우리가 예상했던 DPNs의 지름은 약 500 nm였으며 이는 SEM과 AFM 영상, Size Distribution을 통해 기대했던 것과 유사한 크기를 가진다는 것을 확인하였다. 또한, Zeta potential은 약 $-17.8{\pm}4.4mV$으로 측정되었다. Zeta potential이 +30 mV이상이면 강한 양성을 띤다고 한다. 나노 입자의 Zeta potential이 강한 양성이면 nonspecific cellular interaction이 높아지지만 간에 의해 쉽게 제거되며, hemolytic activity가 높아지기 때문에 약물 전달을 하기에 적합하지 않은 것으로 알려져 있다. 또한 강한 음성이어도 간에 의해 제거될 확률이 높아진다. 하지만 나노 입자의 Zeta potential이 중성이거나 약한 전하를 띠면 혈액에서 제거가 잘 되지 않아 혈액에 오랫동안 남을 수 있어 약물전달에 유리하고, 약 -15 mV의 전하를 띤 입자는 tumor site에 high accumulation됨이 알려져 있다[14]. DPNs의 경우 $-17.8{\pm}4.4mV$이므로 인체에 적용하기에 적합한 것으로 판단된다. DPNs의 Encapsulation Efficiency는 약 $43.8{\pm}6.6%$로 Nano-precipitation과 같은 Bottom-up 방식보다 낮은 수치를 나타내었지만, 독성이 강한 Salinomycin을 사용함으로써 이를 해결할 수 있을 것으로 생각되며 적은 양의 약물만으로 항암효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 암세포와 함께 배양했을 때 형광 현미경으로 확인해본 결과 암세포 주변에 나노 입자가 이동한 것으로 보아 Targeting ligand나 Peptide, Aptamer를 이용하면 더욱 정확한 암세포 표적화를 이룰 수 있을 것으로 예상된다[15]. DPNs의 Drug Carrier로서의 평가는 Loading Amount와 Drug Releasing Profile을 통해 추가로 검증을 할 예정이며, Cell viability를 실행하여 DPNs의 In vitro 항암 효과를 확인하고 In vivo 실험을 진행할 예정이다.
우리가 예상했던 DPNs의 지름은 약 500 nm였으며 이는 SEM과 AFM 영상, Size Distribution을 통해 기대했던 것과 유사한 크기를 가진다는 것을 확인하였다. 또한, Zeta potential은 약 $-17.8{\pm}4.4mV$으로 측정되었다. Zeta potential이 +30 mV이상이면 강한 양성을 띤다고 한다. 나노 입자의 Zeta potential이 강한 양성이면 nonspecific cellular interaction이 높아지지만 간에 의해 쉽게 제거되며, hemolytic activity가 높아지기 때문에 약물 전달을 하기에 적합하지 않은 것으로 알려져 있다. 또한 강한 음성이어도 간에 의해 제거될 확률이 높아진다. 하지만 나노 입자의 Zeta potential이 중성이거나 약한 전하를 띠면 혈액에서 제거가 잘 되지 않아 혈액에 오랫동안 남을 수 있어 약물전달에 유리하고, 약 -15 mV의 전하를 띤 입자는 tumor site에 high accumulation됨이 알려져 있다[14]. DPNs의 경우 $-17.8{\pm}4.4mV$이므로 인체에 적용하기에 적합한 것으로 판단된다. DPNs의 Encapsulation Efficiency는 약 $43.8{\pm}6.6%$로 Nano-precipitation과 같은 Bottom-up 방식보다 낮은 수치를 나타내었지만, 독성이 강한 Salinomycin을 사용함으로써 이를 해결할 수 있을 것으로 생각되며 적은 양의 약물만으로 항암효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 암세포와 함께 배양했을 때 형광 현미경으로 확인해본 결과 암세포 주변에 나노 입자가 이동한 것으로 보아 Targeting ligand나 Peptide, Aptamer를 이용하면 더욱 정확한 암세포 표적화를 이룰 수 있을 것으로 예상된다[15]. DPNs의 Drug Carrier로서의 평가는 Loading Amount와 Drug Releasing Profile을 통해 추가로 검증을 할 예정이며, Cell viability를 실행하여 DPNs의 In vitro 항암 효과를 확인하고 In vivo 실험을 진행할 예정이다.
Chemotherapy, radiation therapy, and surgery are major methods to treat cancer. However, current cancer treatments report severe side effects and high recurrences. Recent studies about engineering nanoparticles as a drug carrier suggest possibilities in terms of specific targeting and spatiotemporal...
Chemotherapy, radiation therapy, and surgery are major methods to treat cancer. However, current cancer treatments report severe side effects and high recurrences. Recent studies about engineering nanoparticles as a drug carrier suggest possibilities in terms of specific targeting and spatiotemporal release of drugs. While many nanoparticles demonstrate lower toxicity and better targeting results than free drugs, they still need to improve their performance dramatically in terms of targeting accuracy, immune responses, and non-specific accumulation at organs. One possible way to overcome the challenges is to make precisely controlled nanoparticles with respect to size, shape, surface properties, and mechanical stiffness. Here, we demonstrate $500{\times}200nm$ discoidal polymeric nanoconstructs (DPNs) as a drug delivery carrier. DPNs were prepared by using a top-down fabrication method that we previously reported to control shape as well as size. Moreover, DPNs have multiple payloads, poly lactic-co-glycolic acid (PLGA), polyethylene glycol (PEG), lipid-Rhodamine B dye (RhB) and Salinomycin. In this study, we demonstrated a potential of DPNs as a drug carrier to treat cancer.
Chemotherapy, radiation therapy, and surgery are major methods to treat cancer. However, current cancer treatments report severe side effects and high recurrences. Recent studies about engineering nanoparticles as a drug carrier suggest possibilities in terms of specific targeting and spatiotemporal release of drugs. While many nanoparticles demonstrate lower toxicity and better targeting results than free drugs, they still need to improve their performance dramatically in terms of targeting accuracy, immune responses, and non-specific accumulation at organs. One possible way to overcome the challenges is to make precisely controlled nanoparticles with respect to size, shape, surface properties, and mechanical stiffness. Here, we demonstrate $500{\times}200nm$ discoidal polymeric nanoconstructs (DPNs) as a drug delivery carrier. DPNs were prepared by using a top-down fabrication method that we previously reported to control shape as well as size. Moreover, DPNs have multiple payloads, poly lactic-co-glycolic acid (PLGA), polyethylene glycol (PEG), lipid-Rhodamine B dye (RhB) and Salinomycin. In this study, we demonstrated a potential of DPNs as a drug carrier to treat cancer.
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제안 방법
DPNs의 Hydrodynamic diameter와 Zeta potential은 Zetasizer Nano (Malvern)로 측정하였다. DPNs가 분산되어있는 Colloid 상태의 수용액을 Bath type sonicator를 이용해 DPNs를 단일 입자로 만들어주고 측정하였다. 또한 Multisizer 4e (Beckman Coulter)를 통해 DPNs의 size distribution을 확인하였다.
이에 본 연구는 디스크 모양의(지름 500 nm, 높이 200nm) 나노 입자를 Top-down 방식으로 생산하고 약물 운반체로서 평가하기 위해 항암제인 Salinomycin을 나노 입자에 적재하였다. 또한 해당 생산 공정으로 만들어진 입자가 암세포 Squamous Cell Carcinoma 7 (SCC7)에서 작용하는 방식을 연구하였다.
다른 연구에서는PLGA를 이용한 나노 입자에 Salinomycin을 적재하였을 경우 90%까지 방출하는데 350시간 이상이 소요되는 것으로 보고되었다[11-13]. 실제로 Salinomycin에 대한 MCF7 cell viability 실험을 통해 Salinomycin의 세포 독성과 방출량을 알아보았다. DMEM 100 µl에 Free drug 0.
이에 본 연구는 디스크 모양의(지름 500 nm, 높이 200nm) 나노 입자를 Top-down 방식으로 생산하고 약물 운반체로서 평가하기 위해 항암제인 Salinomycin을 나노 입자에 적재하였다. 또한 해당 생산 공정으로 만들어진 입자가 암세포 Squamous Cell Carcinoma 7 (SCC7)에서 작용하는 방식을 연구하였다.
기존에 보고된 나노 임프린트 리소그래피(Nanoimprint Lithography) 공정으로 디스크 나노 입자를 생산하였다[7-9]. Master Silicon template의 지름 500 nm, 높이 200nm의 디스크 모양 구멍은 Electron beam lithography 방식으로 제작되었다.
사용한 세포는 SCC7 cell line으로 편평상피암 세포종이며, Green fluorescent protein (GFP, 녹색 형광 단백질)를 포함하고 있으며, 본 Cell line은 한국과학기술원(KIST)으로부터 기부되었다. 사용된 형광 현미경은 Eclipse Ti-U(Nikon)이었다.
데이터처리
DPNs의 영상은 Field-emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM) (Hitachi, Japan)로 측정하였다. 실험용 샘플은 Silicon wafer 위에서 상온에서(20℃) 완전히 건조하였다.
DPNs가 분산되어있는 Colloid 상태의 수용액을 Bath type sonicator를 이용해 DPNs를 단일 입자로 만들어주고 측정하였다. 또한 Multisizer 4e (Beckman Coulter)를 통해 DPNs의 size distribution을 확인하였다.
크기와 모양을 분석하기 위해 SEM과 AFM을 사용하였다. SEM으로 측정된 지름은 446 nm, AFM은 526 nm이었다.
성능/효과
따라서 입자의 size distribution은 그림 3와 같이 500 nm 이하로 존재하는 형태가 된다. 500 nm 이상인 입자들은 main peak에 비해서 매우 작으며, 이들 또한 500 nm 입자가 뭉쳐 있는 형태로 예상되므로 PVA template 20판에서 약 2억 5천개의 입자가 생산되었음을 확인하였다(그림 3).
4 mV이므로 인체에 적용하기에 적합한 것으로 판단된다. DPNs의 Encapsulation Efficiency는 약 43.8 ± 6.6%로 Nano-precipitation과 같은 Bottom-up 방식보다 낮은 수치를 나타내었지만, 독성이 강한 Salinomycin을 사용함으로써 이를 해결할 수 있을 것으로 생각되며 적은 양의 약물만으로 항암효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 암세포와 함께 배양했을 때 형광 현미경으로 확인해본 결과 암세포 주변에 나노 입자가 이동한 것으로 보아 Targeting ligand나 Peptide, Aptamer를 이용하면 더욱 정확한 암세포 표적화를 이룰 수 있을 것으로 예상된다[15].
SCC7과 DPNs를 함께 배양한 결과 나노 입자의 세포 유입 경로는 정확히 분석되지 않았지만, 세포 표면에 붙어 있거나 Endocytosis를 통해 세포막 안으로 uptake 된 것으로 관찰되었다.
SEM과 AFM으로 관찰된 DPNs는 각각 약 446 nm, 526 nm의 지름을 가지는 것으로 나타났다. 이는 PVA template에 있는 나노 구멍과 유사한 크기이므로 DPNs의 생산이 성공적으로 이루어졌다는 것을 의미한다.
우리가 예상했던 DPNs의 지름은 약 500 nm였으며 이는 SEM과 AFM 영상, Size Distribution을 통해 기대했던 것과 유사한 크기를 가진다는 것을 확인하였다. 또한,Zeta potential은 약 −17.
67 µg이 들어가도록 DPNs를 MCF7 cell에 24시간 동안 적용을 하였을 때, 모든 경우에서 20% 이하로 세포가 사멸하였다(그림 5b). 이 데이터를 통해 Salinomycin이 매우 적은 양으로도 세포 사멸을 일으킬 수 있지만, Salinomycin이 DPNs에 들어가면 매우 느리게 방출되어, 24시간 동안 방출된 양으로는 충분한 세포 사멸을 일으키기에 부족하다는 것을 알 수 있다. 추가 실험을 통해 실제로 DPNs에 원하는 만큼의 Salinomycin이 들어갔는지 밝히고, 마찬가지로 그 양에 따라 viability test가 진행되었는지를 확인할 예정이다.
후속연구
PVA는 물을 머금게 되면 점성이 짙어지고, SEM의 영상을 얻기 위해서는 Sample을 건조해야 하는데, 이 과정에서 수용액 상태에 있던 DPNs와 PVA가 함께 가라앉아 이러한 결과가 발생한 것으로 생각된다. Bath type sonicator를 이용하여 약 5분간의 Sonication과 Centrifuge를 이용한 반복적인 Washing을 통해 이를 개선할 수 있을 것으로 생각된다.
암세포와 함께 배양했을 때 형광 현미경으로 확인해본 결과 암세포 주변에 나노 입자가 이동한 것으로 보아 Targeting ligand나 Peptide, Aptamer를 이용하면 더욱 정확한 암세포 표적화를 이룰 수 있을 것으로 예상된다[15]. DPNs의 Drug Carrier로서의 평가는 Loading Amount와 Drug Releasing Profile을 통해 추가로 검증을 할 예정이며, Cell viability를 실행하여 DPNs의 In vitro 항암 효과를 확인하고 In vivo 실험을 진행할 예정이다.
두 경우 모두 DPNs가 세포에 전달되어 영향을 미칠 수 있는 상태로 암세포 사멸을 위한 Drug carrier 역할을 할 수 있을 것으로 예상된다. 세포에 대한 입자의 endocytosis 또는 binding 여부는 추가로 confocal image를 통해 확인할 예정이다.
6%로 Nano-precipitation과 같은 Bottom-up 방식보다 낮은 수치를 나타내었지만, 독성이 강한 Salinomycin을 사용함으로써 이를 해결할 수 있을 것으로 생각되며 적은 양의 약물만으로 항암효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 암세포와 함께 배양했을 때 형광 현미경으로 확인해본 결과 암세포 주변에 나노 입자가 이동한 것으로 보아 Targeting ligand나 Peptide, Aptamer를 이용하면 더욱 정확한 암세포 표적화를 이룰 수 있을 것으로 예상된다[15]. DPNs의 Drug Carrier로서의 평가는 Loading Amount와 Drug Releasing Profile을 통해 추가로 검증을 할 예정이며, Cell viability를 실행하여 DPNs의 In vitro 항암 효과를 확인하고 In vivo 실험을 진행할 예정이다.
이 데이터를 통해 Salinomycin이 매우 적은 양으로도 세포 사멸을 일으킬 수 있지만, Salinomycin이 DPNs에 들어가면 매우 느리게 방출되어, 24시간 동안 방출된 양으로는 충분한 세포 사멸을 일으키기에 부족하다는 것을 알 수 있다. 추가 실험을 통해 실제로 DPNs에 원하는 만큼의 Salinomycin이 들어갔는지 밝히고, 마찬가지로 그 양에 따라 viability test가 진행되었는지를 확인할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
나노 입자를 암조직에 전달하는데 주로 어떤 것을 사용하였는가?
약물 운반체를 사용하는 방법은 기존의 항암제만을 투여한 경우보다 암조직 이외의 조직에 미치는 독성이 낮은 것으로 알려졌으나[3], 실질적으로 암조직에 축적되는 나노 입자의 양이 현저히 낮은 것으로 알려져 있다[4]. 나노 입자를 암조직에 전달하는데 주로 Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect를 사용해왔다. EPR effect란 solid tumor에서 발견되는 특이한 현상으로, 정상세포와는 다른 해부학적, 병리학적 특징을 가진다고 알려져 있다.
암의 발생률은 어떻게 되는가?
암의 발생률은 인구 10만 명당 445.7명 (2013년 기준)이며, 2014년 전체 사망자의 28.6%를 차지할 정도로 인간에게 가장 위협적인 질병 중 하나이다[1]. 항암제를 투여하거나 방사선을 이용하여 암을 치료하는 방법이 많이 사용되었지만, 부작용이 심하며, 암이 재발할 확률이 높다고 보고되었다.
암을 효과적으로 치료하기 위한 나노 크기의 약물 운반체 연구가 활발해야하는 이유는?
6%를 차지할 정도로 인간에게 가장 위협적인 질병 중 하나이다[1]. 항암제를 투여하거나 방사선을 이용하여 암을 치료하는 방법이 많이 사용되었지만, 부작용이 심하며, 암이 재발할 확률이 높다고 보고되었다. 따라서 효과적으로 치료하기 위해 학계에서 나노 크기의 약물 운반체를 사용하여 치료하는 기술을 활발히 연구하고 있다[2].
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