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문제 정의
- 본 연구에서는 단핵구의 대식세포로의 분화과정에서 CO의 영향을 인간 단핵구세포주 THP-1을 이용하여 조사하였다. 또한 분화한 THP-1 대식세포의 활성화 과정에서 CO의 효과에 대해서도 조사하였다.
- 본 연구에서는 단핵구의 대식세포로의 분화과정에서 CO의 영향을 인간 단핵구세포주 THP-1을 이용하여 조사하였다. 또한 분화한 THP-1 대식세포의 활성화 과정에서 CO의 효과에 대해서도 조사하였다.
가설 설정
- (B) Cell adherence was analyzed as described in “Materials and Methods”, and data shown represent relative cell adherence.
제안 방법
- cells/well의 밀도로 분주하여 다양한 농도의 CORM-2와 PMA를 처리하였다. 48시간 배양 후 부유 세포 및 0.01% trypsin-EDTA을 이용하여 dish에 부착한 세포를 각각 수확하여 trypan blue dye exclusion 방법으로 염색하여 EVETM automatic cell counter(NanoEntek, Seoul, Korea)를 이용하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 측정하여 생존과 세포성장을 분석하였다. 세포의 부착능은 살아있는 세포의 전체 [N(t)]와 부착한 세포의 평균[N(a)]을 이용하여 [N(a)/N(t)] ×100으로 계산하여 세포수를 표현하였다.
- CORM-2를 30분 동안 전처리 후 100 nM PMA로 THP-1 세포의 분화를 자극하였다. 48시간 후, 배양중인 세포에 carboxylate-modified red fluorescent latex beads를 첨가하여 4시간 동안 반응시키고 형광현미경으로 관찰하였다(Fig. 3). PMA 자극에 의해 THP-1세포는 형태학적으로는 대식세포와 유사한 모습을 보이지만, CORM-2가 처리된 세포는 농도의존적으로 fluorescence intensity가 현저히 감소함을 관찰할 수 있었다.
- 다음으로, 대식세포로 분화하는 과정에서 수반되는 막표면단백질의 변화에서 CO의 역할를 조사하였다. 다양한 농도(1,10, 100 μM)의 CORM-2를 30분 동안 전처리 후 100 nM PMA로 THP-1 세포의 분화를 자극하였다. 분화 과정 초기의 막표면 분화인자의 변화를 보기 위하여, PMA로 자극하고 24시간 후에 부유 세포와 부착한 모든 세포를 수확하여 단백질을 얻고 Western blotting을 이용하여 관찰하였다.
- PMA 처리 후 6일 동안 분화가 유도된 대식세포에 LPS 자극에 의해 inflammatory cytokines인 IL-6와 TNF-α의 분비에 미치는 CO의 영향을 조사하였다.
- THP-1 세포를 24-well plate에 5×104 cells/well의 밀도로 분주하여 다양한 농도의 CORM-2와 PMA를 처리하였다.
- THP-1 세포를 60-mm dish에 2×105 cells/ml의 농도로 분주하여 사용하였고, CORM-2 (1, 10, 100 μM)를 30분 동안 처리한 후 100 nM PMA로 세포를 자극하여 24시간 배양하였다.
- 배양중인 각 well에 latex beads를 5 μl 첨가하고 4시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양시킨 후 PBS로 3번 조심스럽게 세포를 씻어준 다음 형광 현미경으로 관찰하였다. 그리고 6일간 분화된 대식세포에서의 포식기능을 측정하기 위하여, 세포에 E. coli BioParticles과 opsonizing reagent를 1:1로 섞어서 각 well에 첨가하고 2시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양시킨 후 사용하였다. 위와 같은 방법으로 잘 씻어준 다음 LSM 510 laser-scanning confocal microscope (Zeiss, Göettingen, Germany)를 사용하여 관찰하였다.
- 다양한 농도(1,10, 100 μM)의 CORM-2를 30분 동안 전처리 후 100 nM PMA로 THP-1 세포의 분화를 자극하였다.
- 다음으로, 대식세포로 분화하는 과정에서 수반되는 막표면단백질의 변화에서 CO의 역할를 조사하였다. 다양한 농도(1,10, 100 μM)의 CORM-2를 30분 동안 전처리 후 100 nM PMA로 THP-1 세포의 분화를 자극하였다.
- 다음으로, 충분히 분화가 유도된 대식세포의 phagocytic activity에 있어서 CO의 역할을 조사하였다. 제조사가 공급한 protocol에 따라 분화된 대식세포에 E.
- coli (K-12 strain) Bio Particles와 opsonizing reagent를 포함한 용액을 첨가하여 4시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 대식세포에 CORM2를 전처리 하고 100 ng/ml LPS로 자극하여 laser-scanning confocal microscope를 사용하여 세포를 관찰하였다. Fig.
- 또한 fluorescence-conjugated latex beads를 이용한 포식작용의 실험에서, CORM-2는 PMA 단독으로 처리한 세포에 비해 포식작용이 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다. 대식세포의 활성화에 CO의 영향을 더 알아보기 위하여, 배양중인 THP-1 세포를 PMA로 2일 동안 자극한 후 이어 4일간 배양을 하면서 완전히 분화된 대식세포를 만들었다. 분화된 대식세포에서 CORM-2는 LPS로 자극한 세포로부터 분비되는 inflammatory cytokines인 IL-6와 TNFα의 분비를 감소시켰다.
- 실험목적에 맞게 24 혹은 48시간 동안 배양한 후 세포를 얻어 세포성장, 부착능 및 Western blotting 등을 수행하였다. 또한, 충분히 분화된 대식세포를 얻기 위하여 PMA로 2일 동안 세포를 자극한 후 새로운 배양액으로 교환하고 4일간 더 배양시켜서 얻었다.
- 배양중인 THP-1 세포에 다양한 농도(1,10, 100 μM)의 CO를 유리시키는 물질인 CORM-2를 30분 동안 전처리 후 100 nM PMA로 48시간 동안 분화를 유도하였다.
- 배양중인 각 well에 latex beads를 5 μl 첨가하고 4시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양시킨 후 PBS로 3번 조심스럽게 세포를 씻어준 다음 형광 현미경으로 관찰하였다.
- Membrane은 항체의 비특이적 부착을 막기 위하여 5% skim milk에 1시간 동안 두었고, 그 후 적당한 일차 항체 및 horse radish peroxide (HRP)가 부착되어 있는 이차 항체를 반응시켰다. 부착된 면역복합체는 ECL kit를 이용하여 반응시킨 후 LAS-3000 Luminescent Image Analyzer (Fujifilm, Tokyo, Japan) 기기에서 단백질 발현을 분석하였다.
- 분비된 사이토카인의 측정은 상품화된 capture-ELISA kit를 사용하였고, 제조사 R&D Systems (Minneapolis, MN,USA)이 공급한 protocol에 따라 실시하였다.
- 분화 유도한 THP-1의 포식작용은 평균 직경이 0.5 μm인 carboxylate-modified red fluorescent latex beads (Sigma, St. Louis, MO, USA)와 E. coli (K-12 strain) BioParticles (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)의 두가지를 이용하여 제조사가 공급한 protocols에 따라 실시하였다.
- 세포에 1, 10, 100 μM의 농도로 CORM-2를 30분 동안 먼저 처리한 후 분화유도제 PMA (100 nM)로 분화를 유도하였다.
- 세포에 1, 10, 100 μM의 농도로 CORM-2를 30분 동안 먼저 처리한 후 분화유도제 PMA (100 nM)로 분화를 유도하였다. 실험목적에 맞게 24 혹은 48시간 동안 배양한 후 세포를 얻어 세포성장, 부착능 및 Western blotting 등을 수행하였다. 또한, 충분히 분화된 대식세포를 얻기 위하여 PMA로 2일 동안 세포를 자극한 후 새로운 배양액으로 교환하고 4일간 더 배양시켜서 얻었다.
- 실험은 적어도 세 번 반복하였으며, 결과는 means ± standard deviations (SD)로 표현하였다.
- 단핵구의 대식세포로의 분화 과정의 지표로 가장 먼저 나타나는 현상은 세포의 부착능의 증가와 더불어 세포 모양의 형태학적 변화이다. 우선적으로 PMA로 THP-1 세포의 분화 유도과정에서 세포의 부착능 및 형태학적 변화에 CO가 미치는 영향을 조사하였다. 배양중인 THP-1 세포에 다양한 농도(1,10, 100 μM)의 CO를 유리시키는 물질인 CORM-2를 30분 동안 전처리 후 100 nM PMA로 48시간 동안 분화를 유도하였다.
- 위와 같은 방법으로 잘 씻어준 다음 LSM 510 laser-scanning confocal microscope (Zeiss, Göettingen, Germany)를 사용하여 관찰하였다.
- 포식 기능은 대식세포의 가장 주요한 특징이기 때문에, PMA 자극에 의해 단핵구의 대식세포로의 분화 동안 CO에 의한 phagocytic activity의 변화를 조사하였다. CORM-2를 30분 동안 전처리 후 100 nM PMA로 THP-1 세포의 분화를 자극하였다.
대상 데이터
- IL-6와 TNF-α의 분비량를 측정하기 위한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다. Fluorescence-conjugated Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles 은 Molecular Probes (Eugene, OR, USA) 제품을 사용하였고, enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting kit는 Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA) 제품을 사용하였다.
- HO-1, CD14, CD18, ICAM-1, β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 그리고 CD11b에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA) 제품을 사용하였다.
- Tricarbonyldichlororuthenium(II) dimer (CORM-2, Ru2Cl4(CO)6), RuCl3, protease inhibitor cocktail, carboxylate-modified red fluorescent latex beads, trypan blue는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. HO-1, CD14, CD18, ICAM-1, β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 그리고 CD11b에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA) 제품을 사용하였다.
- 인간 단핵구세포주 THP-1는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. 세포는 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10 mM HEPES, 10% heat-inactivated FBS를 포함하는 RPMI-1640 배양액에서 5% CO2 조건에서 37℃ incubator에서 0.
데이터처리
- 실험은 적어도 세 번 반복하였으며, 결과는 means ± standard deviations (SD)로 표현하였다. 모든 실험결과는 one way ANOVA test를 이용하여 p-value를 구하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 다양한 농도(1,10, 100 μM)의 CORM-2를 30분 동안 전처리 후 100 nM PMA로 THP-1 세포의 분화를 자극하였다. 분화 과정 초기의 막표면 분화인자의 변화를 보기 위하여, PMA로 자극하고 24시간 후에 부유 세포와 부착한 모든 세포를 수확하여 단백질을 얻고 Western blotting을 이용하여 관찰하였다. PMA로 자극한 THP-1 세포에서 CD14, CD11b, CD18 및 ICAM-1의 발현이 크게 증가하였다.
- 상층액을 수거하여 IL-6와 TNF-α의 분비된 양을 ELISA 방법을 사용하여 분석하였다.
성능/효과
- CO-releasing compound인 CORM-2는 PMA로 분화를 자극한 THP-1 세포의 성장과 세포 부착능의 약한 감소를 보였고, 막표면 분화 인자인 CD14, CD11b 및 CD18의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 fluorescence-conjugated latex beads를 이용한 포식작용의 실험에서, CORM-2는 PMA 단독으로 처리한 세포에 비해 포식작용이 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다.
- 3). PMA 자극에 의해 THP-1세포는 형태학적으로는 대식세포와 유사한 모습을 보이지만, CORM-2가 처리된 세포는 농도의존적으로 fluorescence intensity가 현저히 감소함을 관찰할 수 있었다. 또한, 부착한 세포와 부착하지 않은 세포 모두를 수거하여 fluorescence intensity를 flow cytometry로 측정한 결과, control 세포는 2.
- 분화된 대식세포에서 CORM-2는 LPS로 자극한 세포로부터 분비되는 inflammatory cytokines인 IL-6와 TNFα의 분비를 감소시켰다. 게다가, 대식세포에 fluorescenceconjugated E. coli K-12 bioparticles를 이용하여 포식작용을 측정한 결과 CORM-2를 처리한 세포에서는 E. coli의 포식작용이 현저이 감소됨을 관찰할 수 있었다. 이들 결과를 종합해보면, CORM-2가 분화에 필수적인 막단백질의 발현을 저해함으로써 단핵구의 분화과정을 억제하고, 분화된 대식세포의 inflammatory cytokines의 분비와 포식 기능을 저해함으로써 활성화 과정도 억제한다는 것을 시사한다.
- CO-releasing compound인 CORM-2는 PMA로 분화를 자극한 THP-1 세포의 성장과 세포 부착능의 약한 감소를 보였고, 막표면 분화 인자인 CD14, CD11b 및 CD18의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 fluorescence-conjugated latex beads를 이용한 포식작용의 실험에서, CORM-2는 PMA 단독으로 처리한 세포에 비해 포식작용이 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다. 대식세포의 활성화에 CO의 영향을 더 알아보기 위하여, 배양중인 THP-1 세포를 PMA로 2일 동안 자극한 후 이어 4일간 배양을 하면서 완전히 분화된 대식세포를 만들었다.
- 또한, 부착한 세포와 부착하지 않은 세포 모두를 수거하여 fluorescence intensity를 flow cytometry로 측정한 결과, control 세포는 2.7%, PMA 단독 처리한 세포는 48.0%에 비해 CORM-2를 1, 10, 100μM 처리한 세포에서는 각각 43.2%, 39%, 21.2%로 감소함을 관찰할 수 있었다.
- coli의 포식작용이 현저이 감소됨을 관찰할 수 있었다. 이들 결과를 종합해보면, CORM-2가 분화에 필수적인 막단백질의 발현을 저해함으로써 단핵구의 분화과정을 억제하고, 분화된 대식세포의 inflammatory cytokines의 분비와 포식 기능을 저해함으로써 활성화 과정도 억제한다는 것을 시사한다.
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