인체 신경세포에서 청뇌명신환(淸腦明神丸)의 산화적 스트레스에 대한 세포보호 효과 Neuroprotective Effects of Cheongnoemyeongsin-hwan against Hydrogen Peroxide-induced DNA Damage and Apoptosis in Human Neuronal-Derived SH-SY5Y Cells원문보기
Objectives : Oxidative stress due to excessive accumulation of reactive oxygen species (ROS) is one of the risk factors for the development of several chronic diseases, including neurodegenerative diseases. Methods : In the present study, we investigated the protective effects of cheongnoemyeongsin-...
Objectives : Oxidative stress due to excessive accumulation of reactive oxygen species (ROS) is one of the risk factors for the development of several chronic diseases, including neurodegenerative diseases. Methods : In the present study, we investigated the protective effects of cheongnoemyeongsin-hwan (CNMSH) against oxidative stress‑induced cellular damage and elucidated the underlying mechanisms in neuronal-derived SH-SY5Y cells. Results : Our results revealed that treatment with CNMSH prior to hydrogen peroxide (H2O2) exposure significantly increased the SH-SY5Y cell viability, indicating that the exposure of the SH-SY5Y cells to CNMSH conferred a protective effect against oxidative stress. CNMSH also effectively attenuated H2O2‑induced comet tail formation, and decreased the phosphorylation levels of the histone ${\gamma}H2AX$, as well as the number of apoptotic bodies and Annexin V‑positive cells. In addition, CNMSH exhibited scavenging activity against intracellular ROS generation and restored the mitochondria membrane potential (MMP) loss that were induced by H2O2, suggesting that CNMSH prevents H2O2‑induced DNA damage and cell apoptosis. Moreover, H2O2 enhanced the cleavage of caspase-3 and degradation of poly (ADP-ribose)-polymerase, a typical substrate protein of activated caspase-3, as well as DNA fragmentation; however, these events were almost totally reversed by pretreatment with CNMSH. Furthermore, CNMSH increased the levels of heme oxygenase-1 (HO-1), which is a potent antioxidant enzyme, associated with the induction of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). According to our data, CNMSH is able to protect SH-SY5Y cells from H2O2-induced apoptosis throughout blocking cellular damage related to oxidative stress through a mechanism that would affect ROS elimination and activating Nrf2/HO-1 signaling pathway. Conclusions : Therefore, we believed that CNMSH may potentially serve as an agent for the treatment and prevention of neurodegenerative diseases caused by oxidative stress.
Objectives : Oxidative stress due to excessive accumulation of reactive oxygen species (ROS) is one of the risk factors for the development of several chronic diseases, including neurodegenerative diseases. Methods : In the present study, we investigated the protective effects of cheongnoemyeongsin-hwan (CNMSH) against oxidative stress‑induced cellular damage and elucidated the underlying mechanisms in neuronal-derived SH-SY5Y cells. Results : Our results revealed that treatment with CNMSH prior to hydrogen peroxide (H2O2) exposure significantly increased the SH-SY5Y cell viability, indicating that the exposure of the SH-SY5Y cells to CNMSH conferred a protective effect against oxidative stress. CNMSH also effectively attenuated H2O2‑induced comet tail formation, and decreased the phosphorylation levels of the histone ${\gamma}H2AX$, as well as the number of apoptotic bodies and Annexin V‑positive cells. In addition, CNMSH exhibited scavenging activity against intracellular ROS generation and restored the mitochondria membrane potential (MMP) loss that were induced by H2O2, suggesting that CNMSH prevents H2O2‑induced DNA damage and cell apoptosis. Moreover, H2O2 enhanced the cleavage of caspase-3 and degradation of poly (ADP-ribose)-polymerase, a typical substrate protein of activated caspase-3, as well as DNA fragmentation; however, these events were almost totally reversed by pretreatment with CNMSH. Furthermore, CNMSH increased the levels of heme oxygenase-1 (HO-1), which is a potent antioxidant enzyme, associated with the induction of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). According to our data, CNMSH is able to protect SH-SY5Y cells from H2O2-induced apoptosis throughout blocking cellular damage related to oxidative stress through a mechanism that would affect ROS elimination and activating Nrf2/HO-1 signaling pathway. Conclusions : Therefore, we believed that CNMSH may potentially serve as an agent for the treatment and prevention of neurodegenerative diseases caused by oxidative stress.
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문제 정의
澁精, 斂汗하는 효력과 正氣, 津液을 收斂하는 의미가 강하고 山藥은 性이 溫無毒하고 味는 苦甘하여 脾腎經에 歸經하여 補脾益胃, 燥濕和中하는 효능이 있어, 脾胃氣弱, 不思飮食, 倦怠少氣, 泄瀉, 痰飮 등을 치료하는데 현대인들의 위장운동의 부담을 덜어 주기 위하여 山茱萸를 山藥으로 바꾸었다. 人蔘, 肉桂, 附子는 전신 기능 활성화를 목적으로 추가하였으며, 龍眼肉, 遠志, 沈香, 龍腦 등은 뇌의 기능을 활성화하여 정신적인 스트레스로 생긴 기억력감퇴 및 치매예방을 목적으로 추가하였다. 선행연구에 의하면 청뇌명신환은 그람음성세균 표층의 peptide glycan을 둘러싸는 외막의 중요 구성성분인 지질다당류(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 BV2 미세아교세포에서 증가된 염증성 매개인자(PGE2 및 NO) 및 사이토카인(IL-1β)의 억제효과를 나타낸 바 있다20.
. 따라서 H2O2에 의한 DNA 손상 및 세포 증식 억제가 apoptosis 과정을 통하여 유발하는지를 확인하고, 이러한 과정을 청뇌명신환이 억제할 수 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 apoptosis가 일어났을 경우 관찰되는 대표적인 현상 중의 하나인 핵 내 chromatin의 응축에 따른 apoptosic body의 형성 및 flow cytometry analysis에 의한 apoptosis 유발에 대한 정량적 비교를 실시하였다.
이러한 항염증 효과는 퇴행성 뇌 질환의 중요한 원인이 되는 만성적인 신경계 염증을 억제함으로써 다양한 신경계 질환에서 신경보호역할을 할 것으로 기대되었다. 따라서 본 연구에서는 청뇌명신환의 신경 퇴행성 장애 질환극복을 위한 신경보호 효과에 대한 추가적인 자료를 제시하기 위하여 산화적 스트레스로부터 신경세포의 보호 효능 여부를 조사하였다. 이를 위하여 SH-SY5Y 신경세포를 대상으로 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였다.
. 따라서 이상에서 확인된 청뇌명신환의 산화적 스트레스에 의한 apoptosis 차단 효과가 미토콘드리아 기능 손상의 회복에 따른 것인지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 미토콘드리아 기능 손상에 따른 apoptosis 유발 과정에 동반되는 MMP의 소실 정도를 JC-1 염색에 의한 flow cytometry 분석을 통하여 조사하였다.
. 따라서 청뇌명신환의 산화적 스트레스 억제 효능과 Nrf2/HO-1 신호계의 연관성을 조사하기 위하여 청뇌명신환이 첨가된 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포의 단백질을 분리하여 Nrf2 및 HO-1의 발현 증가 여부를 조사하였다. Figure 7에 제시된 Western blot 분석의 결과에서 알 수 있듯이 청뇌명신환 처리 30분 이내에 Nrf2의 발현이 증가되기 시작하였으며, 4시간 경과 후 최고 높은 발현 경향성을 보였다.
Intrinsic apoptosis 경로의 활성을 통한 apoptosis의 유도를 위해서는 MMP의 소실과 동반된 intrinsic apoptosis 경로의 initiator caspase에 해당되는 caspase-9의 활성에 의한 effector caspase인 caspase-3 또는 caspase-7의 활성이 증가되어야 한다29,30. 따라서 청뇌명신환의 신경세포 보호 효과가 이러한 caspase cascade의 경로 차단에 의한 것인지의 여부를 조사하기 위하여 대표적인 effector caspase인 caspase-3의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. Figure 6A에 나타낸 바와 같이 H2O2가 단독 처리된 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포의 경우 비활성인 pro-caspase-3의 발현이 감소되면서 active-caspase-3의 발현이 증가되었다.
ROS의 축적은 핵산의 손상, 단백질의 산화적 변성, 세포막 지질의 과산화 등과 함께 염증성 사이토카인의 방출을 촉진시켜 조직에 손상을 일으키고 세포의 죽음을 유도한다8,9. 본 연구에서는 산화적 스트레스에 의하여 일어난 SH-SY5Y 세포의 DNA 손상에 미치는 청뇌명신환 영향을 조사하기 위하여 먼저 단일 세포 전기영동법(single cell gel electrophoresis)인 Comet assay를 실시하였다. Comet assay는 DNA 손상을 야기하는 어떤 약물 처리나 조건에서 세포가 손상되면 DNA 가닥이 절단되어 파편이 떨어져 나오는 정도를 전기영동을 이용하여 감지하는 방법이다.
이는 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상을 차단시켰음을 의미하며, 이를 재확인하기 위한 γH2AX 단백질의 인산화(p-γH2AX) 여부에 미치는 청뇌명신환의 영향을 조사하였다.
따라서 청뇌명신환이 퇴행성 뇌 질환의 중요한 원인이 되는 만성적인 신경계 염증을 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 포함한 다양한 신경계 질환에서 보호역할을 할 것으로 기대할 수 있으나 청뇌명신환의 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호 효능에 관한 실험적인 근거는 전무한 실정이다. 이에 저자는 산화적 스트레스 유발인자인 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)에 의해 자극된 신경 유래 SH-SY5Y 세포 모델을 이용하여 청뇌명신환의 항산화 효능을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하고자 한다.
전술한 결과에서 청뇌명신환이 산화적 스트레스에 노출된 SH-SY5Y 세포의 apoptosis 유발 억제 효과가 미토콘드리아 기능 보호와 연관성이 있는 것으로 확인되었기에, 이러한 현상이 청뇌명신환의 ROS 생성 직접 차단에 의한 것인지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 H2O2 처리에 의한 ROS의 생성 차단 여부를DCF-DA 염색을 통한 flow cytometry 분석을 통하여 조사하였다.
제안 방법
(A) To detect cellular DNA damage, the comet assay was performed and representative pictures of the comets were taken using a fluorescence microscope (original magnification, 200×).
30분후, 세포들을 모아 fluorescent probe 인 2′,7′-di-chlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA, Molecular Probes, Leiden, Netherlands) 10 μM로 20분간 염색하였다.
Apoptosis 유발의 또 다른 증거를 제시하기 위하여 DNA 분절화 현상의 분석을 실시하였다. 상기와 유사한 조건에서 배양된 세포들을 모은 다음 lysis buffer [5mM Tris-HCl (pH 7.
H2O2 처리에 따른 SH-SY5Y 세포의 apoptosis 유발 여부의 확인 및 청뇌명신환의 보호 효과 확인을 위하여 apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하였다. 이를 위하여 24시간 동안 적정 농도의 청뇌명신환 및 H2O2가 처리된 배지에서 배양된 세포를 모아 fixing solution (3.
H2O2 처리에 따른 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 기능 손상 및 청뇌명신환의 보호 효과 확인을 위한 MMP 값 변화 정도를 측정하기 위하여 준비된 세포들에10μM의 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′, 3,3′-tetraethylimidacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액을 처리하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다.
SH-SY5Y 세포에 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 H2O2를 처리하였으며, 선행 연구에 준하여 약 45% 정도의 증식 억제 효과를 가지는 100 μM을 24 시간 처리하였다(Figure 1B).
SH-SY5Y 신경세포에서 청뇌명신환의 항산화 효능을 조사하기 위한 처리 농도 범위를 설정하기 위해 24시간 동안 다양한 농도의 청뇌명신환을 처리한 후 MTT assay을 이용하여 세포 생존도를 조사하였다. Figure 1A에서 보이는 바와 같이, 청뇌명신환을 200∼1000 μg/ml 범위 내에서 처리하였을 경우, 600 μg/ml 처리농도까지는 세포독성을 보이지 않았고, 오히려 SH-SY5Y 세포의 증식을 부분적으로 향상시켰다.
이를 다시 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시키고 분리된 단백질이 전이된 membrane을 5% skim milk를 1 시간 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그리고 적정 1차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 over night 반응시킨 다음 PBS-T (PBS with Tween 20)로 세척하고 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 enhanced chemiluminoesence(ECL) solution (Santa Cruz Biotechnology Inc.
이러한 initiator caspase의 활성 증가는 caspase-3 및 -7과 같은 effector caspase의 활성을 유도하여 apoptosis의 완결을 위한 다양한 기질 단백질의 분해를 촉진하는 caspase cascade를 형성한다31. 따라서 H2O2 처리에 따른 SH-SY5Y 세포의 apoptosis 유발에는 mitochondria에서 ROS 생성의 증가가 원인이 되는 intrinsic apoptosis 경로가 관여할 것으로 기대되어 mitochondria 막전위 변화를 조사하였다. Figure 4에서 나타난 결과에서 알 수 있듯이 H2O2가 단독으로 처리된 SH-SY5Y 세포에서 MMP 소실의 정도가 정상 배지에서 배양된 세포의 비하여 10배 이상 증가되었으나, 청뇌명신환의 복합 처리군에서는 현저하게 감소되었다.
이를 위하여 H2O2와 청뇌명신환의 단독 또는 복합 처리된 배지에서 배양된 세포들을 대상으로 핵의 형태적 변화를 조사한 결과, H2O2가 단독으로 처리된 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포에서는 apoptosis 유발을 의미하는 DNA 응축에 따른 apoptotic body의 형성이 매우 증가하였음을 알 수 있었으나, 청뇌명신환이 동시에 처리된 조직에서 배양된 세포에서는 정상배지 및 청뇌명신환 단독 처리된 배지에서 배양된 세포에서와 같이 이러한 형태적 변형이 관찰되지 않았다(Figure 3A). 따라서 apoptosis 유발 억제에 대한 정량적 평가를 실시하기 위하여 동일 조건에서 배양된 세포들을 대상으로 annexin V-FITC와 PI 동시 염색을 실시하여 flow cytometry 분석을 실시하였다. Figure 3B의 결과에서 알 수 있듯이, H2O2가 단독으로 처리된 SH-SY5Y 세포에서의 apoptosis 유발 빈도는 정상 배지에서 배양된 세포에 비해 8배 이상 증가되었으나, 청뇌명신환의 복합 처리군에서는 apoptosis가 유발된 세포의 빈도가 현저하게 감소되어, DAPI 염색에 의한 결과를 잘 뒷받침하여 주고 있음을 알 수 있었다.
반응이 끝난 후 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리하고 flow cytometer (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 적용시켜 apoptosis가 유발된세포(V+/PI–)를 형광반응에 따라 분석하였다.
) 용액을 처리하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상층액을 제거하고 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 flow cytometer에 적용시켜 MMP의 변화를 측정하였다.
그리고 적정 1차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 over night 반응시킨 다음 PBS-T (PBS with Tween 20)로 세척하고 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 enhanced chemiluminoesence(ECL) solution (Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz, CA, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 본 실험에서 단백질 분석을 위하여 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.
. 본 연구에서 H2O2 처리에 의한 apoptosis의 재확인과 DNA의분절화에 미치는 청뇌명신환의 영향을 agarose gel 전기영동으로 조사하였다. Figure 6B의 결과에서 알 수 있듯이 H2O2는 SH-SY5Y 세포의 DNA 분절화를 효과적으로 유도하였다.
산화적 DNA 손상의 정도를 측정하는 방법으로 comet assay를 위하여, 준비된 세포들을 37°C 조건에서 0.5%의 low melting agarose와 혼합하고, 1%의 normal melting agarose (NMA)로 coating된 microscopic slide에 도말하였다.
5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1%Nonidet-P40 (NP-40), 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 1시간 이상 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 상층액에 있는 단백질을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemilni sample buffer(Bio-Rad, Herculs, CA, USA)와 혼합하여 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 이를 다시 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시키고 분리된 단백질이 전이된 membrane을 5% skim milk를 1 시간 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다.
세포 내 ROS 생성 변화를 확인하기 위하여 SH-SY5Y 세포에 100 μM의 H2O2를 단독으로 처리하거나, 600 μg/ml의 청뇌명신환 1 시간 전처리 후 H2O2를 재처리하였다.
조건 하에서 배양하였다. 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 매 48시간마다 0.05% trypsin/ethylene-diaminetetracetic acid(EDTA)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 적정수의 세포를 유지하였다.
약 40 분후, negatively charged된 DNA를 agarose gel에서 양극으로 이동할 수 있도록 25°C에서 20분간 300 mA, 25 V로 전기영동을 실시하였다.
) 용액으로 염색을 하였다. 염색 후, 형광현미경(fluorescene microscope, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 DNA 손상의 여부를 관찰하였다21.
) 용액으로 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 형광 현미경을 이용하여 400배의 배율로 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.
반응이 끝난 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 단일세포로 분리하였다. 이렇게 준비된 세포를 flow cytometer에 적용시켜 ROS 값의 변화를 분석하였다.
처리에 따른 SH-SY5Y 세포의 apoptosis 유발 여부의 확인 및 청뇌명신환의 보호 효과 확인을 위하여 apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하였다. 이를 위하여 24시간 동안 적정 농도의 청뇌명신환 및 H2O2가 처리된 배지에서 배양된 세포를 모아 fixing solution (3.7% formaldehyde in PBS)을 상온에서 10분 동안 처리하였다. 고정이 끝난 후 slide glass에 세포를 부착시키고 0.
전술한 결과에서 청뇌명신환이 산화적 스트레스에 노출된 SH-SY5Y 세포의 apoptosis 유발 억제 효과가 미토콘드리아 기능 보호와 연관성이 있는 것으로 확인되었기에, 이러한 현상이 청뇌명신환의 ROS 생성 직접 차단에 의한 것인지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 H2O2 처리에 의한 ROS의 생성 차단 여부를DCF-DA 염색을 통한 flow cytometry 분석을 통하여 조사하였다. Figure 5에 나타낸 바와 같이, 100 μM의 H2O2가 30분 동안 처리된 SH-SY5Y 세포에서 ROS의 생성이 정상배지에서 배양된 세포에 비하여 약 7.
따라서 본 연구에서는 청뇌명신환의 신경 퇴행성 장애 질환극복을 위한 신경보호 효과에 대한 추가적인 자료를 제시하기 위하여 산화적 스트레스로부터 신경세포의 보호 효능 여부를 조사하였다. 이를 위하여 SH-SY5Y 신경세포를 대상으로 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였다. 본 연구의 결과에 의하면 청뇌명신환은 세포독성을 보이는 않는 범위의 농도 조건에서 H2O2 처리에 의하여 억제되었던 SH-SY5Y 세포의 증식을 유의적으로 회복시켰으며, 이는 H2O2 처리에 의해 유도된 DNA 손상과 apoptosis 억제에 의한 것임을 알 수 있었다.
따라서 H2O2에 의한 DNA 손상 및 세포 증식 억제가 apoptosis 과정을 통하여 유발하는지를 확인하고, 이러한 과정을 청뇌명신환이 억제할 수 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 apoptosis가 일어났을 경우 관찰되는 대표적인 현상 중의 하나인 핵 내 chromatin의 응축에 따른 apoptosic body의 형성 및 flow cytometry analysis에 의한 apoptosis 유발에 대한 정량적 비교를 실시하였다. 먼저 DAPI 용액에 의한 SH-SY5Y 세포 핵의 형태적 변화 관찰 결과에 의하면, H2O2 단독 처리군에서는 전형적인 apoptosis 유발 과정에서 관찰되는 형태적 변이가 동반되었음을 알 수 있었고, 이러한 apoptosis 유발을 대변하는 핵의 형태적 변화가 청뇌명신환의 전처리군에서는 거의 관찰되지 않았다(Figure 3A).
따라서 이상에서 확인된 청뇌명신환의 산화적 스트레스에 의한 apoptosis 차단 효과가 미토콘드리아 기능 손상의 회복에 따른 것인지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 미토콘드리아 기능 손상에 따른 apoptosis 유발 과정에 동반되는 MMP의 소실 정도를 JC-1 염색에 의한 flow cytometry 분석을 통하여 조사하였다. Figure 4의 결과에서 알 수 있듯이, H2O2 단독 처리군에서 MMP 소실 정도는 약 58.
이를 위하여 세포 배양용 6 well plate에 1×105 cells/ml로 SH-SY5Y 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후 적정 농도의 청뇌명신환 및 H2O2 (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 단독 또는 복합 처리하였다.
Apoptosis에 의한 세포의 죽음은 세포의 위축(cell shrinkage)이나 DNA 응축(DNA condensation)과 같은 형태적 변화의 동반을 특징적으로 가지고 있으며, 이러한 현상은 염색체 DNA (chromosomal DNA)의 분해를 유발하여 궁극적으로 세포의 죽음을 유도한다. 청뇌명신환의 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상의 차단에 따른 세포증식율의 회복이 apoptosis 유발 억제와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 핵 DNA에 특이적으로 염색되는 형광물질인 DAPI 용액을 이용한 형광 현미경적 세포 형태 비교를 실시하였다. 이를 위하여 H2O2와 청뇌명신환의 단독 또는 복합 처리된 배지에서 배양된 세포들을 대상으로 핵의 형태적 변화를 조사한 결과, H2O2가 단독으로 처리된 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포에서는 apoptosis 유발을 의미하는 DNA 응축에 따른 apoptotic body의 형성이 매우 증가하였음을 알 수 있었으나, 청뇌명신환이 동시에 처리된 조직에서 배양된 세포에서는 정상배지 및 청뇌명신환 단독 처리된 배지에서 배양된 세포에서와 같이 이러한 형태적 변형이 관찰되지 않았다(Figure 3A).
청뇌명신환이 이러한 산화적 스트레스에 의해 억제된 세포 증식의 회복 능력을 가지는지의 여부를 조사하기 위하여 100 μM의 H2O2를 처리하기 1시간 전에 세포독성을 보이지 않았던 범위의 농도(200~600 μg/ml)를 처리한 후 24시간 추가 배양하고 MTT assay를 실시하였다.
최근 고령화에 따른 급속한 증가 추세를 보이는 신경 퇴행성 장애 질환의 예방 및 치료를 위한 한약 복합 처방전 개발의 일환으로 신경세포 모델을 이용하여 청뇌명신환의 항산화 효능을 평가하였다. 본 연구에 사용된 청뇌명신환은 동의대학교 부속 한방병원 신계 내과에서 기억력 증진 및 치매 예방을 위한 목적으로 개발된 환약이다.
)과 5 M NaCl을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 원심 분리시켜 DNA pellet을 추출하였다. 추출된 DNA pellet에 RNase A가 포함된 TE buffer 및 6X gel loading dye(Bioneer, Daejeon, Korea)를 첨가하고 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V로 전기영동 시킨 후 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 염색하여 DNA 단편화 현상을 확인하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 신경 유래 SH-SY5Y 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 세포의 배양을 위해 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 및 1%의 penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지를 사용하였고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
본 실험에 사용된 청뇌명신환(淸腦明神丸, CheongNoiMyungShinHwan, CNMSH)은 人蔘(Ginseng Radix Alba), 當歸(Angelicae Gigantis Radix) 山藥(Dioscoreae Rhizoma)과 龍眼肉(Longan Arillus)을 각 24 g, 肉桂(Cinnamomi Cortex) 12 g, 遠志(Polygalae Radix) 6 g, 麝香(Moschus)과 沈香(Aquilariae Lignum) 각 1 g, 龍腦(Borneolum, 중국) 0.2 g, 이상을 세말한 후, 여기에 鹿茸(cornus cervi parvum) 24 g과 附子(Aconiti Lateralis Radix Preparata) 6 g을 5 시간 정도 끊인 膠 24g을 추가한 후, 꿀 160 g으로 구성된 총 300.2g의 환약을 4g 씩 오자대 크기로 75개를 만들고, 이를 금박으로 제조한 후, 그 중 무작위로 5환을 선정하였다. 이를 멸균된 3차 증류수를 이용하여 분쇄하여 용해시켜 100 mg/ml의 농도로 만든 다음 0.
危亦林의 醫書인 『世醫得效方』에 최초로 언급된 拱辰丹은 『東醫寶鑑 雜病篇』에 虛勞에서는 타고난 원기를 든든히 하여 五藏自和, 百病不生하게 하는 목적으로 拱辰丹을 쓴다고 하였다. 본 환은 拱辰丹의 麝香, 鹿茸, 當歸 등을 주재로 하였으며, 拱辰丹의 山茱萸를 山藥으로 바꾸었고, 龍眼肉, 遠志, 人蔘, 肉桂, 附子, 沈香, 龍 腦를 추가하여 구성되어져 있다. 현대인의 정신적인 과로로 인한 허로와 이로 인한 기억력감퇴와 치매예방을 위해 몇 가지 약을 가미하여 저자가 임상에서 사용 중인 경험방이다.
데이터처리
다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean ± standard error (SD)로 기록하였고, OriginLab Version 9.1(OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)의 one way analysis of variance를 이용하여 통계적 유의성을 검증하였다.
이론/모형
Cells were treated with various concentrations (200~1000 μg/ml) of CNMSH for 24 h (A) or pretreated with the indicated concentrations (200~600 μg/ml) of CNMSH for 1 h and then incubated with or without 100 μM H2O2 for 24 h (B). Cell viability was assessed using an MTT reduction assay. The results are the mean ± SD values obtained in three independent experiments(*, P < 0.
청뇌명신환 및 H2O2 처리에 따른 SH-SY5Y 세포의 증식 변화 정도를 확인하기 위하여 3-(4,5-dimethyl-2thiazolyl)-2, 5-diphnyl-2H-tetrazolium bromide(MTT) assay를 이용하였다. 이를 위하여 세포 배양용 6 well plate에 1×105 cells/ml로 SH-SY5Y 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후 적정 농도의 청뇌명신환 및 H2O2 (Sigma-Aldrich Chemical Co.
청뇌명신환에 의한 SH-SY5Y 세포의 산화적 스트레스에 의한 보효 효과가 DNA 손상 차단효과와 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 Comet assay 및 Western blot analysis를 실시하였다. 이를 위하여 SH-SY5Y 세포에 100 μM의 H2O2를 처리하기 1시간 전에 600 μg/ml의 청뇌명신환을 처리하고 24 시간 동안 배양하였다.
성능/효과
따라서 apoptosis 유발 억제에 대한 정량적 평가를 실시하기 위하여 동일 조건에서 배양된 세포들을 대상으로 annexin V-FITC와 PI 동시 염색을 실시하여 flow cytometry 분석을 실시하였다. Figure 3B의 결과에서 알 수 있듯이, H2O2가 단독으로 처리된 SH-SY5Y 세포에서의 apoptosis 유발 빈도는 정상 배지에서 배양된 세포에 비해 8배 이상 증가되었으나, 청뇌명신환의 복합 처리군에서는 apoptosis가 유발된 세포의 빈도가 현저하게 감소되어, DAPI 염색에 의한 결과를 잘 뒷받침하여 주고 있음을 알 수 있었다. 따라서 청뇌명신환의 산화적 스트레스 보호 효과는 DNA 손상 차단에 따른 apoptosis 유도억제에 의하여 나타난 현상임을 알 수 있었다.
이를 위하여 미토콘드리아 기능 손상에 따른 apoptosis 유발 과정에 동반되는 MMP의 소실 정도를 JC-1 염색에 의한 flow cytometry 분석을 통하여 조사하였다. Figure 4의 결과에서 알 수 있듯이, H2O2 단독 처리군에서 MMP 소실 정도는 약 58.92% 정도로 관찰되었으며, 청뇌명신환이 전처리된 SH-SY5Y 세포에서는 22.62%로 나타나 MMP의 소실을 효과적으로 억제하였음을 확인하였다. 이는 청뇌명신환이 산화적 스트레스에 의한 SH-SY5Y 세포의 apoptosis 억제 효능이 미토콘드리아 기능 손상의 방어와 연관이 있음을 의미하는 결과이다.
Figure 6A에 나타낸 바와 같이 H2O2가 단독 처리된 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포의 경우 비활성인 pro-caspase-3의 발현이 감소되면서 active-caspase-3의 발현이 증가되었다. 그러나 청뇌명신환이 전처리된 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포의 경우의 H2O2에 의하여 증가한 active-caspase-3의 발현의 청뇌명신환 처리농도의 증가에 따라 감소되었으며, pro-caspase-3의 발현도 정상 배지에서 배양된 세포수준으로 회복되었음을 알 수 있었다.
그러나 청뇌명신환이 전처리된 조건에서 H2O2가 처리된 세포에서는 H2O2 단독 처리군에 비하여 약 60% 정도의 ROS 생성억제 효능을 나타내었다. 따라서 H2O2 처리에 의한 청뇌명신환의 미토콘드리아 기능 보호에 따른 apoptosis 유발 억제는 ROS 생성의 차단과 연관성이 있음을 알 수 있었다.
Figure 3B의 결과에서 알 수 있듯이, H2O2가 단독으로 처리된 SH-SY5Y 세포에서의 apoptosis 유발 빈도는 정상 배지에서 배양된 세포에 비해 8배 이상 증가되었으나, 청뇌명신환의 복합 처리군에서는 apoptosis가 유발된 세포의 빈도가 현저하게 감소되어, DAPI 염색에 의한 결과를 잘 뒷받침하여 주고 있음을 알 수 있었다. 따라서 청뇌명신환의 산화적 스트레스 보호 효과는 DNA 손상 차단에 따른 apoptosis 유도억제에 의하여 나타난 현상임을 알 수 있었다.
이를 위하여 apoptosis가 일어났을 경우 관찰되는 대표적인 현상 중의 하나인 핵 내 chromatin의 응축에 따른 apoptosic body의 형성 및 flow cytometry analysis에 의한 apoptosis 유발에 대한 정량적 비교를 실시하였다. 먼저 DAPI 용액에 의한 SH-SY5Y 세포 핵의 형태적 변화 관찰 결과에 의하면, H2O2 단독 처리군에서는 전형적인 apoptosis 유발 과정에서 관찰되는 형태적 변이가 동반되었음을 알 수 있었고, 이러한 apoptosis 유발을 대변하는 핵의 형태적 변화가 청뇌명신환의 전처리군에서는 거의 관찰되지 않았다(Figure 3A). 이러한 청뇌명신환의 apoptosis 억제 효능을 정량적으로 분석하기 위하여 annexin V-FITC/PI 염색을 이용한 flow cytometry 분석을 실시한 결과, H2O2만 처리된 배지에서 24 시간 동안 배양된 SH-SY5Y 세포에서는 약 34.
따라서 Nrf2의 활성화를 통한 HO-1 발현 증대는 세포내 항산화방어를 위한 중요한 신호 기전으로 인식되어지고 있다13,16. 본 연구에서 관찰된 청뇌명신환의 산화적 스트레스에 대한 강력한 방어 작용이 이러한 Nrf2/HO-1 신호 전달계의 활성과 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 청뇌명신환이 처리된 SH-SY5Y 세포를 대상으로 Nrf2 및 HO-1의 발현 정도를 조사한 결과, 청뇌명신환은 HO-1의 발현 뿐 만 아니라 Nrf2의 발현도 매우 촉진시켰음을 확인할 수 있었다(Figure 7). 특히 두 단백질의 발현의 시간적차리를 비교할 경우, Nrf2의 발현이 우선적으로 유도되었으며, 뒤이어 HO-1의 발현이 증가되어 Nrf2 의존적 HO-1 발현의 증가 가능성이 매우 높을 것으로 추정된다.
본 연구의 결과에 의하면 H2O2가 단독 처리된 SH-SY5Y 세포에 γH2AX 단백질 전체에 대한 발현 변화는 없었으나 인산화된 단백질 band가 매우 증가하였으며(Figure 2B), 정상 배지 또는 청뇌명신환을 단독으로 처리한 배지에서 인산화된 γH2AX의 발현이 검출되지 않았다.
이를 위하여 SH-SY5Y 신경세포를 대상으로 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였다. 본 연구의 결과에 의하면 청뇌명신환은 세포독성을 보이는 않는 범위의 농도 조건에서 H2O2 처리에 의하여 억제되었던 SH-SY5Y 세포의 증식을 유의적으로 회복시켰으며, 이는 H2O2 처리에 의해 유도된 DNA 손상과 apoptosis 억제에 의한 것임을 알 수 있었다. 아울러 청뇌명신환은 SH-SY5Y 세포에서 H2O2 의 처리에 의해 증가된 ROS의 생성을 억제하였으며, 이는 미토콘드리아 기능 활성을 회복과 연관성이 있었다.
아울러 청뇌명신환 단독 처리군에서의 apoptosis 유발 빈도(V+/PI– 빈도)는 대조군의 수준(4.26%)과 유사하였으며(4.60%), 청뇌명신환이동시 처리된 세포에서 apoptosis 유발 빈도는 7.70% 정도로 나타나 청뇌명신환이 H2O2에 의한 apoptosis 유발을 효과적으로 차단하였음을 알 수 있었다(Figure 3B).
Figure 6에 제시한 결과에서 알 수 있듯이 청뇌명신환은 SH-SY5Y 세포에서 H2O2 처리에 의해 유도된 caspase-3의 활성을 억제하였을 뿐만 아니라 PARP의 단편화 및 DNA 분절화를 효과적으로 차단하였다. 이는 산화적 스트레스에 의한 SH-SY5Y 세포의 intrinsic apoptosis 유도 활성 경로27,28를 청뇌명신환이 억제함으로서 세포사멸로부터 보호 효과가 있음을 보여주는 결과이다.
또한 H2O2 처리에 의하여 증가된 ROS의 생성이 청뇌명신환에 의하여 매우 감소되었다(Figure 5). 이러한 결과는 H2O2가 처리된 SH-SY5Y 세포에서 ROS생성에 의한 미토콘드리아 기능 소실을 청뇌명신환이 차단함으로서 intrinsic apoptosis 경로 활성을 억제하여 세포의 생존을 증대시킨 것으로 해석할 수 있다.
먼저 DAPI 용액에 의한 SH-SY5Y 세포 핵의 형태적 변화 관찰 결과에 의하면, H2O2 단독 처리군에서는 전형적인 apoptosis 유발 과정에서 관찰되는 형태적 변이가 동반되었음을 알 수 있었고, 이러한 apoptosis 유발을 대변하는 핵의 형태적 변화가 청뇌명신환의 전처리군에서는 거의 관찰되지 않았다(Figure 3A). 이러한 청뇌명신환의 apoptosis 억제 효능을 정량적으로 분석하기 위하여 annexin V-FITC/PI 염색을 이용한 flow cytometry 분석을 실시한 결과, H2O2만 처리된 배지에서 24 시간 동안 배양된 SH-SY5Y 세포에서는 약 34.60%에 해당되는 세포에서 apoptosis가 유발되었음을 확인하였다. 아울러 청뇌명신환 단독 처리군에서의 apoptosis 유발 빈도(V+/PI– 빈도)는 대조군의 수준(4.
그러나 H2O2와 청뇌명신환이 동시에 처리된 조건에서 배양된 세포에서도 γH2AX 단백질의 인산화가 검출되지 않았다. 이러한 현상은 Comet assay에서 관찰된 결과인 산화적 스트레스로부터의 DNA 손상을 청뇌명신환이 차단하였다는 결과와 잘 일치되었다. 따라서 Figure 1B에서 관찰된 청뇌명신환의 산화적 스트레스에 의한 SH-SY5Y 세포 증식의 억제 차단 효과는 DNA 손상 보호 효과에 따른 결과임을 알 수 있었다.
청뇌명신환의 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상의 차단에 따른 세포증식율의 회복이 apoptosis 유발 억제와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 핵 DNA에 특이적으로 염색되는 형광물질인 DAPI 용액을 이용한 형광 현미경적 세포 형태 비교를 실시하였다. 이를 위하여 H2O2와 청뇌명신환의 단독 또는 복합 처리된 배지에서 배양된 세포들을 대상으로 핵의 형태적 변화를 조사한 결과, H2O2가 단독으로 처리된 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포에서는 apoptosis 유발을 의미하는 DNA 응축에 따른 apoptotic body의 형성이 매우 증가하였음을 알 수 있었으나, 청뇌명신환이 동시에 처리된 조직에서 배양된 세포에서는 정상배지 및 청뇌명신환 단독 처리된 배지에서 배양된 세포에서와 같이 이러한 형태적 변형이 관찰되지 않았다(Figure 3A). 따라서 apoptosis 유발 억제에 대한 정량적 평가를 실시하기 위하여 동일 조건에서 배양된 세포들을 대상으로 annexin V-FITC와 PI 동시 염색을 실시하여 flow cytometry 분석을 실시하였다.
이상의 연구결과를 요약해 보면 청뇌명신환은 산화적 스트레스에 의한 SH-SY5Y 신경세포에서의 ROS 생성을 차단함으로서 이와 연계된 미토콘드리아의 기능 손상을 억제하였음을 알 수 있었으며, 이러한 항산화 효능이 미토콘드리아가 매개된 intrinsic apoptosis를 효과적으로 차단하였음을 의미한다. 아울러 청뇌명신환에 의한 Nrf2/HO-1 신호계의 활성은 청뇌명신환 자체가 신경세포의 내재적 항산화 시스템을 강화시켜 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 것으로 추정된다.
본 연구에서 관찰된 청뇌명신환의 산화적 스트레스에 대한 강력한 방어 작용이 이러한 Nrf2/HO-1 신호 전달계의 활성과 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 청뇌명신환이 처리된 SH-SY5Y 세포를 대상으로 Nrf2 및 HO-1의 발현 정도를 조사한 결과, 청뇌명신환은 HO-1의 발현 뿐 만 아니라 Nrf2의 발현도 매우 촉진시켰음을 확인할 수 있었다(Figure 7). 특히 두 단백질의 발현의 시간적차리를 비교할 경우, Nrf2의 발현이 우선적으로 유도되었으며, 뒤이어 HO-1의 발현이 증가되어 Nrf2 의존적 HO-1 발현의 증가 가능성이 매우 높을 것으로 추정된다. 아울러 청뇌명신환의 항산화 효능은 아마도Nrf2/HO-1 신호 경로의 활성화가 최소한 관여할 것으로 생각되며 이에 관한 후속 연구가 이루어져야 할 것이다.
후속연구
아울러 청뇌명신환에 의한 Nrf2/HO-1 신호계의 활성은 청뇌명신환 자체가 신경세포의 내재적 항산화 시스템을 강화시켜 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 것으로 추정된다. 따라서 청뇌명신환의 신경세포에 대한 항산화효능은 퇴행성 뇌질환의 중요한 원인이 되는 만성적인산화적 스트레스를 억제함으로써 신경 퇴행성 장애 질환을 포함한 다양한 신경계 질환의 예방 또는 개선 효과가 있을 것으로 기대된다.
특히 두 단백질의 발현의 시간적차리를 비교할 경우, Nrf2의 발현이 우선적으로 유도되었으며, 뒤이어 HO-1의 발현이 증가되어 Nrf2 의존적 HO-1 발현의 증가 가능성이 매우 높을 것으로 추정된다. 아울러 청뇌명신환의 항산화 효능은 아마도Nrf2/HO-1 신호 경로의 활성화가 최소한 관여할 것으로 생각되며 이에 관한 후속 연구가 이루어져야 할 것이다.
이는 세포 내 주요 신호 전달계인 nuclear factor-kappa (NF-κB), mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 및 phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/Akt 신호계의 조절을 통하여 이루어지고 있음을 보고한 바 있다. 이러한 항염증 효과는 퇴행성 뇌 질환의 중요한 원인이 되는 만성적인 신경계 염증을 억제함으로써 다양한 신경계 질환에서 신경보호역할을 할 것으로 기대되었다. 따라서 본 연구에서는 청뇌명신환의 신경 퇴행성 장애 질환극복을 위한 신경보호 효과에 대한 추가적인 자료를 제시하기 위하여 산화적 스트레스로부터 신경세포의 보호 효능 여부를 조사하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
HO-1의 전사활성을 조절하여 세포를 보호하는 대표적 유전자는?
한편 heme oxygenase-1 (이하 HO-1)은 산화적 손상으로 세포 보호효과를 가지는 효소로 heme의 산화를 유도하여 biliverdin, free iron 및 carbon monoxide로 분해시키며, biliverdin은 biliverdin reductase에 의해서 bilirubin으로 변환되는데 이러한 HO-1의 직접적 또는 대사산물에 의해 ROS를 소거하여 항산화 효과를 가지는 것으로 알려져 있다11,12. 그리고 HO-1의 전사활성을 조절하는 대표적인 유전자는 nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (이하 Nrf2)로서 산화적 스트레스에서 세포를 보호하는 강력한 조절자로 작용한다13,14. 일반적인 상황에서 Nrf2는 Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)라 불리는 Nrf2 억제 단백질과 결합된 채로 세포질에 존재한다.
활성 산소종(ROS)이란?
따라서 신경세포에서 산화적 스트레스를 경감시키고 신경 퇴행성 장애 질환을 보호할 수 있는 항산화제의 발굴이 절실히 요구되고 있다. ROS는 정상 세포의 호흡과정에서 발생하는 미토콘드리아 부산물로서 하나 또는 그 이상의 배우자가 없는 산소 원자를 함유하는 고반응 분자들의 집단이다6,7. 산화적 스트레스는 ROS의 생성과 항산화적 방어(antioxidant defenses) 능력 사이의 불균형에서 비롯된다.
급성 및 만성적 신경 퇴행성 장애 질환의 예방과 치료에 산화 방지가 중요한 이유는?
비록 신경 퇴행성 장애 질환의 원인이 명확하게 규명된 것은 아니지만, 최근 많은 연구들에서 활성 산소종(reactive oxygen substances, 이하 ROS)의 생성 증가로 대별되는 산화적 스트레스(oxidative stress)가 가장 중요한 신경독성 요인으로 인식되고 있다. 그러므로 산화 방지 전략(antioxidant strategy)은 급성 및 만성적 신경 퇴행성 장애 질환의 예방과 치료에 매우 중요한 접근 방법으로 대두되고 있다4,5.
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