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문제 정의
- 이러한 결과들은 견우자의 methanol 추출물이 mushroom tyrosinase 및 B16 melanoma tyrosinase 활성을 농도의존적으로 저해한다는 보고들과 일치하였다[4, 22]. 따라서 이런 결과들을 통해 견우자가 천연 미백제로서 이용될 수 있는 가능성을 확인하였다.
- 이러한 결과들은 견우자의 methanol 추출물이 AGS 위암 세포의 증식을 저해한 보고와 유사하였다[15]. 따라서, 전립선암 세포주인 PC-3 세포에 대한 성장을 저해하는 물질을 분리하여 그 특성을 조사하고자 하였다.
- 전래로부터 사용되어 온 천연물의 하나로서 나팔꽃 씨앗인 견우자는 메꽃과에 속하는 식물로서, 동의보감에서는 사하 작용 및 이뇨 작용 등에 사용되었다고 전해진다[7]. 최근 몇몇 연구자를 중심으로 견우자에 대한 연구가 진행되어 여러가지 생리활성[9, 10] 및 암세포주에 대한 항암 효과[14, 15] 등의 연구 결과가 보고되고 있으나, 견우자에 대한 연구가 미진한 상태이므로 본 연구에서는 견우자의 다양한 생리활성을 조사하고 그 중 생리활성이 가장 우수한 세포증식 저해활성을 대상으로 인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포에 항암효과를 나타내는 물질을 분리하고 그 특성을 조사하였다.
제안 방법
- cells/well의 농도로 세포 배양용 6-well plate에 분주하여 24시간 동안 안정화 시킨 후, compound PN을 다양한 농도로 처리하였다[20]. 24시간 후, PC-3 세포를 회수하여 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척하고 70% ethanol을 넣어 4℃에서 12시간 고정하고 RNase A를 처리하여 37℃에서 1시간 반응 시킨 후, DNA staining dye인 propidium iodide (PI)로 염색하여 flow cytometry (Becton Dickinson Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다.
- PC-3 세포를 1×105 cells/well의 농도로 6-well plate에 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, compound PN을 다양한 농도로 PC-3 세포에 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후, 세포를 회수한 다음 PBS로 세척하고, cell pellet을 annexin V/PI 시약을 처리하여 20분간 염색시킨 후, 염색된 세포는 flow cytometry를 이용하여 분석하였다.
- Compound PN에 의한 전립선 암세포주인 PC-3의 세포증식 저해 효과가 cell cycle에 영향을 끼치는지 확인하기 위해, compound PN을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, propidium iodide (PI)로 염색하여 flow cytometry로 cell cycle을 분석하였다(Fig. 7A). 그 결과, compound PN에 의해 sub-G1에서 arrest된 세포의 수가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
- PC-3 세포는 1×104 cells/well의 농도로 세포 배양용 48-well plate에 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후 2, 4, 6, 8 μg/ml 농도의 견우자 추출물을 처리하였다[17].
- RP-18로부터 용출된 분획물 중에서 90% methanol 분획물(640 mg)에서 암세포 증식 저해활성이 가장 높았으며, 이 분획물을 이용하여 Sephadex LH-20 column chromatography (Ø 4×80 cm)를 실시하였다.
- 견우자 추출물의 암세포주의 증식에 대한 저해활성을 확인하기 위하여, 인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포를 이용하여 세포의 성장을 측정하였다. 견우자 추출물을 전립선암 세포주인 PC-3 세포에 농도별로 처리하여 실험한 결과, PNM, PNE, PNB에서 농도 의존적으로 세포 성장에 대한 저해효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 견우자 추출물의 항산화 활성은 DPPH radical scavenging활성을 이용하여 측정하였다[17]. 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH)을 0.
- 견우자에 의한 apoptosis의 유도를 확인하기 위하여 annexin V/PI detection kit을 이용하여 PC-3 세포를 flow cytometry로 분석하였다[19]. PC-3 세포를 1×105 cells/well의 농도로 6-well plate에 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, compound PN을 다양한 농도로 PC-3 세포에 처리하여 24시간 배양하였다.
- 견우자의 부분 정제물질인 compound PN을 전립선암 세포주인 PC-3 세포에 농도별로 처리하고, 각각 24, 48시간 배양한 후 세포의 증식에 대한 저해활성을 확인하였다(Fig. 6A). 24시간 동안 배양한 세포주에서는 7.
- 그 중, 100% methanol 분획물(800 mg)에서 가장 높은 암세포의 증식 저해 활성을 보였고, 이 분획물을 이용하여 reverse phase column chromatography (RP-18)(Ø1.5 10 cm, 230-400 mesh)를 실시하였다.
- 반응이 끝난 후, 상등액을 제거하고 생성된 formazan에 DMSO 250 μl를 각각 분주하여 96-well plate로 100 μl씩 옮긴 후, VERSAMAX microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 형태 변화를 관찰하기 위하여 Olympus CKX41/31 도립 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 각 농도에 따른 세포의 형태 변화를 400배 배율로 관찰하였다.
- DPPH 시약 180 μl에 견우자 추출물을 농도별로 20 μl를 넣어 암실에서 30분간 실온에서 반응시킨 후, VERSAMAX microplate reader (Molecular Devices, Toronto, Canada)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 무첨가구는 negative control로 methanol과 증류수를 사용하였고, 효소 무첨가구는 blank로 하였다. Positive control로는 ascorbic acid를 사용하였으며 DPPH radical scavenging 활성(%) 은 다음과 같이 계산하였다.
- 여기에 pancreatic lipase 10 μl (10 mg/ml)를 첨가하고 37℃ water bath에 30분간 반응한 후, ice에서 10분간 반응을 정지하고 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 그 상층액을 96-well plate에 분주하여 VERSAMAX microplate reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 무첨가구는 negative control로 methanol과 증류수를 시료 대신 사용하였고, 효소 무첨가구는 blank로 하였다. Positive control로는 orlistat을 사용하였다.
- 암세포주 증식을 저해하는 물질을 정제하기 위하여 견우자의 methanol 추출물 5 g을 50% methanol에 현탁한 뒤, Diaion HP-20 column chromatography를 이용하여 정제를 수행하였다. 이동상 용매를 50, 80, 100% methanol로 단계적으로 증가시켜 용출하였다.
- 용매 분획을 통해 얻은 견우자 분획물을 이용하여 DPPH 소거능을 측정하였다. 견우자의 methanol 추출물(PNM), ethyl acetate 분획물(PNE), butanol 분획물(PNB), water 분획물(PNW)의 최종 농도를 100, 300, 1,000 μg/ml로 처리하여 측정 한 결과, 1,000 μg/ml 농도의 PNM, PNE, PNB, PNW에서 각각 64.
- 암세포주 증식을 저해하는 물질을 정제하기 위하여 견우자의 methanol 추출물 5 g을 50% methanol에 현탁한 뒤, Diaion HP-20 column chromatography를 이용하여 정제를 수행하였다. 이동상 용매를 50, 80, 100% methanol로 단계적으로 증가시켜 용출하였다. 그 중, 100% methanol 분획물(800 mg)에서 가장 높은 암세포의 증식 저해 활성을 보였고, 이 분획물을 이용하여 reverse phase column chromatography (RP-18)(Ø1.
- 5 10 cm, 230-400 mesh)를 실시하였다. 이동상 용매를 80, 90% methanol로 단계적으로 증가시키면서 용출하였다. RP-18로부터 용출된 분획물 중에서 90% methanol 분획물(640 mg)에서 암세포 증식 저해활성이 가장 높았으며, 이 분획물을 이용하여 Sephadex LH-20 column chromatography (Ø 4×80 cm)를 실시하였다.
- RP-18로부터 용출된 분획물 중에서 90% methanol 분획물(640 mg)에서 암세포 증식 저해활성이 가장 높았으며, 이 분획물을 이용하여 Sephadex LH-20 column chromatography (Ø 4×80 cm)를 실시하였다. 이동상으로 100% methanol을 이용하여 용출하였으며, 그 중 저해활성이 가장 높은 분획물을 모아서 compound PN (250 mg)이라 명명하고, high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 그 순도를 확인하였다(Fig. 5A, Fig. 5B). 그 결과, 여러가지의 HPLC 분석 조건에서 단일 피크를 보였으나, NMR과 같은 기기분석을 통해 유사한 구조의 물질이 혼재된 부분 정제된 상태로 분석되어 저해 물질의 정확한 구조 동정을 위해 순수분리를 위한 추가적인 정제 과정이 필요한 것으로 사료되었다(data not shown).
- 2 g)을 얻었다. 이들 용매 분획물을 정량하여 각각의 생리활성 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 견우자는 부산 한약 시장의 삼세당에서 주문하여 사용하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT), 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), pancreatic lipase, p-nitrophenyl palmitate (pNPP), mushroom tyrosinase, ascorbic acid, orlistat, kojic acid 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Annexin V/PI staining kit는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Annexin V/PI staining kit는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 견우자 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정하기 위해 mushroom tyrosinase를 이용하였다. 각 추출물의 농도에 따른 tyrosinase의 저해 활성은 PNM, PNE, PNB의 농도에 따라 tyrosinase의 저해율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 본 실험에서 사용된 견우자는 부산 한약 시장의 삼세당에서 주문하여 사용하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT), 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), pancreatic lipase, p-nitrophenyl palmitate (pNPP), mushroom tyrosinase, ascorbic acid, orlistat, kojic acid 등은 Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 모든 실험의 결과는 3번 반복 수행하여 얻어진 것으로, 통계분석은 ANOVA에 의해 분석하여 mean±S.D로 표시하였고, 통계적 유의성은 p≤0.05로 판정하였다.
성능/효과
- 견우자 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정하기 위해 mushroom tyrosinase를 이용하였다. 각 추출물의 농도에 따른 tyrosinase의 저해 활성은 PNM, PNE, PNB의 농도에 따라 tyrosinase의 저해율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 또한 PNM, PNE, PNB를 최종농도 500 μg/ml로 처리하였을 경우, 각각 27, 41, 25%의 저해율을 나타냈으며, 그 중 PNE의 저해활성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 견우자 추출물의 암세포주의 증식에 대한 저해활성을 확인하기 위하여, 인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포를 이용하여 세포의 성장을 측정하였다. 견우자 추출물을 전립선암 세포주인 PC-3 세포에 농도별로 처리하여 실험한 결과, PNM, PNE, PNB에서 농도 의존적으로 세포 성장에 대한 저해효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 특히, 최종 농도로 50, 100 μg/ml를 처리하였을 때, PNM과 PNB에서 각각 92%와 94%의 저해율을 보였다.
- 견우자의 methanol 추출물(PNM), ethyl acetate 분획물(PNE), butanol 분획물(PNB), water 분획물(PNW)의 최종 농도를 100, 300, 1,000 μg/ml로 처리하여 측정 한 결과, 1,000 μg/ml 농도의 PNM, PNE, PNB, PNW에서 각각 64.2, 80.9, 80.3, 25.8%의 free radical 소거능을 보였으며 PNM, PNE, PNB의 IC50 값은 271, 221.9, 149.3 μg/ml로 측정되었다(Fig. 1).
- 7A). 그 결과, compound PN에 의해 sub-G1에서 arrest된 세포의 수가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 annexin V/PI staining을 이용하여 apoptosis를 분석한 결과(Fig.
- 이를 통해 PNE, PNB에서 가장 높은 DPPH free radical 소거활성을 보였으며, 견우자의 분획물에 따라 비슷한 항산화 활성이 보고된 기존의 결과와 유사하였다[11]. 따라서 이러한 DPPH free radical 소거활성을 통해 견우자가 천연 항산화제로서 이용될 수 있는 가능성을 확인하였다.
- 또한 PNM, PNE, PNB를 최종농도 500 μg/ml로 처리하였을 경우, 각각 27, 41, 25%의 저해율을 나타냈으며, 그 중 PNE의 저해활성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, compound PN에 의해 sub-G1에서 arrest된 세포의 수가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 annexin V/PI staining을 이용하여 apoptosis를 분석한 결과(Fig. 7B), compound PN의 농도에 따라 apoptosis가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 compound PN이 cell cycle arrest와 apoptosis의 유도를 통하여 전립선암 세포주인 PC-3에서 세포사멸을 유도한다는 것을 확인 할 수 있었다[18, 19].
- 6 μg/ml에서 IC50 값을 나타냈다. 또한, compound PN을 PC-3 세포에 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양 시킨 후 광학 현미경으로 세포의 형태를 관찰한 결과, 무처리군에서는 세포막을 유지하고 기벽에 부착되어 세포의 정상적인 형태를 나타냈지만, compound PN 처리군에서는 농도가 증가할수록, 세포의 수가 줄어들고 점차 팽창되면서 기벽에서 떨어져 배지에 부유하고 있는 형태를 관찰할 수 있었다(Fig. 6B).
- 7B), compound PN의 농도에 따라 apoptosis가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 compound PN이 cell cycle arrest와 apoptosis의 유도를 통하여 전립선암 세포주인 PC-3에서 세포사멸을 유도한다는 것을 확인 할 수 있었다[18, 19].
- 이러한 기존의 보고를 근거로 하여 견우자 추출물의 pancreatic lipase 저해활성을 평가한 결과, 견우자의 PNM, PNE, PNB, PNW을 500 μg/ml의 최종 농도로 처리하였을 때 각각 64.6, 56.9, 52.8, 15.1%의 저해활성을 보였으며, 그 중, PNM, PNE, PNB의 저해활성이 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 특히, 최종 농도로 50, 100 μg/ml를 처리하였을 때, PNM과 PNB에서 각각 92%와 94%의 저해율을 보였다. 이를 통해 세포성장 저해 활성 물질이 PNM에서 PNB로 이동하여 강한 저해활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과들은 견우자의 methanol 추출물이 AGS 위암 세포의 증식을 저해한 보고와 유사하였다[15].
- 특히, 최종 농도로 50, 100 μg/ml를 처리하였을 때, PNM과 PNB에서 각각 92%와 94%의 저해율을 보였다.
후속연구
- 5B). 그 결과, 여러가지의 HPLC 분석 조건에서 단일 피크를 보였으나, NMR과 같은 기기분석을 통해 유사한 구조의 물질이 혼재된 부분 정제된 상태로 분석되어 저해 물질의 정확한 구조 동정을 위해 순수분리를 위한 추가적인 정제 과정이 필요한 것으로 사료되었다(data not shown).
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