활성은 발효 20일째 급격히 증가하였고 이후에도 지속적으로 증가하는 경향을 보였다.
- 이는 발효가 진행됨에 따라 수용성 저 분자 탄닌류가 자연 발효액에 더 많이 용출된 것으로 판단되었다. 특히, 본 연구에서는 epigallocatechin gallate 및 epicatechin gallate 2종이 발효 과정 중 점차 감소하였으며, 이는 발효 미생물이 생성하는 esterase 효소 작용으로 ester 결합된 화합물들이 분해되고 이에 따라 gallic acid가 증가한 것으로 추정되었고다. Cho와 Joo(1) 및 Joo 등(26)은 과실주 발효 시 esterase 효소 작용에 의해 gallic acid가 증가하는 것으로 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다.
- 또한 본 연구에서 검출된 flavonols중 catechin류와 phenolic acids 중 gallic acid의 경우에는 섭취하였을 시 항산화 활성이 뛰어난 것으로 보고되어있고, Lee 등(5) 역시 뜰보수리 열매의 주요 화합물은 catechin류와 gallic acid 등을 함유하고 있다고 보고하여 본 연구 결과와도 일치하였다. 한편 발효초기에는 catechin류 함량과 탄닌류의 저 분자 phenolic acids 함량이 거의 유사하였으나, 발효가 진행됨에 따라 catechin류 함량은 감소하였고탄닌류는 증가하였다. 이는 발효가 진행됨에 따라 수용성 저 분자 탄닌류가 자연 발효액에 더 많이 용출된 것으로 판단되었다.
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