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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 피세아테놀과 레스베라트롤이 팔미틴산을 처리한 지방간질환 간세포 모델과 비만/당뇨 동물모델의 간 조직에서 염증 조절 효과를 가지는지를 AML12 마우스 일반 간세포와 비만/당뇨 동물 모델인 KK/HlJ 마우스를 대상으로 검증하고자 하였다.
- 본 연구에서는 팔미틴산을 처리한 지방간질환 간세포 모델과 비만/당뇨 동물 모델인 KK/HlJ 마우스를 이용하여 피세 아테놀과 레스베라트롤 투여가 염증조절에 주는 영향을 알 아보고자 하였다. 4주간의 피세아테놀과 레스베라트롤 섭취는 공복혈당과 경구당부하 검사 2시간 후 AUC를 감소시켜 혈당 조절 개선 효과를 보였다.
- 하지만 레스베라트롤 투여는 이들 인자들을 유의적으로 변화시키지 않았다. 피세아테놀의 지방간질환 모델에서의 염증 관련 인자와 TLR4 및 NF-κB 경로 조절 효과는 그동안 검증되지 않았으므로, 본 연구는 피세아테놀이 TLR4와 NF-κB 경로를 포함한 염증조절 효과를 가짐을 제안한 의미 있는 연구이다. 동일 용량의 레스베라트롤 투여군의 경우 유의적인 항염증 효과를 보이지 않았는데, 이는 용량 대비 피세아테놀이 레스베라트롤보다 우수한 항염증 효과를 가짐을 제안한다.
제안 방법
- C57BL/6J 수컷 마우스를 대상으로 고지방식이로 비만을 유도한 마우스를 활용한 선행 연구와 비교하였을 때본 연구는 비만/당뇨 마우스 모델인 KK/HlJ 수컷 마우스를 대상으로 하였다. 또한, 선행연구의 경우 osmotic pump를 등 부위에 피하 이식하여 소량의 레스베라트롤을 하루 24시간 지속해서 제공한 반면, 본 연구는 하루 1회 피세아테놀과 레스베라트롤을 경구 투여하였다. 이러한 선행 연구와의 차이점들이 레스베라트롤의 혈당 조절 개선 효과가 선행 연구에 비해 제한적인 이유가 될 수 있다고 생각된다.
- 따라서 레스베라트롤 투여가 혈당 조절 개선 효과를 가지고 이는 부분적으로 혈중 아디포넥틴 농도의 증가에 의한 것으로 제안된다. 본 연구에서는 레스베라트롤 유사물질인 피세아테놀의 혈당 조절 효과를 검증하였고, 이를 레스베라트롤의 효과와 비교하였다. 4주간의 피세아테놀 섭취는 공복혈당과 경구당부하 검사 2시간 후 AUC를 개선시켰으며, 레스베라트롤은 공복혈당 개선 효과는 보이지 않았고 경구 당부하검사 2시간 후 AUC만 감소시켰다.
- 실험식이 급여 시작 전후에 경구당부하 검사를 실시하였다. 실험동물을 12시간 절식시켜 꼬리 정맥에서 채혈하여 공복혈당을 측정한 후, 포도당 용액(2 g/kg)을 경구 투여하고 15분, 30분, 60분, 120분 후 혈당계(Glucocard X-Meter,Arkray, Kyoto, Japan)를 이용하여 혈당을 측정하였다.
- 추출된 RNA와 High capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현은 SYBR Green(Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems)과 primer(Bioneer,Daejeon, Korea)를 혼합하여 real-time PCR system(StepOnePlus, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 확인하였다. 증폭 cycle은 40 cycles을 실시하였다.
- 혈당은 인슐린 감수성, 인슐린 분비능력, 당 대사(해당 과정, 글리코겐 분해, 포도당 신생과정 등) 등의 여러 기전에 의해 조절된다. 이들 중 특히 인슐린 감수성에 관여하는 인자들인 insulin receptor(IR), AMP-activated protein kinase(AMPK), peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR) gamma를 선별하였고, 피세아테놀과 레스베라트롤 섭취가 이들 인자의 간 조직에서의 발현에 주는 영향을 분석하였다. 4주간의 피세아테놀 섭취는 IR과 AMPK를 증가시키는 경향을 보여주었고, PPAR gamma의 간 조직에서의 발현을 유의적으로 증가시켰다.
- 수컷 마우스는 실험기간 동안 표준식이(10% kcal from fat; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA)를 제공하였다. 피세아테놀(FutureChem, Seoul, Korea)과 레스베라트롤(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)은 4주 동안 매일 오전 경구 투여(10 mg/kg/d)하였다. 식이와 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다.
- 피세아테놀과 레스베라트롤 처리가 팔미틴산으로 유도한 지방간질환 세포 모델에서 염증 관련 인자와 경로에 주는 영향을 검증하기 위해 AML12 mouse 간세포에 팔미틴산을 48시간 처리한 후 50 µM의 피세아테놀과 레스베라트롤을 24시간 처리하였다. 팔미틴산을 처리하지 않은 정상 간세포 모델과 팔미틴산을 처리한 지방간질환 간세포 모델에서 피세아테놀의 처리는 TLR4와 NF-κB의 발현 수준을 유의적으로 감소시켰다(Fig.
대상 데이터
- 20주령의 KK/HlJ 수컷 마우스를 총 3개의 그룹으로 나누어 배치하였다. 1) KK 대조군(KK), 2) 피세아테놀군(KK_PIC), 3) 레스베라트롤군(KK_RSV)으로 각 군당 실험동물은 10마리씩 배정되었다.
- AML12 마우스 간세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. DMEM/F-12 media(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 10% fetal bovine serum, 항생제(100 units/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin), 0.
- 4주간의 피세아테놀 섭취는 공복혈당과 경구당부하 검사 2시간 후 AUC를 개선시켰으며, 레스베라트롤은 공복혈당 개선 효과는 보이지 않았고 경구 당부하검사 2시간 후 AUC만 감소시켰다. C57BL/6J 수컷 마우스를 대상으로 고지방식이로 비만을 유도한 마우스를 활용한 선행 연구와 비교하였을 때본 연구는 비만/당뇨 마우스 모델인 KK/HlJ 수컷 마우스를 대상으로 하였다. 또한, 선행연구의 경우 osmotic pump를 등 부위에 피하 이식하여 소량의 레스베라트롤을 하루 24시간 지속해서 제공한 반면, 본 연구는 하루 1회 피세아테놀과 레스베라트롤을 경구 투여하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균±표준오차(mean±SEM)로 제시하였다. 대조군과 실험군 간의 평균 차이는 one-way ANOVA 분석 후 LSD 사후검정을 통해 분석하였으며, 통계적인 유의성 검정은 유의수준 0.05를 기준으로 하였다.
- 본 연구에 사용된 모든 통계분석은 SPSS Statistics 23(International Business Machines, Armonk, NY, USA)을 이용하여 분석되었다. 모든 실험 결과는 평균±표준오차(mean±SEM)로 제시하였다.
이론/모형
- Louis, MO, USA)과 인슐린(Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA) 농도를 측정하였다. 인슐린 저항성의 지표로서 Homeostasis Model Assessment of insulin resistance index(HOMA-IR)를 이용하였고, 췌장 베타세포의 인슐린분비능의 지표로 HOMA β-cell을 계산하였다(23). HOMA-IR=[fasting insulin (μIU/mL)×fasting glucose (mmol/L)]/22.
성능/효과
- 본 연구에서는 레스베라트롤 유사물질인 피세아테놀의 혈당 조절 효과를 검증하였고, 이를 레스베라트롤의 효과와 비교하였다. 4주간의 피세아테놀 섭취는 공복혈당과 경구당부하 검사 2시간 후 AUC를 개선시켰으며, 레스베라트롤은 공복혈당 개선 효과는 보이지 않았고 경구 당부하검사 2시간 후 AUC만 감소시켰다. C57BL/6J 수컷 마우스를 대상으로 고지방식이로 비만을 유도한 마우스를 활용한 선행 연구와 비교하였을 때본 연구는 비만/당뇨 마우스 모델인 KK/HlJ 수컷 마우스를 대상으로 하였다.
- 본 연구에서는 팔미틴산을 처리한 지방간질환 간세포 모델과 비만/당뇨 동물 모델인 KK/HlJ 마우스를 이용하여 피세 아테놀과 레스베라트롤 투여가 염증조절에 주는 영향을 알 아보고자 하였다. 4주간의 피세아테놀과 레스베라트롤 섭취는 공복혈당과 경구당부하 검사 2시간 후 AUC를 감소시켜 혈당 조절 개선 효과를 보였다. 또한, 팔미틴산을 처리한 지방간질환 간세포 모델에 피세아테놀과 레스베라트롤을 처리한 결과 염증조절 경로인자인 TLR4와 NF-κB의 발현을 유의적으로 감소시켰다.
- 4주간의 피세아테놀과 레스베라트롤 섭취는 공복혈당과 경구당부하 검사 2시간 후 AUC를 감소시켜 혈당 조절 개선 효과를 보였다. 또한, 팔미틴산을 처리한 지방간질환 간세포 모델에 피세아테놀과 레스베라트롤을 처리한 결과 염증조절 경로인자인 TLR4와 NF-κB의 발현을 유의적으로 감소시켰다. 이를 in vivo 비만/당뇨 동물 모델 인 KK/HlJ 마우스의 간 조직에서 확인한 결과 피세아테놀 섭취는 NLRP3와 NF-κB의 간 조직에서의 발현을 유의적 으로 감소시켰고, IL-1 발현을 감소시키는 경향을 보였다.
- 1). 레스베라트롤 섭취는 경구당부하 검사 90분, 120분 후의 혈당 및 전체 AUC를 피세아테놀 군과 유사한 수준으로 감소시켜 혈당 조절 개선 효과를 보였다(Fig. 1).
- 3). 레스베라트롤의 처리는 TLR4 발현을 유의적으로 감소시켰으며, 지방간질환 간세포 모델에서 NF-κB의 발현을 유의적으로 감소시켰다. TLR4는 외부항원에 대한 선천성 면역을 유도하는 센서로서의 기능을 담당하고, TLR4의 증가는 NF-κB의 활성화를 통해 전염증성 사이토카인의 생성 및 분비를 증가시킨다(25).
- 이러한 선행 연구와의 차이점들이 레스베라트롤의 혈당 조절 개선 효과가 선행 연구에 비해 제한적인 이유가 될 수 있다고 생각된다. 본 연구 결과 피세아테놀은 레스베라트롤과 비교하여 유사한 포도당 내성을 가지고 더욱 우수한 고혈당 개선 효과를 가짐을 보였다.
- 또한, 팔미틴산을 처리한 지방간질환 간세포 모델에 피세아테놀과 레스베라트롤을 처리한 결과 염증조절 경로인자인 TLR4와 NF-κB의 발현을 유의적으로 감소시켰다. 이를 in vivo 비만/당뇨 동물 모델 인 KK/HlJ 마우스의 간 조직에서 확인한 결과 피세아테놀 섭취는 NLRP3와 NF-κB의 간 조직에서의 발현을 유의적 으로 감소시켰고, IL-1 발현을 감소시키는 경향을 보였다. 하지만 동량의 레스베라트롤 섭취는 이와 같은 항염증 효과를 보이지 않았다.
- 1). 인슐린 저항성의 지표인 HOMA-IR과 췌장 베타세포의 인슐린분비능의 지표인 HOMA β-cell은 피세아테놀 섭취 군에서 HOMA-IR이 감소하고 HOMA β-cell은 증가하는 경향을 보였으나, 군간 유의적인 차이가 없었다(Table 2). 레스베라트롤의 혈당 조절 효과에 대한 선행 연구는 고지방식이로 비만을 유도한 마우스 모델에 osmotic pump를 사용하여 8 mg/kg/d의 레스베라트롤을 4주간 제공한 결과 공복혈당, 혈중 인슐린, HOMA-IR, 혈중 아디포넥틴 농도가 개선되었음을 보였다(24).
- 염증을 수반하는 만성 콩팥병, 비알코올성 지방간질환, 당뇨병을 가지는 경우 TLR4와 NF-κB가 증가함이 보고되었고, 이는 다른전염증성 사이토카인의 증가로 이어진다(26,27). 팔미틴산으로 유도한 지방간질환 세포 모델에서의 피세아테놀과 레스베라트롤 처리의 TLR4-NF-κB 경로 조절 효과를 invivo에서 확인하기 위해 KK/HlJ 마우스의 간에서 염증 인자의 발현을 분석한 결과, 피세아테놀 투여는 NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3(NLRP3)와 NFκB의 간 조직에서의 발현을 유의적으로 감소시켰고, IL-1의 발현을 감소시키는 경향을 보였다(Fig. 4).
- 피세아테놀과 레스베라트롤 처리가 팔미틴산으로 유도한 지방간질환 세포 모델에서 염증 관련 인자와 경로에 주는 영향을 검증하기 위해 AML12 mouse 간세포에 팔미틴산을 48시간 처리한 후 50 µM의 피세아테놀과 레스베라트롤을 24시간 처리하였다. 팔미틴산을 처리하지 않은 정상 간세포 모델과 팔미틴산을 처리한 지방간질환 간세포 모델에서 피세아테놀의 처리는 TLR4와 NF-κB의 발현 수준을 유의적으로 감소시켰다(Fig. 3).
후속연구
- 하지만 동량의 레스베라트롤 섭취는 이와 같은 항염증 효과를 보이지 않았다. 결론적으로 혈당 조절 개선 효과와 항염 증 효과에 있어 피세아테놀이 레스베라트롤보다 우수한 효 과를 가지고, 피세아테놀의 항염증 효과는 혈당 조절 개선 효과에 부분적으로 기여할 것으로 제안한다.
- 2). 따라서 피세아테놀의 혈당 조절 개선 효과는 부분적으로 인슐린 감수성에 관여하는 인자들인 IR, AMPK, PPAR gamma의 발현 증가에 의한 것이라고 제안된다.
- 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha), c-Jun Nterminal kinase, IκB kinase α 등의 전염증성 인자들은 인슐린 저항성을 악화시키고, 이들을 억제하는 것은 인슐린 감수성 개선과 이에 따른 혈당조절능력 개선 효과를 가짐이 보고되었다(28-31). 본 연구에서 피세아테놀의 항염증 효과는 공복혈당과 경구당부하 검사 2시간 후 AUC를 개선시킨 피세아테놀의 혈당 조절 개선 효과에 부분적으로 기여할것으로 생각한다.
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